Σύμφωνα με την European Federation of Biotechnology… http://www.efb-central.org/ Η Βιοτεχνολογία είναι ο διεπιστημονικός κλάδος που αφορά στην αξιοποίηση των κυττάρων (μικροβιακών, ζωϊκών, φυτικών), των συστατικών τους (ενζύμων) ή/και ολόκληρων οργανισμών με στόχο την παραγωγή προϊόντων, αγαθών και στην προσφορά υπηρεσιών. 1

Applied Biocatalysis & Biotransformations The research activities of the laboratory are focused on the field of the  Applied Biocatalysis & Biotransformations Enzyme amd Microbial technology and Nanobiotechnology. Carbon source Biofuels Biomass Biochemicals Drugs Food additives waste

•  Ανάπτυξη βιοδιεργασιών με ένζυμα, ενζυμικά συστήματα, μικροβιακά κύτταρα  και μικροφύκη για την παραγωγή βιοδραστικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας (φάρμακα, τρόφιμα βιοκαύσιμα και βιοϋλικά) •  Ανάπτυξη ακινητοποιημένων ενζυμικών συστημάτων και νανο- βιοκαταλυτικών (βιοκαταλυτικές μετατροπές, παραγωγή βιοκαυσίμων και ενέργειας, κατασκευή βιοαισθητήρων και βιοϋλικών).

Παραγωγή, κλωνοποίηση-υπερέκφραση, χαρακτηρισμός, μελέτη δομής και λειτουργίας ενζύμων. Βελτίωση των ιδιοτήτων των ενζύμων με τεχνικές της ενζυμικής μηχανικής και της μηχανικής του μέσου. Διερεύνηση της σχέσης δομής και λειτουργίας και μηχανισμού δράσης ενζύμων σε μη υδατοσυμβατά συστήματα, οργανωμένες νανοδομές και νανοδιασπορές καθώς και νανο-υλικά.   Ανάπτυξη συστημάτων στοχευμένης μεταφοράς φαρμάκων, βιοδραστικών μορίων και άλλων βιομορίων με τη χρήση τροποποιημένων νανοϋλικών και οργανωμένων νανοδομών.

Η ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΕΧΕΙ ΤΕΣΣΕΡΙΣ ΔΙΑΚΡΙΤΟΥΣ ΚΛΑΔΟΥΣ ΣΕ ΧΡΩΜΑΤΑ Η ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΕΧΕΙ ΤΕΣΣΕΡΙΣ ΔΙΑΚΡΙΤΟΥΣ ΚΛΑΔΟΥΣ ΣΕ ΧΡΩΜΑΤΑ Ausblick | 9 BIOTECHNOLOGIE UND MEER 9-1 Anwendungen der marinen Biotechnologie Λευκή Βιοτεχνολογία: Χρήση βιολογικών συστημάτων για αντικατάσταση της παραδοσιακής χημείας (ζυμώσεις-βιοκατάλυση, συνθετική βιολογία/ βιοτεχνολογία) Κόκκινη Βιοτεχνολογία: Χρήση βιοδιεργασιών για την πηρεσιών παραγωγή προϊόντων και υπηρεσιών ιατρικών εφαρμογών Πράσινη Βιοτεχνολογία: Χρήση βιοδιεργασιών για την παραγωγή προϊόντων αγροτικών εφαρμογών Μπλέ Βιοτεχνολογία: Χρήση βιοδιεργασιών για την αξιοποίηση πρώτων υλών από τον θαλάσσιο οικοσύστημα για την παραγωγή προϊόντων βιοενδιαφέροντος

Πωλήσεις βιοφαρμακευτικών προϊόντων το 2015 (εκτίμηση). ΠΡΟΪΟΝ ΕΝΔΕΙΞΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΠΩΛΗΣΕΙΣ (εκ US$) Aranesp & Epogen, (Ερυθροποιητίνη) Aναιμία ΑΜGEN >5000 Neulasta & Neupogen, (Ερυθροποιητίνη) >4000 Procrit/Eprix (Ερυθροποιητίνη)   Johnson & Johnson >6000 Avonex (Iντερφερόνη-β) Σκλήρυνση κατά πλάκας Βiogen >2000 Rituxan Herceptin (Μονοκλωνικά αντισώματα) Λέμφωμα Καρκίνος του στήθους Genentech >1000 Humulin Humalog (Ινσουλίνη) Διαβήτης Lilly

Διαδικασία σύνθεσης της βιταμίνης Β2 Produkte | 4 KLEINE MOLEKÜLE – GROSSE BEDEUTUNG 4-3 Die Verfahren der Vitamin B2-Synthese Kλασσικές μέθοδοι: Χημικές διαδικασίες (9 βήματα) Μοντέρνες μέθοδοι Bιοτεχνολογικές διαδικασίες Γλυκόζη K-Aραβονικό Ca-Aραβονικό Ca-Ραβονικό Βιταμίνη B2 Bιομάζα Θετικά Αύξηση όγκου παραγωγής 40% κόστος παραγωγής 30% λιγότερες εκπομπές CO2 60% λιγότερη χρήση πρώτων υλών 95% λιγότερα απόβλητα Ριβονιλακτόνη Ριβόζη Ριβιτυλχιλιδίνη Βιταμίνη B2

NEΕΣ ΛΥΣΕΙΣ ΣΕ ΠΑΛΙΑ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ Biotechnology Industry Organization (BIO) ΗΠΑ : 1000 εταιρίες 1.6 εκατ εργαζόμενοι https://www.bio.org/ EuropaBio www.europabio.org/ Στην Ευρώπη 2000 εταιρείες δραστηριοποιούνται στο πεδίο της Βιοτεχνολογίας

11

Είναι δυνατή η ρύθμιση; Ποια μεταβολικά μονοπάτια είναι ενεργοποιημένα σε συγκεκριμένες συνθήκες; Ποιος ο βαθμός ανάμιξης του κάθε μεταβολικού μονοπατιού στη συνολική μεταβολική διαδικασία; Είναι δυνατή η ρύθμιση; 12

Μεταβολική οδός (δρόμος, μονοπάτι, pathway) Κάθε αλληλουχία εφικτών βιοχημικών αντιδράσεων που είναι δυνατόν να παρατηρηθεί & οι οποίες συνδέουν ένα καθορισμένο σύνολο εισερχόμενων και εξερχόμενων μεταβολιτών. Ρύθμιση της ενζυμικής δραστικότητας Ρύθμιση της ποσότητας των ενζύμων 13

Ρύθμιση της ενζυμικής δραστικότητας ΑΒΓΡ Η πρώτη μη αντιστρεπτή αντίδραση (καθοριστικό βήμα) είναι συνήθως ένα σημαντικό σημείο ελέγχου (ΕΠΑΝΑΤΡΟΦΟΔΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ). Τα ένζυμα που καταλύουν τα καθοριστικά βήματα είναι δυνατό να ρυθμίζονται : Επανατροφοδοτική αναστολή (αναδραστική αναστολή) Αναστολή από το προϊόν Oμοιοπολική ρύθμιση 14

ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΣΤΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ 15

1) Εύκαμπτοι κόμβοι. Οι κόμβοι αυτοί χαρακτηρίζονται από ένζυμα που συναγωνίζονται για το ίδιο υπόστρωμα, τα οποία επιδεικνύουν παρόμοια συγγένεια για αυτό, ενώ οι αντιδράσεις εξελίσσονται με παρόμοιες ταχύτητες. Οι κόμβοι αυτοί δεν επιδεικνύουν ευαισθησία σε ρύθμιση. E1 E2

2) Μερικώς άκαμπτοι κόμβοι 2) Μερικώς άκαμπτοι κόμβοι. Η κατανομή της ροής στους κόμβους αυτούς είναι μετατοπισμένη προς τον ένα κλάδο. Το ένζυμο του κλάδου αυτού χαρακτηρίζεται από υψηλή ειδική δραστικότητα ή/και μεγάλη εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα δίχως να αναστέλλεται επανατροφοδοτικά. Οι κόμβοι αυτοί είναι μερικώς ευαίσθητοι σε ρύθμιση. E1 E2

3) Άκαμπτοι κόμβοι. Εμφανίζουν μεγάλη ευαισθησία σε ρύθμιση 3) Άκαμπτοι κόμβοι. Εμφανίζουν μεγάλη ευαισθησία σε ρύθμιση. Η κατανομή της ροής ελέγχεται ισχυρά σε έναν ή περισσότερους κλάδους του κόμβου. Ο έλεγχος αυτός επιτυγχάνεται με συνδυασμό του επανατροφοδοτικού ελέγχου και της ενεργοποίησης των ενζύμων από μεταβολίτες του ανταγωνιστικού κλάδου. Κάθε μεταβολικό προϊόν δρα ως ενεργοποιητής του ανταγωνιστικού κλάδου αλλά και ως αναστολέας του σχηματισμού του.  

Χειραγώγηση του μεταβολισμού METABOΛIKH MHXANIKH Μetabolic Engineering Βασικός στόχος: Γενικευμένος έλεγχος (ρύθμιση) και κατευθυνόμενη τροποποίηση των μεταβολικών οδών (metabolic pathways) Χειραγώγηση του μεταβολισμού 19

Mεταβολική ροή J (Metabolic Flux) H μεταβολική ροή είναι ο ρυθμός με τον οποίο οι εισερχόμενοι μεταβολίτες μετατρέπονται σε εξερχόμενους μεταβολίτες η ταχύτητα με την οποία η ύλη μετατρέπεται διαμέσου μιας μεταβολικής οδού. 20

Σημεία διακλάδωσης (κομβικά σημεία) Η απόδοση σε κάποιο προϊόν είναι συνάρτηση του λόγου των ροών στα σημεία διακλάδωσης (κομβικά σημεία ) Ο λόγος των ροών σε μερικά μόνο κομβικά σημεία επιδρά στην απόδοση του προϊόντος  Κύρια κομβικά σημεία.

Σταθερή κατάσταση (δυναμική ισορροπία). Η ροή J είναι ίση με τις ταχύτητες των μεμονωμένων αντιδράσεων στη σταθερή κατάσταση (steady state). Στη σταθερή κατάσταση η συγκέντρωση όλων των μεταβολιτών (Α,Α1,Α2,...... Β) παραμένει σταθερή Οι συγκεντρώσεις των ενδιάμεσων μεταβολιτών λαμβάνουν τιμές τέτοιες ώστε οι ταχύτητες όλων των αντιδράσεων γίνουν ίσες (v1 = v2 = v3 = … = vi). 23

S  Χ  P Ε1 Ε2 Η σταθερή κατάσταση καθορίζεται από τις παραμέτρους του συστήματος [S], [P], E1,E2 Κάθε σταθερή κατάσταση αντιστοιχεί σε συγκεκριμένες τιμές μεταβλητών  συγκέντρωση ενδιάμεσου μεταβολίτη CX, και της ροής J 24

S  Χ  P Ε1 Ε2 Aν οι τιμές των παραμέτρων αλλάξουν τότε το σύστημα θα μετακινηθεί σε μια νέα σταθερή κατάσταση η οποία θα χαρακτηρίζεται από άλλες τιμές των μεταβλητών (CX, J). 25

Η μεθοδολογία για τον προσδιορισμό των μεταβολικών ροών είναι γνωστή ως Aνάλυση των Μεταβολικών Ροών (metabolic flux analysis, MFA)

Στόχος της ΑΜΡ είναι η κατασκευή του χάρτη των μεταβολικών ροών (metabolic flux map) Ο χάρτης αναπαραστά τις βιοχημικές αντιδράσεις του μεταβολικού δικτύου και δίνει μια εκτίμηση της ταχύτητας (δηλαδή της ροής) στη σταθερή κατάσταση (steady state) με την οποία κάθε αντίδραση συμμετέχει 27

Μεταβολικός χάρτης για την αναερόβια ανάπτυξη του S. cerevisae 28

Ο χάρτης των μεταβολικών ροών Α) Πληροφορεί για τη συνεισφορά των μεταβολικών οδών σε μια μεταβολική διεργασία . Β) Αποτυπώνει τις διαφορές των μεταβολικών ροών που παρατηρούνται είτε σε διαφορετικά στελέχη είτε κάτω από διαφορετικές συνθήκες οπότε αξιολογούνται συγκριτικά.

Βασικές αρχές Ο προσδιορισμός των ενδοκυτταρικών ροών βασίζεται στην εφαρμογή: στοιχειομετρικών μοντέλων (stoichiometric models) για τις κυριότερες ενδοκυτταρικές αντιδράσεις ισοζυγίων μάζας (mass balances) γύρω από τους ενδοκυτταρικούς μεταβολίτες 30

ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ – ΒΑΘΜΟΙ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑΣ ►P o αριθμός των συνολικών μεταβολιτών που εμπλέκονται στο μεταβολικό σύστημα, Ρ=4 ►J o αριθμός των ροών J=3 ► Κ ο αριθμός των ενδιάμεσων μεταβολιτών στη σταθερή κατάσταση, Κ=1 (αριθμός ισοζυγίων που μπορούμε να γράψουμε) ►F=J-K o βαθμός ελευθερίας του συστήματος. Ο αριθμός των ταχυτήτων που θα πρέπει να μετρηθούν F=3-1=2 31

F o βαθμός ελευθερίας του συστήματος (F=J-K) Κ ο αριθμός των ενδιάμεσων μεταβολιτών (στη σταθερή κατάσταση) και J o αριθμός των ροών Ανάλογα με τον αριθμό των ροών Μ που μπορούν να μετρηθούν διακρίνονται οι ακόλουθες περιπτώσεις για το σύστημα: F=M: Το σύστημα είναι ορισμένο και έχει μοναδική λύση FM: Το σύστημα είναι αόριστο και για να βρεθεί λύση πρέπει να τεθούν νέοι περιορισμοί ή κάποιο κριτήριο βελτιστοποίησης FM: Το σύστημα είναι υπερορισμένο και οι επιπλέον μετρήσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν για επιβεβαίωση 32

Ανάλυση μεταβολικής ροής από τον μικροοργανισμό Candida lipolytica v2-v4-v5 33

6-φωσφορική γλυκόζη: v1 – (v2/2) - v3 = 0 (1) εξισώσεις ισοζυγίων 6-φωσφορική γλυκόζη: v1 – (v2/2) - v3 = 0 (1) Πυροσταφυλικό: v2 – v4 – v5 = 0 (2) AcCoA: v4 – v6 – v13 – v14 = 0 (3) Κιτρικό: v6 – v7 – v17 = 0 (4) Ισοκιτρικό: v7 – v8 – v12 – v18 = 0 (5) α-Κετογλουταρικό: v8 – v9 – v15 = 0 (6) Ηλεκτρικό: v9 – v10 + v12 = 0 (7) Μηλικό: v10 – v11 + v13 = 0 (8) Γλυοξυλικό: v12 - v13 = 0 (9) Οξαλοξικό: v5 + v11 – v6 = 0 (10) CO2 : v4 + v8 + v9 – v16 = 0 (11) Πόσες ροές πρέπει να μετρηθούν για να είναι το σύστημα ορισμένο; Tο μοντέλο περιγράφεται με 18 διαφορετικές αντιδράσεις και 11 εξισώσεις ισοζυγίων γεγονός που συνεπάγεται την παρουσία 7 βαθμών ελευθερίας. Κατά συνέπεια, αν προσδιορισθούν 7 εκ των ταχυτήτων των αντιδράσεων τότε είναι δυνατός ο υπολογισμός και των υπολοίπων 34

= r = TT v TT στοιχειομετρικός πίνακας Αντιδράσεις (18) Εξισώσεις ισοζυγίων (11) TT στοιχειομετρικός πίνακας 1 -0.5 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 -1 0 0 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 = v 6-φωσφορική γλυκόζη: v1 – (v2/2) - v3 = 0 (1) Πυροσταφυλικό: v2 – v4 – v5 = 0 (2) AcCoA: v4 – v6 – v13 – v14 = 0 (3) Κιτρικό: v6 – v7 – v17 = 0 (4) Ισοκιτρικό: v7 – v8 – v12 – v18 = 0 (5) α-Κετογλουταρικό: v8 – v9 – v15 = 0 (6) Ηλεκτρικό: v9 – v10 + v12 = 0 (7) Μηλικό: v10 – v11 + v13 = 0 (8) Γλυοξυλικό: v12 - v13 = 0 (9) Οξαλοξικό: v5 + v11 – v6 = 0 (10) CO2 : v4 + v8 + v9 – v16 = 0 (11) 35

Ανάλυση του Μεταβολικού Ελέγχου ΑΜΕ (Μetabolic Control Analysis) Mε την ΑΜΕ προσδιορίζουμε το σχετικό έλεγχο (ρύθμιση) που ασκείται από κάθε βήμα της μεταβολικής οδού στις διάφορες μεταβλητές του συστήματος (ροές, συγκεντρώσεις μεταβολιτών)

η ΑΜΕ δεν βασίζεται στα ρυθμοκαθοριστικά ένζυμα θεωρεί ότι ο έλεγχος ροής κατανέμεται ποσοτικά σε όλα τα ένζυμα που συμμετέχουν στο μεταβολικό δρόμο.

ΟΙ ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΕΣ ΕΛΕΓΧΟΥ ΟΙ ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΕΣ ΕΛΕΓΧΟΥ Η συσχέτιση των μεταβλητών ενός μεταβολικού συστήματος με τις παραμέτρους περιγράφεται με την βοήθεια των συντελεστών ελέγχου (control coefficients) Ο συντελεστής ελέγχου αποτελεί ένα σχετικό μέτρο του ύψους της επίδρασης που έχει η διαταραχή μιας παραμέτρου στη μεταβλητή του συστήματος. 38

Συντελεστής ελέγχου ροής (flux control coefficients) CJ Ο συντελεστής ελέγχου ροής εκφράζει την επίδραση της μεταβολής της δραστικότητα/ συγκέντρωσης του ενζύμου στη μεταβολική ροή Mια πολύ μικρή μεταβολή στη δραστικότητα ενός ενζύμου E θα αλλάξει τη ροή J (στη σταθερή κατάσταση) 39

ΤΟ ΑΘΡΟΙΣΤΙΚΟ ΘΕΩΡΗΜΑ E1 E2 E3 E4 ABCD …P Αν ληφθούν υπόψη όλα τα ένζυμα τα οποία επιδρούν σε μια συγκεκριμένη μεταβολική ροή σε ένα κύτταρο ή σε ένα σύστημα, τότε το άθροισμα των συντελεστών ροής κάθε ενζυμικής αντίδρασης ισούται με 1: C1J+ C2J+ C3J…+ CnJ = 1 40

C1J+ C2J+ C3J…+ CnJ = 1 Η αύξηση κάποιων συντελεστών ροής συνοδεύεται από μείωση άλλων συντελεστών ώστε το συνολικό άθροισμα να διατηρείται σταθερό και ίσο με 1. Ο έλεγχος (ρύθμιση) αποτελεί ιδιότητα του συστήματος που μοιράζεται σε όλα τα επιμέρους βήματα.  ‘Ολα τα ένζυμα σε ένα μεταβολικό δρόμο μοιράζονται τον έλεγχο της ροής. 41

Σε διακλαδιζόμενους μεταβολικούς δρόμους η τιμή του συντελεστή CJ μπορεί να είναι και αρνητική. E1 Β Α Γ E2 H αύξηση της δραστικότητας Ε στον ένα κλάδο επιφέρει αύξηση της ροής στον κλάδο αυτό γεγονός που οδηγεί σε μείωση της ροής στον άλλο κλάδο 42

Συντελεστής ελαστικότητας (elasticity coefficient) Περιγράφει την επίδραση του μεταβολίτη S στην ταχύτητα v μιας αντίδρασης που καταλύεται από το ένζυμο Ε σε συνθήκες τέτοιες ώστε όλοι οι υπόλοιποι παράγοντες που επιδρούν στο ένζυμο Ε να παραμένουν σταθεροί 43

ΤΟ ΘΕΩΡΗΜΑ ΣΥΝΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Συσχετίζει τους συντελεστές ελέγχου ροής και τους συντελεστές ελαστικότητας των επιμέρους βημάτων i j k S-ενδιάμεσος μεταβολίτης i,j και k -ένζυμα ΑΒSC Για ένα κοινό μεταβολίτη S ισχύει 44

S  Χ  P Ε1 Ε2 Mεγάλες τιμές ελαστικότητας συνδέονται με μικρές τιμές συντελεστών ελέγχου ροής και αντίστροφα 45

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΩΝ ΕΛΕΓΧΟΥ Άμεσες μέθοδοι - οι συντελεστές ελέγχου ροής προσδιορίζονται άμεσα με μετρήσεις της μεταβολής της ροής μετά από μικρή αλλά μετρήσιμη αλλαγή της ενζυμικής δραστικότητας. Έμμεσες μέθοδοι - προσδιορίζονται οι συντελεστές ελαστικότητας και στη συνέχεια οι συντελεστές ελέγχου υπολογίζονται από τα θεωρήματα της ΑΜΕ. Θεώρημα συνεκτικότητας Μέθοδοι όπου οι συντελεστές ελέγχου προσδιορίζονται μέσω μετρήσεων των συγκεντρώσεων των ενδιάμεσων μεταβολιτών. 46

Η τροποποίηση της ενζυμικής δραστικότητας μπορεί να γίνει: με τροποποίηση σε γενετικό επίπεδο με τροποποίηση μέσω επαγωγέων ή διαιτητικών και περιβαλλοντικών μέσων, με τιτλοδότηση με καθαρό (απομονωμένο) ένζυμο με τιτλοδότηση του ενζύμου με ειδικούς αναστολείς. οι αλλαγές αυτές μπορεί να αυξάνουν ή και να μειώνουν την ενζυμική δραστικότητα. 47

Η ρύθμιση της ποσότητας ενός ενζύμου Ρύθμιση από εξωκυτταρικά σήματα (ορμόνες, νευροδιαβιβαστές ) microRNA μόρια αναστολείς- μπορούν να συνδεθούν σε συγκεκριμένες θέσεις στο mRNA του ενζύμου. Αυτό ενεργοποιεί ένα ένζυμο (Dicer) που διασπά το σύμπλοκο μειώνοντας έτσι τα επίπεδα μετάφρασης του mRNA

Η συνθετική βιολογία αφορά στο σχεδιασμό και την κατασκευή των νέων βιολογικών εργαλείων, διατάξεων και συστημάτων, όπως ένζυμα, γενετικά κυκλώματα, και κύτταρα ή τον ανασχεδιασμό των υφιστάμενων βιολογικών συστημάτων για χρήσιμες εφαρμογές.

Η συνθετική βιολογία επιδιώκει να αποτελέσει για τη βιολογία ότι αποτέλεσε η ανάπτυξη της δυνατότητας σύνθεσης ενώσεων στη χημεία αλλά και ο σχεδιασμός ολοκληρωμένων κυκλωμάτων στους υπολογιστές.

Υπάρχει σαφής διαφορά μεταξύ γενετικής μηχανικής και συνθετικής βιολογίας. Στη γενετική μηχανική γίνεται μεταφορά γονιδίων από έναν οργανισμό σε έναν άλλο. Η συνθετική βιολογία βασίζεται στο σχεδιασμό ενός γενετικού δικτύου, το οποίο σχηματίζεται από συστατικά μέρη που προέρχονται από διάφορα είδη και τα οποία μπορούν να συναρμολογηθούν ως επιμέρους συστατικά σε μεγαλύτερα ολοκληρωμένα συστήματα .

Σασί Η έννοια περιλαμβάνει τη χρησιμοποίηση ενός κυττάρου-ξενιστή στον οποίο εισάγεται συνθετικό DNA. Οι συνηθέστεροι οργανισμοί που χρησιμοποιούνται ως ξενιστές είναι τα βακτήρια E. coli, B. subtilis, Mycoplasma και P. putida και η ευκαρυωτική Ζύμη. Ο ξενιστής προσφέρει το βασικό κυτταρικό περιβάλλον το οποίο εμπλουτίζεται με νέες ιδιότητες που εισάγονται μέσω του τροποποιημένου DNA.

Παραγωγή της αρτεμισινίνης από τους Keasling et al Παραγωγή της αρτεμισινίνης από τους Keasling et al. 2007 που μελέτησαν τα μεταβολικά μονοπάτια του Artemisia annua και παρήγαγαν αρτεμινισιακό οξύ (πρόδρομο φαρμάκου για την αντιμετώπιση της ελονοσίας) το οποίο και παρήγαγαν χρησιμοποιώντας τη Ζύμη ως κυτταρικό εργοστάσιο ( Metab Eng. 2007 Mar;9(2):160-8

Η κύρια δυσκολία της προσέγγισης αυτής είναι ο έλεγχος της συμπεριφοράς του ξενιστή. Οταν εισαχθεί το νέο DNA, το σύστημα ενδέχεται να μην συμπεριφερθεί με τον αναμενόμενο και επιθυμητό τρόπο. Για τον λόγο αυτόν, ένας αριθμός ερευνητικών ομάδων εργάζεται πάνω στα αποκαλούμενα «ελάχιστα κύτταρα», δηλαδή κύτταρα-ξενιστές τα οποία διατηρούν μόνο τις ελάχιστες απαραίτητες βιολογικές λειτουργίες για την επιβίωσή τους. (Mol Syst Biol. 2006;2:45).

Εφαρμογές της Συνθετικής Βιολογίας Υγεία: (α) Ένας μεγάλος αριθμός φαρμάκων αναμένεται να έχουν σχεδιαστεί ως εφαρμογές Συνθετικής Βιολογίας Η ΣΒ μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε για την παραγωγή συνθετικών ή φυσικών ουσιών είτε για την βελτιστοποίησή τους, μειώνοντας τις παρενέργειες.

ENZYMIKH BIOTEXNOΛΟΓΙΑ Προϊόν (τα) 56

Σταθερότητα-Επαναχρησιμοποίηση ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΒΙΟΚΑΤΑΛΥΤΙΚΩΝ ΔΙΕΡΓΑΣΙΩΝ (βιομετατροπές) Υπόστρωμα/τα Βιοκατάλυση Βιομετατροπή Προϊόν/τα Μοντελοποίηση Επιλογή-απομόνωση Ανάκτηση προϊόντων Σχεδιασμός βιοαντιδραστήρα Ένζυμα ή κύτταρα φυσικά ή τροποποιημένα Σταθερότητα-Επαναχρησιμοποίηση Χαρακτηρισμός Ενζυμική Μηχανική Κινητική-Mηχανισμός Ακινητοποίηση Σχέση δομής-λειτουργίας Αναγέννηση συμπαράγοντα Μηχανική του μέσου Βελτίωση δραστικότητας, σταθερότητας εκλεκτικότητας Νέες αντιδράσεις Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA 58

40.000 ένζυμα συνολικά 2500 χαρακτηρισμένα & απομονωμένα  200 εμπορική εφαρμογή Ανασταλτικός παράγοντας Υψηλό κόστος παραγωγής, απομόνωσης και καθαρισμού Αντιμετώπιση του προβλήματος Ανάπτυξη μικροοργανισμών Βιοπληροφορική Κλωνοποίηση και υπερέκφραση Ενζυμική Μηχανική 59

Μεταφορά γονιδίων σε άλλους μικροοργανισμούς που μπορούν να καλλιεργηθούν Κλωνοποίηση γονιδίων

61

H μεταγονιδιωματική ανάλυση είναι ένα νέο εργαλείο της Βιοτεχνολογίας, όπου οι δυνατότητες που προσφέρει η γονιδιωματική ανάλυση (η ανάλυση όλου του DNA ενός οργανισμού) εφαρμόζονται σε ολόκληρες βιοκοινότητες μικροβίων, παρακάμπτοντας την ανάγκη για απομόνωση και καλλιέργεια μεμονωμένων ειδών

Λαμβάνεται ένα δείγμα από ένα συγκεκριμένο περιβάλλον (όπως το έδαφος, το θαλασσινό νερό ή το ανθρώπινο στόμα) Ακολουθεί μαζική εξαγωγή DNA από όλα τα μικρόβια του δείγματος. (Η ανάλυση μπορεί να περιλαμβάνει εξαγωγή πρωτεϊνών ή RNA). Αφού γίνει εξαγωγή DNA από ένα δείγμα, ακολουθεί πρόσληψη και αντιγραφή του DNA. Δημιουργείται έτσι μία «βιβλιοθήκη» που περιέχει τμήματα των γονιδιωμάτων όλων των μικροβίων του δείγματος

ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΩΝ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ

Η λειτουργική σταθερότητα μπορεί να αυξηθεί: Με τροποποίηση του μέσου και των συνθηκών  μη υδατοσυμβατά μέσα Με τεχνικές της ενζυμικής μηχανικής μέσω της αλλαγής αμινοξέων ή προσθήκης χημικών ομάδων ή την εισαγωγή δοσουλφιδικών δεσμών. Με ακινητοποίηση 65

Bιοδιεργασίες σε μη (υδατο)συμβατά ή μη συμβατικά συστήματα Η τεχνολογική αξιοποίηση των ενζύμων/κυττάρων μπορεί να αυξηθεί αν διευρυνθεί η εφαρμογή τους σε μη υδατοσυμβατά συστήματα Συστήματα χαμηλής περιεκτικότητας σε νερό στα οποία τα ένζυμα διατηρούν τις καταλυτικές τους ιδιότητες 66

Εφαρμογή υδρολυτικών ενζύμων για την κατάλυση αντιδράσεων σύνθεσης Εφαρμογή υδρολυτικών ενζύμων για την κατάλυση αντιδράσεων σύνθεσης RCOΝHR1+ H2O  RCOOH + R1NH2 Πρωτεάση RCOOR1 + H2O  RCOOH + R1OH Λιπάση Χ Χ 67

-Μηχανική του μέσου (medium engineering) Mπορούν να πραγματοποιηθούν βιοκαταλυόμενες διεργασίες που είναι αδύνατο να λάβουν χώρα σε υδατικό περιβάλλον (διαφορετικές από in vivo συνθήκες). Οι ιδιότητες των βιοκαταλυτών (σταθερότητα / εκλεκτικότητα) μπορεί να τροποποιηθεί σε μη υδατικά συστήματα -Μηχανική του μέσου (medium engineering) 68

Ακινητοποίηση Ακινητοποιημένο ονομάζουμε ένα βιομόριο του οποίου η ελεύθερη κίνηση στον χώρο είτε έχει αποτραπεί εντελώς είτε έχει περιοριστεί

Τι μπορεί να ακινητοποιηθεί; Ελεύθερα απομονωμένα ένζυμα, Πρωτεΐνες/ αντισώματα DNA/RNA Ενεργά ή μη ενεργά μικροβιακά κύτταρα Φυτικοί και ζωικοί ιστοί

Πλεονεκτήματα ακινητοποίησης

Εφαρμογή σε μεγάλης κλίμακας βιοκαταλυτικές διεργασίες  Παρασκευή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας (βιομηχανίες τροφίμων, φαρμάκων, καλλυντικών, χημικών κλπ ) Ανάπτυξη βιοϋλικών: βιοαισθητήρων-βιοηλεκτροδίων & βιοφίλτρων βιοϋλικών (νανοβιοτεχνολογία) Μεταφορά γονιδίων (γονιδιακή θεραπεία) Στοχευμένη μεταφορά βιομορίων (θεραπεία)

ΑΝΟΡΓΑΝΑ ΥΛΙΚΑ (π.χ γυαλί) ΟΡΓΑΝΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΒΙΟΠΟΛΥΜΕΡΗ ΝΑΝΟΫΛΙΚΑ

Σταθεροποίηση με ακινητοποίηση Μη ομοιοπολική προσρόφηση σε κάποιον στερεό φορέα, Ομοιοπολική σύνδεση στον στερεό φορέα, Διαμοριακή διασύνδεση Εγκλωβισμός σε πολυμερές Εγκαψυλίωση 74

Εγκλωβισμός σε μεμβράνες & νανοδιασπορές Εγκλωβισμός στο εσωτερικό ημιπερατών μεμβρανών που έχουν τη μορφή μκροσφαιριδίων με διάμετρος < 100 μm. H ημιπερατή μεμβράνη διαθέτει πόρους με μέγεθος τέτοιο ώστε να εμποδίζεται η έξοδο των μορίων του βιοκαταλύτη επιτρέποντας τη διέλευση των υποστρωμάτων και των προϊόντων Αντίστροφα μικκύλια Ημιπερατή μεμβράνη Λιπόσωμα 75

Protein Engineering Design and construction of proteins by recombinant DNA techniques 76

Strategies and approaches of protein engineering De novo design  Rational design  Directed evolution

Βελτίωση των ιδιοτήτων ενζύμων με τεχνικές της πρωτεϊνικής μηχανικής -κατευθυνόμενη μοριακή εξέλιξη (in vitro molecular evolution) -τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση. Επιλογή με βάση τις ιδιότητες του ενζύμου Αρχικό γονίδιο Μεταλλάγματα 79

Σταθεροποίηση ενζύμων με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση Αύξηση της πρωτεϊνικής σταθερότητας μέσω της δημιουργίας δισουλφιδικών γεφυρών Όσο μεγαλύτερος είναι ο βρόχος μεταξύ των καταλοίπων κυστεϊνης, τόσο πιο περιορισμένη είναι η αδίπλωτη πολυπεπτιδική αλυσίδα, προσδίδοντας έτσι μεγαλύτερη σταθερότητα στη διπλωμένη δομή. Θερμοσταθερά μεταλλάγματα μπορούν να φτιαχτούν με εισαγωγή δισουλφιδικών γεφυρών σε διαφορετικές θέσεις. 80

Αύξηση της σταθερότητας μέσω της μείωσης των καταλοίπων γλυκίνης και αύξηση των καταλοίπων προλίνης Τα κατάλοιπα Gly έχουν τη μεγαλύτερη ελευθερία διαμόρφωσης. H παρουσία καταλοίπων Gly συμβάλλει στην ποικιλότητα των αδίπλωτων διαμορφώσεων. Aντίθετα, τα κατάλοιπα Pro έχουν στις αδίπλωτες δομές τη μικρότερη ελευθερία διαμόρφωσης, αφού η πλευρική ομάδα της Pro είναι προσδεδεμένη στην κύρια αλυσίδα μέσω ενός επιπλέον ομοιοπολικού δεσμού. 81

OΡΘΟΛΟΓΙΚΟΣ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΒΙΟΜΟΡΙΩΝ

εισαγωγή κατευθυνόμενων μεταλλάξεων Τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση Αντικατάσταση συγκεκριμένων αμινοξέων στο ενζυμικό μόριο με τεχνικές της μηχανικής του DNA- εισαγωγή κατευθυνόμενων μεταλλάξεων 83

Οι αλλαγές των αμινοξέων μιας πρωτεΐνης συνδυάζονται με αλλαγές σε ιδιότητές της όπως: η θερμοσταθερότητα, η εξειδίκευση, η τροποποίηση της αναστολής από αναστολείς, η τροποποίηση της εξάρτησης της δραστικότητας και της σταθερότητας από το pH κ.ά

Τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση H τεχνική προϋποθέτει την ολοκληρωμένη γνώση της σχέσης που συνδέει την πρωτοταγή δομή και τη λειτουργία του πρωτεϊνικού μορίου Παρόλο που η τεχνική είναι ιδιαίτερα χρονοβόρα και ο αριθμός των κλώνων που προκύπτουν είναι συνήθως σχετικά μικρός, είναι μια αποτελεσματική στρατηγική σχεδιασμού βελτιωμένων ενζύμων 85

Τα βασικά βήματα της παραπάνω διαδικασίας είναι τα ακόλουθα: Απομόνωση του ενζύμου & προσδιορισμός της πρωτοταγούς δομής. Απομόνωση του γονιδίου της πρωτεΐνης / κλωνοποίηση / έκφραση σε δραστική μορφή Κρυστάλλωση του καθαρού ενζύμου και προσδιορισμός της στερεοδομής του Mελέτη και καθορισμός του καταλυτικού μηχανισμού

5. Ιn silico απεικόνιση της δομής χρησιμοποιώντας μοριακό μοντελισμό (molecular modelling) 6. Επιλογή της μετάλλαξης που θα «βελτιώσει» το ένζυμο. - Εκτίμηση της προτεινόμενης αλλαγής στη δομή και τη σταθερότητα της πρωτεΐνης. 7. Εφαρμόζεται κάποια τεχνική της τοπο- κατευθυνόμενης μεταλλαξογένεσης (π.χ PCR ) για να δημιουργηθεί η κατάλληλη αλλαγή στο γονίδιο και κατά συνέπεια στην αμινοξική αλληλουχία της πρωτεΐνης. 8. Έλεγχος των ιδιοτήτων του «νέου» ενζύμου 9. Επανασχεδιασμός αν κριθεί απαραίτητος

Η εισαγωγή της επιθυμητής μετάλλαξης πραγματοποιείται με τη χρήση συνθετικών μεταλλαξογόνων ολιγονουκλεοτιδίων συνήθως μεγέθους 18-25 βάσεων και περιέχουν τη συγκεκριμένη αλλαγ­μένη βάση κοντά στο κέντρο τους, είναι συμπληρωματικά με την περιοχή του γονιδίου που πρόκειται να πραγματοποιηθεί η μετάλλαξη

ΚΛΑΣΣΙΚΗ PCR Οι εκκινητές (primers) σχεδιάζονται έτσι ώστε να περιλαμβάνουν την επιθυμητή αλλαγή (αντικατάσταση, προσθήκη ή διαγραφή). Η μεταλλαγή αυτή ενσωματώνεται στο προϊόν της PCR. Περιοχή που θα διαγραφεί Aντικατάσταση Διαγραφή Προσθήκη

«Εξελικτικές» μέθοδοι σχεδιασμού νέων βιοκαταλυτών Οι μέθοδοι αυτές βασίζονται στη δημιουργία κλώνων η οποία επιτυγχάνεται: Με την εισαγωγή τυχαίων μεταλλάξεων στο γονίδιο που κωδικεύει την πρωτεΐνη-στόχο, μέσω τεχνικών όπως η error-prone PCR η οποία σε κατάλληλες συνθήκες οδηγεί στην εισαγωγή περίπου μιας μετάλλαξης ανά 1000 ζεύγη βάσεων . 92

Οι τεχνικές αυτές δεν προϋποθέτουν τη γνώση της σχέσης που συνδέει τη δομή με τη λειτουργία του πρωτεϊνικού μορίου

2. Με την εφαρμογή ανασυνδυαστικών τεχνικών κατευθυνόμενης εξέλιξης που βασίζονται στον ανασυνδυασμό γονιδίων όπως η τεχνική ανασυνδυασμού ή «ανακατέματος» του DNA (DNA shuffling), 94

Eπιλογή/διαλογή για την ανίχνευση μεταλλαγμάτων με βελτιωμένες ιδιότητες (θερμοσταθερότητα, σταθερότητα σε οργανικούς διαλύτες κλπ). Εισαγωγή σε φορέα 95

(high-throughput screening) Προσδιορισμοί υψηλής ρυθμοαπόδοσης (high-throughput screening) Οι μέθοδοι αυτοί εφαρμόζονται για την ανάλυση της ενζυμικής δραστικότητας από βιβλιοθήκες μεταλλαγμάτων (που περιέχουν 104-106 μεταλλάγματα). Με αυτόματα μηχανήματα ρομποτικής λειτουργία, οι προσδιορισμοί μπορούν να γίνουν εύκολα κάτω από τις ίδιες συνθήκες του πειράματος. 96