Καλλιέργειες

Louis Pasteur (1822-1895) Απέρριψε τη θεωρία περί «αυτόματου γενέσεως της ζωής» Μελέτησε τη ζύμωση της αλκοόλης από μικροοργανισμούς Αναγνώρισε τους μικροοργανισμούς ως αιτία νόσων Δημιούργησε τα πρώτα εμβόλια Ανακάλυψε την «παστερίωση» των υγρών

Μικροβιακή ανάπτυξη Φυσικές απαιτήσεις Χημικές απαιτήσεις Θερμοκρασία pH Ωσμωτική πίεση Χημικές απαιτήσεις

Θερμοκρασία Οι περισσότεροι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται στις ίδιες θερμοκρασίες που είναι ανεκτές και για τον άνθρωπο Ελάχιστη θερμοκρασία ανάπτυξης (χαμηλότερη θερμοκρασία ανάπτυξης στην οποία παρατηρείται ανάπτυξη ενός είδους) Μέγιστη θερμοκρασία ανάπτυξης (υψηλότερη θερμοκρασία στην οποία η ανάπτυξη είναι δυνατή) Βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης (η θερμοκρασία στην οποία αναπτύσσεται με μέγιστο ρυθμό) Ψυχρόφιλα (00C-150C-250C ή 00C-250C-400C) Μεσόφιλα (25-40 0C) Θερμόφιλα (50-60 0C)

pH Τα περισσότερα βακτήρια έχουν στενό εύρος pH κοντά στο ουδέτερο (6,5-7,5) Οι μύκητες έχουν μεγαλύτερο εύρος από τα βακτήρια, αλλά με βέλτιστο pH 5-6

Ωσμωτική πίεση Το νερό είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών Αποτελούνται από 80-90% από νερό Σε υπέρτονο περιβάλλον συμβαίνει ωσμωτική απώλεια νερού (πλασμόλυση) Τα περισσότερα μικρόβια είναι δυνητικώς αλόφιλα (δεν απαιτούν υψηλές συγκεντρώσεις άλατος και αναπτύσσονται σε συγκεντρώσεις άλατος μέχρι 2% )

Μικροβιακή ανάπτυξη Χημικές απαιτήσεις -Άνθρακας -Άζωτο, θείο και φώσφορος -Ιχνοστοιχεία -Οξυγόνο -Οργανικοί αυξητικοί παράγοντες

Ανάγκες σε οξυγόνο Υποχρεωτικώς αερόβιοι- απαιτούν οξυγόνο για να ζήσουν Δυνητικώς αναερόβιοι- χρησιμοποιούν το οξυγόνο όταν είναι παρόν αλλά συνεχίζουν την ανάπτυξη τους με ζύμωση ή αναερόβια αναπνοή Υποχρεωτικώς αναερόβια – η ανάπτυξη τους αναστέλλεται παρουσία οξυγόνου Μέτριας ευαισθησίας στο οξυγόνο (aerotolerant)- δεν μπορούν να χρησιμοποιήσουν το οξυγόνο για την ανάπτυξή τους, αλλά το ανέχονται αρκετά καλά Μικροαερόφιλα- αναπτύσσονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου (οξυγόνο ατμόσφαιρας 20%) Καπνόφιλα- αναπτύσσονται σε υψηλές συγκεντρώσεις CO2

Τα μικρόβια καλλιεργούνται σε: Τεχνητά θρεπτικά υλικά (βακτήρια, μύκητες, παράσιτα) Κυτταροκαλλιέργειες (βακτήρια, ιοί) Εμβρυοφόρα αβγά κότας (ιοί) Πειραματόζωα (βακτήρια, μύκητες, ιοί, παράσιτα) Στην καθημερινή μικροβιολογική εργαστηριακή πράξη χρησιμοποιείται μόνο η καλλιέργεια των βακτηρίων και των μυκήτων στα τεχνητά θρεπτικά υλικά

Ορισμοί Καλλιεργητικό υλικό: ένα θρεπτικό υλικό που προορίζεται για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών σε ένα εργαστήριο Ενοφθαλμισμός: η εισαγωγή μικροβίων σε ένα υλικό καλλιέργειας Καλλιέργημα: τα μικρόβια που αναπτύσσονται και πολλαπλασιάζονται σε ένα θρεπτικό υλικό

Τα τεχνητά θρεπτικά υλικά: Παρασκευάζονται στο Εργαστήριο ή αγοράζονται έτοιμα από το εμπόριο Περιέχουν θρεπτικές ουσίες και άλλους παράγοντες για τον συγκεκριμένο μικροοργανισμό που θέλουμε να καλλιεργήσουμε Περιέχει ικανοποιητική υγρασία, κατάλληλο pH, συγκέντρωση οξυγόνου Πρέπει να είναι αρχικώς αποστειρωμένο, ώστε να καλλιεργηθούν μόνο τα μικρόβια που προσθέτουμε Επώαση στην κατάλληλη θερμοκρασία

Ο ενοφθαλμισμός σε θρεπτικά υλικά σκοπό έχει: Την ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό των μικροβίων Την απομόνωση, το διαχωρισμό και την ταυτοποίηση εκείνων των ειδών που έχουν παθογόνο δράση

Τα καλλιεργητικά υλικά τοποθετούνται σε Δοκιμαστικούς σωλήνες, τοποθετούνται συνήθως υπό κλίση για να μεγιστοποιείται η επιφάνεια για την καλλιέργεια μικροβίων Σε τρυβλία Petri , ρηχά πιατάκια με καπάκι που αποτρέπει τις επιμολύνσεις

Κύρια συστατικά θρεπτικών υλικών Ι Πεπτόνες (πηγή ενέργειας, άνθρακα, αζώτου, θείου) μικρές αλυσίδες αμινοξέων που προέρχονται από μερική πέψη πρωτεïνών από οξέα ή ένζυμα Εκχυλίσματα κρέατος ή μυκήτων (πηγή βιταμινών, οργανικών αυξητικών παραγόντων) Σάκχαρα προστίθενται είτε ως τροφή για την ενίσχυση της ανάπτυξης των μικροβίων είτε για την μελέτη των μεταβολικών τους ιδιοτήτων Άγαρ και άλλες στερεωτικές ουσίες σύνθετος πολυσακχαρίτης που παράγεται από τα θαλάσσια φύκη Δεν αποτελεί τροφή για τα μικρόβια Λιώνει στους 800 C και πήζει στους 300 C

Κύρια συστατικά θρεπτικών υλικών ΙΙ Αναγωγικές ουσίες (θειογλυκολικό νάτριο, κυστεΐνη, ασκορβικό οξύ) Προστίθενται ως βοηθητικό στοιχείο για τη δημιουργία αναερόβιου περιβάλλοντος Εκλεκτικές ουσίες ή μίγματα (χρωστικές, άλατα, pH, αντιβιοτικά) Χρωματομετρικοί δείκτες Ουσίες που αλλάζουν χρώμα όταν μεταβληθεί το pH του διαλύματος που βρίσκονται Χρησιμοποιούνται για τη ρύθμιση του pH των θρεπτικών υλικών κατά την Παρασκευή τους, αλλά και σαν δείκτες μεταβολής του pH όταν τα μικρόβια αναπτύσσονται μέσα σε αυτά

Θρεπτικά υλικά διαφορετικής σύστασης Υγρά Θρεπτικά υλικά διαλυμένα σε νερό Στερεά Θρεπτικά υλικά διαλυμένα σε νερό και άγαρ σε αναλογία 1.5-2 % Ημίρρευστα θρεπτικά υλικά διαλυμένα σε απεσταγμένο νερό και άγαρ σε αναλογία 0.5%

Υγρά θρεπτικά υλικά Π.χ. θειογλυκολικός ζωμός, θρεπτικός ζωμός

Στερεά θρεπτικά υλικά Π.χ. αιματούχο άγαρ, σοκολατόχρωμο άγαρ, Thayer-Martin άγαρ, Mac Conkey, Muller Hinton

Θρεπτικά υλικά διαφορετικής σύνθεσης Εκλεκτικά θρεπτικά υλικά -Περιέχουν ουσίες που επιτρέπουν την ανάπτυξη ενός είδους βακτηρίου, ενώ ταυτόχρονα οι ίδιες ουσίες αναστέλλουν την ανάπτυξη άλλων ειδών βακτηρίων -διευκολύνεται η απομόνωση ενός συγκεκριμένου βακτηρίου Mac Conkey άγαρ (περιέχει χολικά άλατα, ανάπτυξη μόνο Gram (-) βακτηρίων Thayer Martin Columbia άγαρ

Εμπλουτισμένα θρεπτικά υλικά Περιέχουν τα συστατικά των κοινών θρεπτικών υλικών εμπλουτισμένα με αίμα, ορό αίματος, πρωτεΐνες, αμινοξέα ή σάκχαρα Αιματούχο άγαρ Σακχαρούχοι θρεπτικοί ζωμοί

Διαχωριστικά θρεπτικά υλικά Περιέχουν συστατικά (κυρίως σάκχαρα) που επιτρέπουν τον μακροσκοπικό διαχωρισμό των αποικιών ομάδων βακτηρίων Mac Conkey άγαρ(περιέχει λακτόζη) lac (+) Gram (-) κόκκινες αποικίες lac (-) Gram (-) άχρωμες αποικίες

McConkey agar Εκλεκτικό υλικό Περιέχει χολικά άλατα και κρυσταλλικό ιώδες, τα οποία αναστέλλουν την ανάπτυξη των Gram- θετικών μικροβίων Διαχωριστικό υλικό Περιέχει λακτόζη Μικρόβια που ζυμώνουν τη λακτόζη παράγουν οξύ, το οποίο μειώνει το pH και ο κόκκινος ουδέτερος δείκτης γίνεται ροζ. Τα χολικά άλατα γύρω από την αποικία επίσης μπορεί να καθιζάνουν δημιουργώντας μια ροζ άλω γύρω από τις αποικίες (lac+) Μικρόβια που δεν ζυμώνουν τη λακτόζη σχηματίζουν λευκές, άχρωμες αποικίες. (lac-)

Συντηρητικά θρεπτικά υλικά Περιέχουν ουσίες που επιτρέπουν την επιβίωση των μικροβιακών κυττάρων για μεγάλο χρονικό διάστημα

Εμπλουτισμός Χρησιμοποιούνται υγρά θρεπτικά υλικά που παρέχουν θρεπτικές ουσίες και περιβαλλοντικές συνθήκες που ευνοούν την ανάπτυξη ενός συγκεκριμένου μικροβίου π.χ. Selenite broth- αναστέλλει την ανάπτυξη των εντεροβακτηριακών και ευνοείται η ανάπτυξη της Salmonella spp

Αποστείρωση των θρεπτικών υλικών Καταστροφή ή απομάκρυνση των παθογόνων και σαπροφυτικών μικροοργανισμών και των σπόρων με μέσα Φυσικά (θερμότητα, υπεριώδης ακτινοβολία) Χημικά (φορμαλδεΰδη) Μηχανικά (διήθηση, υπέρηχοι)

Συνήθως… Αυτόκαυστο (θερμότητα) Κλίβανος υγρής αποστείρωσης 121 0C, 2atm, 15-20 min Καταστρέφονται όλοι οι μικροοργανισμοί και οι σπόροι

Επώαση στον κλίβανο στις κατάλληλες συνθήκες Αερόβια καλλιέργεια σε επωαστικό κλίβανο στους 370C για 18h Καλλιέργεια σε ατμόσφαιρα CO2 με κερί αναμμένο ή ειδικό σακουλάκι σε ειδικό δοχείο, το οποίο σβήνει μόνο του σε επωαστικό κλίβανο στους 370C για 18h Αναερόβια καλλιέργεια συνήθως με ειδικούς φακέλους GasPak σε δοχείο ή ειδικές σακούλες σε επωαστικό κλίβανο στους 370C για 18h

Ανάπτυξη βακτηριακών καλλιεργειών Bακτηριακή διαίρεση (απλή διχοτόμηση) Χρόνος γενεάς (χρόνος που απαιτείται για να διαιρεθεί ένα κύτταρο, χρόνος διπλασιασμού του πληθυσμού κυττάρων) Λογαριθμική αναπαράσταση των βακτηριακών πληθυσμών

Φάσεις ανάπτυξης Φάση καθυστέρησης Εκθετική φάση Φάση στασιμότητας Έντονη μεταβολική δραστηριότητα χωρίς πολλαπλασιασμό των κυττάρων Εκθετική φάση Έντονη κυτταρική αναπαραγωγή με τον υψηλότερο δυνατό ρυθμό υπό τις συγκεκριμένες συνθήκες Φάση στασιμότητας Επιβράδυνση ρυθμού αύξησης (πιθανώς λόγω εξάντλησης θρεπτικών στοιχείων, συσσώρευση προϊόντων αποβολής κα), ισορροπία μεταξύ του ρυθμού διαίρεσης και του ρυθμού θανάτου των κυττάρων Φάση θανάτου Ρυθμός θανάτου των κυττάρων είναι πολύ υψηλότερος από το ρυθμό δημιουργίας νέων κυττάρων

Μέτρηση μικροβιακής ανάπτυξης Μέτρηση αποικιών σε τρυβλίο Ο αριθμός των κυττάρων που σχηματίζουν τελικά αποικίες (Colony Forming Units) Διαδοχικές αραιώσεις Διάχυση των βακτηρίων σε τρυβλία Στρώση των βακτηρίων σε τρυβλία Μέθοδος διήθησης Άμεση μικροσκοπική καταμέτρηση

Μακροσκοπική εμφάνιση αποικιών Εξαρτάται από το στερεό θρεπτικό υλικό καλλιέργειας. Παρατηρούνται και περιγράφονται: 1. μέγεθος (πολύ μικρή, μικρή, μεγάλη) 2. σχήμα (κυκλική, ακτινοειδής, ριζοειδής) 3. ύψος (χαμηλή, επηρμένη, φουσκωτή, ομφαλωτή, με κοίλανση) 4. Χρώμα (άσπρη, γκρι, κίτρινη, ιριδίζουσα) 5. Περιφέρεια (περιγεγραμμένη, κυματοειδής, ερπύζουσα,δαντελωτή) 6. Σύσταση (βλεννώδης, ιξώδης) 7. Όψη επιφάνειας (ομαλή, πτυχωτή, γυαλιστερή, θαμπή)

Μεταβολές στο θρεπτικό υλικό 1. αιμόλυση α-αιμόλυση ή ατελής αιμόλυση β-αιμόλυση ή πλήρης αιμόλυση γ-αιμόλυση ή απουσία αιμόλυσης 2. Παραγωγή χρωστικής 3. Παραγωγή μυρωδιάς

Παραγωγή χρωστικής

Παραγωγή βλέννης

Ερπυσμός

Ταυτοποίηση Είναι η εκτέλεση του συνόλου εκείνων των βιοχημικών, μικροβιολοικών ή/και ορολογικών δοκιμασιών που οδηγούν στην αναγνώριση ενός βακτηρίου σε επίπεδο είδους άμεσο παρασκέυασμα- μικροσκόπηση νωπών ή χρωματισμένων παρασκευασμάτων Καλλιέργεια (συνήθως σε ένα θρεπτικό ζωμό- εμπλουτισμός, και στα στερεά θρεπτικά υλικά αιματούχο, σοκολατόχρωμο, Mc Conkey, Sabouraud άγαρ) Χημικές δοκιμασίες (καταλάση, πηκτάση, οξειδάση, οπτοκίνης, βακιτρακίνης) Βιοχημικές δοκιμασίες Χρήση αντιορών Αντιβιόγραμμα

Καταλάση Ένζυμο που μετατρέπει το υπεροξείδιο του υδρογόνου, το οποίο είναι τοξικό, σε νερό και οξυγόνο Βρίσκεται σχεδόν σε όλα τα αερόβια και προαιρετικώς αναερόβια βακτήρια που έχουν κυττοχρώματα Μικροοργανισμοί που δεν έχουν κυττοχρώματα συνήθως δεν παράγουν καταλάση π.χ. Streptococcus spp Όταν μια σταγόνα υπεροξειδίου του υδρογόνου προστεθεί σε μια αποικία βακτηριακών κυττάρων που παράγουν καταλάση, απελευθερώνονται φυσαλίδες οξυγόνου

Πηκτάση-κοαγκουλάση Ένζυμο με ιδιότητα να προκαλεί πήξη του πλάσματος του αίματος (συνδέεται με μια σφαιρίνη του πλάσματος) Ελεύθερη κοαγκουλάση (απελευθερώνεται από το μικροβιακό κύτταρο στο υλικό καλλιέργειας) Συνδεδεμένη κοαγκουλάση (προσκολλημένη στην επιφάνεια του μικροβιακού κυττάρου) Χαρακτηριστική ιδιότητα των στελεχών του είδους S.aureus

Οξειδάση Ένζυμα που καταλύουν την οξείδωση του κυτοχρώματος C με μοριακό οξυγόνο ως τελικό δέκτη ηλεκτρονίων Ο έλεγχος παραγωγής οξειδάσης γίνεται με αρωματικές αμίνες, οι οποίες είναι άχρωμες ουσίες στην ανηγμένη τους μορφή και όταν οξειδωθούν μετατρέπονται σε χρωστικά παράγωγα

Δοκιμασία οπτοχίνης

Καθαρές καλλιέργειες μικροβίων…Πώς; Αποικία- προκύπτει από ένα σπόριο, μια βλαστική μορφή ή μικρό αριθμό μικροοργανισμών που συνδέονται σχηματίζοντας αλυσίδες ή ομάδες Έχουν εμφάνιση χαρακτηριστική του είδους Η επίστρωση πρέπει να γίνει με τέτοιο τρόπο ώστε οι αποικίες να μην αλληλοκαλύπτονται

Ενοφθαλμισμός σε θρεπτικό υλικό

Ποσοτική καλλιέργεια

Μονοκαλλιέργημα

Βιοχημική ταυτοποίηση API kits Enterotube Vitek Phoenix Maldi TOF