ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ – ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Αλίνα Πανταζή Αθήνα 2004 ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΦΥΣΙΚΩΝ ΦΟΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΟΥ ΕΜΜΗΝΟΥ ΚΥΚΛΟΥ ΓΥΝΑΙΚΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑΣ ΡΟΗΣ Διατμηματικό Μεταπτυχιακό Δίπλωμα στην Ιατρική Βιολογία της Σχολής Επαγγελμάτων Υγείας & Πρόνοιας - Τμήματος Ιατρικής και της Σχολής Θετικών Επιστημών - Τμήματος Βιολογίας Εκπονήθηκε στο Γ.Π.Ν.-Μ. «ΕΛΕΝΑ ΒΕΝΙΖΕΛΟΥ»

Σκοπός της έρευνας  Πιθανή διακύμανση αριθμού και «τοξικής δράσης» ΝΚ κυττάρων στον έμμηνο κύκλο Μελέτη ποσοστών ΝΚ και ΝΚ-ΙFN-γ+ - Έμμεση ορμονική συσχέτιση  Πιθανή μεταβολή τοξικής δράσης των ΝΚ Συσχέτιση ποσοστών ΝΚ και ΝΚ-ΙFN-γ+ κυττάρων σε κάθε φάση  Προγνωστικός δείκτης !  Ανεπάρκεια ερευνών & δημοσιεύσεων

Θεωρητικό υπόβαθρο  Παράγοντες που επηρεάζουν τα ΝΚ  Στροφή προς Th2-τύπο ανοσοαπόκρισης, κατά την κύηση  Μειωμένη κυτταροτοξικότητα των ΝΚ κατά την κύηση  Αυξημένος αριθμός ΝΚ κυττάρων σε γυναίκες με επανειλημμένες αυτόματες αποβολές (ΕΑΑ) - δείκτης πρόγνωσης

Σχεδιασμός - Υλοποίηση  Προτυποποίηση μεθόδου Προτυποποίηση μεθόδου  Επιλογή του Δείγματος Επιλογή του Δείγματος  Επεξεργασία δειγμάτων Κυτταρομετρία ροής Επεξεργασία δειγμάτων Κυτταρομετρία ροής  Επιλογή Στατιστικής ανάλυσης Επιλογή Στατιστικής ανάλυσης

Προτυποποίηση  Δείγματα περιφερικού αίματος 1. Φυσιολογικά δείγματα γυναικών 2. Παθολογικά (αποβολών)  Δείκτες 1. Επιφανειακοί CD3- CD16/ Ενεργοποίησης CD69  Συνθήκες 1. Επώαση 5 ώρες 2. Φυγοκέντρηση 500g Επιστροφή

30 γυναίκες 30 γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας (μέση ηλικία 31 ± 6 έτη) Ερωτηματολόγιο προσωπικών στοιχείων Κριτήρια επιλογής: Κριτήρια επιλογής: 1. έλλειψη προβλημάτων υπογονιμότητας 2. μη λήψη αντισυλληπτικών ή ορμονών 3. απουσία λοίμωξης 2 δείγματα αίματος 2 δείγματα αίματος Ωοθυλακική: 7η-12η ημέρα κύκλου Ωχρινική: 18η-25η ημέρα κύκλου Περιπτώσεις Μελέτης

Επεξεργασία δειγμάτων Επιστροφή σχεδιασμό - υλοποίηση  Ανοσοφαινοτυπική ανάλυση Επιφανειακή χρώση λευκοκυττάρων Επιλογή (CD3-CD16+CD56+) Προσδιορισμός αριθμού και % ποσοστού των ΝΚ  Ανίχνευση κυτταροκίνης Επιλογή (CD3-CD16/CD56+ΙFN-γ+) Προσδιορισμός ποσοστού ΝΚ που συνθέτουν IFN-γ

Ανοσοφαινότυπος  Επιφανειακή χ με anti-CD3FITC, anti-CD16 / 56RD1  Επιφανειακή χρώση με anti-CD3FITC, anti-CD16 / 56RD1 Επιστροφή επεξεργασία δειγμάτων

Ανίχνευση IFN-γ 1. Ενεργοποίηση κύτταρα ολικού αίματος ενεργοποιούνται in vitro με phorbol 12-mystrate 13-acetate (PMA) and ιonomycin παρουσία Brefeldin–A (BFA) (επώαση: 5 ώρες)

Εξωκυττάρια χρώση - Λύση ερυθροκυττάρων 2. Eπιφανειακή χρώση λευκοκυττάρων με anti-CD3FITC, anti-CD16 / 56PC5 μονοκλωνικών αντισωμάτων για την εντόπιση των ΝΚ (επώαση: 15 min) 3. Λύση ερυθρών Η απομάκρυνση των ερυθρών αιμοσφαιρίων έγινε με τη βοήθεια ειδικού λυτικού διαλύματος (επώαση: 10 min)

Διαπερατοποίηση λευκοκυττάρων – Ενδοκυττάρια χρώση 4. Διαπερατοποίηση Τα λευκά αιμοσφαίρια γίνονται διαπερατά με τη βοήθεια ειδικού διαλύματος διαπερατοποίησης (επώαση: 10 min) 5. Ενδοκυττάρια χρώση Η σήμανση των λ ευκών αιμοσφαιρίων γίνεται με μονοκλωνικό αντίσωμα anti-Hu-IFN-γPE ενδοκυττάρια εντόπιση anti-Hu-IFN-γPE για την ενδοκυττάρια εντόπιση της κυτταροκίνης (επώαση: 30 min)

Κυτταρομετρία ροής 3 χρωμάτων Επιστροφή επεξεργασία δειγμάτων

Στατιστική ανάλυση  Δεδομένα μετρήσεων Δεδομένα μετρήσεων  Παρουσίαση στοιχείων ανάλυσης Παρουσίαση στοιχείων ανάλυσης  Wilcoxon – Mann-Whitney έλεγχος τιμών μεταβλητών κατά ζεύγη. Η μηδενική υπόθεση είναι ότι οι πληθυσμοί από τους οποίους προέρχονται τα δείγματα ακολουθούν την ίδια κατανομή. Συνέχεια

Στοιχεία της ανάλυσης  Μεταβολή ποσοστού ΝΚ στις δύο φάσεις του κύκλου Μεταβολή ποσοστού ΝΚ στις δύο φάσεις του κύκλου Επιστροφή  Μεταβολή ποσοστού ΝΚ-ΙFN- γ+ κυττάρων στις δύο φάσεις Μεταβολή ποσοστού ΝΚ-ΙFN- γ+ κυττάρων στις δύο φάσεις Ωοθυλακική 9,76 ± 4,57 Ωχρινική 10,61 ± 5,11 Ωοθυλακική 7,30 ± 6,77 Ωχρινική 6,48 ± 7,90

Περιγραφικά Στοιχεία ΝΚ Επιστροφή

Περιγραφικά Στοιχεία ΙFN-γ Επιστροφή στοιχεία ανάλυσης

Μεταβολές ανά Περίπτωση Μεταβολή ποσοστού ΝΚ Μεταβολή ποσοστού ΝΚ που συνθέτει IFN-γ Επιστροφή αποτελέσματα

Σχέση των μεταβλητών  Σύγκριση ποσοστών ΝΚ κυττάρων και όσων εκφράζουν IFN-γ, στις δύο φάσεις.  Συσχέτιση των δύο μεταβλητών στις δύο φάσεις του κύκλου. Επιστροφή αποτελέσματα Ωοθυλακική φάση Ωχρινική φάση

Αποτελέσματα ( Ι )  Καμία στατιστικά σημαντική διαφορά των ζευγών των μεταβλητών, σε επίπεδο σημαντικότητας 0.05 (p>0.05, ΝΚ: z=-0.519, IFN-γ: z=-0.378)  Αύξηση ποσοστού NK κυττάρων στην ωχρινική φάση (10.61±5.11 vs 9.76±4.57)  Ελάττωση ποσοστού NK κυττάρων που συνθέτουν ΙFN-γ στην ωχρινική φάση (6.48±7.90 vs 7.30±6.77) Συνέχεια

Αποτελέσματα ( ΙΙ )  Συσχέτιση μεταβλητών NK και ΙFN-γ 1. ωοθυλακικής φάσης R 2 = 0,11 θετική συσχέτιση 2. ωχρινικής φάσης R 2 = 0,04 αρνητική συσχέτιση **  Σε μεμονωμένες περιπτώσεις η αύξηση αριθμό ΝΚ κυττάρων στην ωχρινική φάση συσχετίζεται με μείωση της δυνατότητας παραγωγής IFN-γ. **

Συμπεράσματα - Σχόλια  Δε βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στα ποσοστά των NK κυττάρων του περιφερικού αίματος, ούτε στο «τοξικό δυναμικό» τους ανάμεσα στις δύο φάσεις του έμμηνου κύκλου.

Τh2–τύπου απόκριση στην ωχρινική φάση;  Σε μεμονωμένες περιπτώσεις η αύξηση των ΝΚ στην ωχρινική φάση συνοδευόταν από ελάττωση σύνθεσης IFN-γ. Η παρατήρηση αυτή μπορεί να θεωρηθεί ως τάση ελάττωσης της ΝΚ κυτταροτοξικότητας στην ωχρινική φάση, στο πλαίσιο προετοιμασίας του γυναικείου οργανισμού για ευνοϊκή αποδοχή κύησης.

Προεκτάσεις  Το προκαταρκτικό εύρημα χρήζει διερεύνησης με α) αύξηση δείγματος β) μελέτη γυναικών με προβλήματα εμφύτευσης πριν ξεκινήσει ευρέως η μέτρηση των ΝΚ κυττάρων στις δύο φάσεις του έμμηνου κύκλου σε περιπτώσεις γυναικών με ΕΑΑ, όπου πληθυσμός και η δραστικότητα των ΝΚ κυττάρων αξιολογούνται για την πιθανότητα επικείμενης αποβολής. Επιστροφή στην Αρχική