Γιώργος Σειραγάκης Food Chemist MSc www.foodallergenslab.com

Ιδρυθηκε από Α. Βαρλάμο & Γ Ιδρυθηκε από Α. Βαρλάμο & Γ. Σειραγάκη το 2008 και ασχολείται με προϊόντα και υπηρεσίες για ασφάλεια & ποιότητα τροφίμων. Δείγματα έρχονται από όλη την Ελλάδα , Κύπρο και 4 χώρες του εξωτερικού με Courier και τα αποτελέσματα στέλνονται άμεσα μέσω Διαδικτύου. Η εταιρεία μας διαθέτει σημαντική ερευνητική δραστηριότητα και πολλές διεθνείς επιστημονικές δημοσιεύσεις .Διαπνέεται από την καινοτομία . Η εταιρεία έχει πιστοποιηθεί κατά ISO9001:2008 και διαπιστευθεί κατά ISO17025:2005

Α. Βαρλάμος EFSA S.H.P Chair CHEM ENGINEER M.Sc Γ. Σειραγάκης FOOD CΗΕMIST M.Sc Γ.Μηλιάδης Χημικός Ph.D Ε. Πολίτης Molecular Biologist M.Sc Α. Λαμπιδώνης Γεωπόνος Ph.D Α.Βρετάκου Χημικός M.Sc Δ. Κίζης Γεωπόνος, Ph.D Β. Ευαγγέλου , Γεωπόνος Ph.D Ε. Ανθη Food Technologist ΑΤΕΙ Θεσσαλονίκης Ι.Αγγελογιαννάκης Τεχ. Γεωπόνος Φυτ. Παραγωγής Ε. Χριστοφάκης Chemist, Biotechnologist M.Sc Ε. Καραγεώργη Τεχνολογος Τροφίμων Ε. Χριστοδούλου Food Technologist ΑΤΕΙ ΘΕΣ/ΚΗΣ Π. Δανιάς Χημικός Μηχανικός Ε.Μ.Π Π.Μπαργωτάκης Γεωπόνος –Βιοτεχνολογος M.Sc Φ.Σπιθουράκη Τεχνολογος Τροφίμων

ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ( Μεταξύ των 5 μεγαλύτερων διαπιστευμενων εργαστηρίων στην Ελλάδα) ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΕΙΣ- 12 σεμινάρια το χρόνο για Ασφάλεια Τροφιμων, Βιολογικά Προϊόντα, Μικροβιολογία, Αλλεργιογόνα, Μοριακά ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ : Επίσημοι αντιπρόσωποι για ΕΛΛΑΔΑ-ΚΥΠΡΟ της NEOGEN USA , Generon IT Bioscientific ( Aflatoxin M1, b-lactam & Cefalosporin antibiotics), Reagena (Phosphatase kit) για ανοσοχημικό και μοριακό εξοπλισμό,

Μοριακός Χαρακτηρισμός Ροδάκινων 8 χώρες συντονιστής INRA FRANCE Πρόγραμμα ΕΝΑΡΞΗ ΘΕΜΑ ΣΥΝΕΡΓΑΣΙΑ FP7 MARS Mαιος 2013 Μοριακός Χαρακτηρισμός Ροδάκινων 8 χώρες συντονιστής INRA FRANCE Ιαν 2013 Παραγωγή Βιοαισθητήρα για ανίχνευση φυτοφαρμάκων ΕΚΕΦΕ ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗ Σεπ 2012 Παθογόνα με Μοριακές Τεχνικές Μεταδιδάκτορας από ΓΠΑ ΚΑΙΝΟΤΟΜΙΑ- ΠΡΟΪΟΝ Ιούλιος 2012 Αλλεργιογόνα με Μοριακές Τεχνικές Γενικό Χημείο Κράτους, Πανεπιστήμιο Λευκωσίας 5

ΔΙΑΚΡΑΤΙΚΟ ΕΛΛΑΔΑ- ΚΥΠΡΟΣ Mαιος 2009 Πρόγραμμα ΕΝΑΡΞΗ ΘΕΜΑ ΣΥΝΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΑΚΡΑΤΙΚΟ ΕΛΛΑΔΑ- ΚΥΠΡΟΣ Mαιος 2009 Μοριακές Τεχνικές για αλλεργιογόνο σισάμι ΜΑΙΧ, Γενικό Χημείο Κράτους Κύπρου ΔΙΑΚΡΑΤΙΚΟ ΡΟΥΜΑΝΙΑ- ΚΥΠΡΟΣ Ιαν 2010 Αλλεργιογόνα σε Οίνους Γενικό Χημείο Κράτους Κύπρου, University of Galati ΕΠΙΧΕΙΡΗΣΕΙΣ- ΠΡΟΪΟΝ Σεπ 2010 Ψωμί Ελεύθερο Γλουτένης από χαρούπι Γενικό Χημείο Κράτους Κύπρου, ΓΠΑ, ΚΑΙΝΟΤΟΜΙΑ- ΠΡΟΪΟΝ Ιούλιος 2011 Είδη Γάλακτος σε χαλλούμι με μοριακές τεχνικές Πίττας LTD, Πανεπιστήμιο Λευκωσίας 6

συμμετοχές σε συνέδρια: (πανω από 25 παρουσιάσεις) METROLOGIA 2010, LARNACA ΙΔΙΑΙΤΕΡΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ELISA ΣΤΗΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΠΌ ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΣΕ ΔΙΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΧΗΜΑΤΑ ( Σειραγακης, Χριστοφάκης, Πολίτης, Καπότη) METROLOGIA 2012 ΕΜΠ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΓΙΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΕΙΔΩΝ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΣΤΟ ΧΑΛΟΥΜΙ ( Δημολιού, Σειραγάκης) συμμετοχές σε συνέδρια: (πανω από 25 παρουσιάσεις) 3o Πανελλήνιο Συνέδριο Ζωϊκής Παραγωγής Φεβ.2013 ΘΕΣ/ΚΗ 5ο Greek Food Lipid Forum (Μαρτιος 2013 ΑΘΗΝΑ), 4ο Πανελλήνιο Συνέδριο Βιοτεχνολογίας Τροφίμων (Οκτώβριος 2013 ΑΘΗΝΑ) 7 εργασίες, 2ο Παγκόσμιο Συνέδριο Μοριακών Τεχνικών & Ασφάλειας Τροφίμων (Σεπτέμβριος 2013 ΗΑΝGZOU ΚΙΝΑ) 3ο Πανελλήνιο Κτηνιατρικό Συνέδριο Παραγωγής ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ για αλλεργιογόνα σε κρέας και προϊόντα τους (ΙΩΑΝΝΙΝΑ 2-4ΜΑΊΟΥ2014) 7 7

Γ. Σειραγάκης FOOD CΗΕMIST M.Sc Ε. Πολίτης Molecular Biologist M.Sc Α. Λαμπιδώνης Γεωπόνος Ph.D Bιοτεχνολογία Δ. Κίζης Γεωπόνος, Ph.D Βιολογία, Β. Ευαγγέλου ,Γεωπόνος Φυτικής Παραγωγής Ph.D

Οι μοριακές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για αναλύσεις τροφίμων με την απομόνωση ολικού DNA έχουν όλο και περισσότερες εφαρμογές τόσο για την ασφάλεια των τροφίμων ( Παθογόνοι μικροοργανισμοί, αλλεργιογόνα) όσο και για την ποιότητα , γνησιότητα ( Γενετικά Τροποποιημένα, νοθεία σκληρού μαλακού, νοθεία ελαιολάδου & γαλακτοκομικών, ειδη κρέατος, halal, άλογο σε μοσχάρι, κοτόπουλο σε γαλοπούλα) 9

CEN/TC 275/WG 6 – WG 6 “Microbiology of the food chain” of Technical Committee 275 “Food analysis – • Chair: Alexandre LECLERQ (Pasteur Institute, Paris) CEN/TC 275/WG 6/TAG 3 “PCR for the detection of food-borne pathogens in food” Chair Kornelia Berghof-Jäger Germany Biotecon26th meeting   in Berlin on 24&25 April 2014

Θερμικοί Κυκλοποιητές Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης 5, Πραγματικού Χρόνου 2 (RT-PCR, BIORAD, RT-SLAN ), ΕLISA READER αυτόματης προώθησης (StatFax 300) 3, Φασματοφωτόμετρο Ορατού–Υπεριώδους (Perkin-Elmer Lamda2, Hitachi 3000, ), PCR-Cabinets για ασφαλή διαχωρισμό των PCR δοκιμών (Biosan), Αυτόματους Ομογενοποιητές 400 ml (Interscience)

13

Για την εφαρμογή των μεθόδων PCR επιλέχθηκαν πακέτα του εμπορικού οίκου «HAI KANG Life Corporation» και συγκεκριμένα τα «Watcher Salmonella spp.» / «Watcher Listeria monocytogenes» - PCR και «Hunter Salmonella spp. / «Hunter Listeria monocytogenes» - Real Time PCR. Παράλληλα, εφαρμόστηκαν σε συνδυασμό με 2 μεθόδους εκχύλισης DNABioo Scientific – Nucleic Acid Extraction Kit /CTAB, ώστε να συγκριθούν ως προς την αποτελεσματικότητά τους 14

Θετικά στελέχη Σαλμονέλας ATCC 35640 και Λιστέριας ATCC 19115 διάφορα δείγματα κρεάτων/κρεατοσκευασμάτων, αλλαντικών, λαχανικών, γαλακτοκομικών προϊόντων, προϊόντων άρτου , μαγιονέζας Θετικά στελέχη Σαλμονέλας ATCC 35640 και Λιστέριας ATCC 19115 από εταιρεία MICROBIOLAND, FEPAS PT listeria, Salmonella 15

Σαλμονέλα για τον πρόσθιο (5'-TTA TTA GGA TCG CGC CAG GC-3’) και για τον οπίσθιο (5'-AAA GAA TAA CCG TTG TTC AC- 3’) και το μέγεθός του ανέρχεται στις 164 bp Λιστέρια για τον πρόσθιο (5'-CGG AGG TTC CGC AAA AGA TG-3') και για τον οπίσθιο (5'-CCT CCA GAG TGA TCG ATG TT-3') και το μέγεθός του ανέρχεται στις 234 bp . 16

Η προετοιμασία δειγμάτων για PCR και Real Time PCR έγινε σε ειδικό UV θάλαμο για αποφυγή μολύνσεων. Η ενίσχυση του DNA με συμβατική PCR έγινε σε δείγματα με τελικό όγκο 20 μl και τελική συγκέντρωση: 20 mM Tris-HCL, (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 μM dNTP mix, 0.5-1 pmol από κάθε εκκινητή, 2.0 ng μήτρα DNA και 1.5 μονάδες Taq DNA πολυμεράση (Invitrogen) 17

Για Real Time PCR χρησιμοποιήθηκε η συσκευή CHROM4 της BIO-RAD Για την συμβατική PCR χρησιμοποιήθηκε η συσκευή ΑΒ2710 της Applied Biosystems. Για Real Time PCR χρησιμοποιήθηκε η συσκευή CHROM4 της BIO-RAD PCR-Cabinets, Vortexes, Centrifuges της εταιρείας ΒΙΟSAN 15,000 x g 18

Για την εφαρμογή των μεθόδων PCR επιλέχθηκαν πακέτα του εμπορικού οίκου «HAI KANG Life Corporation» και συγκεκριμένα τα «Watcher Salmonella spp.» / «Watcher Listeria monocytogenes» - PCR και «Hunter Salmonella spp. / «Hunter Listeria monocytogenes» - Real Time PCR

Ο έλεγχος των συγκεκριμένων παθογόνων (164 bp και 234 bp για τη Salmonella spp. και Listeria monocytogenes, αντίστοιχα) καθώς και του θετικού control του εμπορικού πακέτου, πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2% παρουσία βρωμιούχου αιθιδίου και κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος (ΤΒΕ). Μετά τον διαχωρισμό, παρατηρήθηκαν τα αντίστοιχα για τα δύο παθογόνα προϊόντα αναμενόμενου μήκους 164 bp και 234 bp (σε ενδεικτικά δείγματα μαγιονέζας και κοτόπουλου).

Listeria monocytogenest Well Type Test Item CT B4 Sample 1 Salmonella spp. 35.42 B5 Sample 2 36.45 B6 Positive 26.04 B7 Control No CT Well Type Test Item CT C4 Sample 1 Listeria monocytogenest 33.49 C5 Sample 2 35.52 C6 Positive 20.46 C7 Control No CT

Για την ημι-ποσοτική ανίχνευση των παθογόνων Salmonella και Listeria monocytogenes μέσω Real Time PCR, εξετάστηκε ο αριθμός των κύκλων κατά την διάρκεια του οποίου, το δείγμα φτάνει την γραµµή «Threshold». Όσο μεγαλύτερη είναι η ποσότητα της αρχικής αλληλουχίας DNA στο κάθε δείγμα τόσο νωρίτερα εμφανίζεται η τιμή Ct για κάθε δείγμα, δηλαδή αναλογικά η Ct θα είναι μικρότερη.

Η ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας, η οποία είναι μέρος Ερευνητικού Προγράμματος, επιδοτούμενο από την ΓΓΕΤ στα πλαίσια της Δράσης «Υποστήριξη των Επιχειρήσεων για την απασχόληση προσωπικού υψηλού επιπέδου», με Επιστημονικό Υπεύθυνο τον Δρ. Αντώνη Λαμπιδώνη, εχει δώσει μια σειρά από συγκεκριμένα πρωτόκολλα ανίχνευσης. Αναπτύσσεται εξειδίκευση των προτοκόλλων αυτών ανάλογα με τα υποστρώματα.