Funkcije proteinov Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb) Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) Oporna funkcija (strukturni proteini, npr keratini, kolagen ...) Kontraktilni proteini: - Mišična kontrakcija - Gibanje organelov znotraj celice - Gibanje migetalk in bičkov Membranski proteini, vključeni v transport molekul/ionov preko membrane Proteini, vključeni v prenos signala (receptorji, G-proteini, kinaze ...) Obramba pred tujki/invazivnimi organizmi (Ig) Kataliza biokemijskih reakcij (encimi)

Proces kontrakcije Procesi, pri katerih sodelujejo kontraktilni proteini: krčenje mišic, gibanje organelov, reorganizacija kromosomov ob delitvi celic, rotacija bičkov, gibanje encimov vzdolž DNA med transkripcijo Interakcija med kontraktilnimi proteini (šibke interakcije) poteka ob porabi kemijske energije (hidroliza ATP) Gibanje – ciklična sprememba konformacij velikih agregatov kontraktilnih proteinov → usmerjena sila Mišični kontraktilni proteini: miozin, aktin, tropomiozin, troponin ... Nemišični kontraktilni proteini: dinein/mikrotubuli (gibanje bičkov), kinezin/aktiniski filamenti (znotrajcelično gibanje organelov)

Mišični kontraktilni proteini Proteini progaste mišice: miozin, aktin, tropomiozin, troponin ... (80% mišičnih proteinov predstavljata miozin in aktin) Struktura mišičnega vlakna: miozin-debela vlakna aktin-tanka vlakna Kontrakcija: interakcija med miozinom in aktinom Tropomiozin in troponin - udeležena pri uravnavanju mišične kontrakcije

Miozin: 6 podenot (2 težki in 4 lahke verige) 2 lahki verigi 2 težki verigi Glava - globularni del - hidroliza ATP Rep – fibrilarni del, -keratin C-konec Miozin, Mr 540 000, Težka veriga, Mr 220 000 Lahka veriga, Mr 20 000 Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Razgradni produkti miozina Proteolitični encimi razcepijo polipeptidne verige miozina na določenih mestih tripsin papain S1 S1 Domena S1 – miozinska glava, kjer poteka hidroliza ATP Z delovanjem proteinaz razgradimo protein na manjše fragmente → informacija o strukturi in o funkciji proteina

Struktura miozina in debelih filamentov vezava aktina Model strukture molekule miozina z različnimi funkcionalnimi deli vezava ATP lahke verige pregib Struktura debelih filamentov skeletne mišice – več 100 molekul miozina

Tanki filamenti: F-aktin F-aktin je polimer globularnih G-aktinov Mr 42 000 za polimerizacijo v F-aktin je potrebna energija (hidroliza 1 molekule ATP za 1 podenoto G-aktina) Na vsako podenoto F-aktina se specifično veže miozinska glava na F-aktin sta vezana tropomiozin in troponin (uravnavanje mišične kontrakcije) TN-I TN-C TN-C – veže Ca2+ TN-I – inhibira vezavo miozina na aktin TN-T – veže se na tropomiozin TN-T Meisenberg H, Simmons WH, Principles of Medical Biochemistry,1998

Tanki filamenti A. Model strukture – pogled s strani B. Položaj tropomiozina med kontrakcijo - pogled v prečnem prerezu troponin tropomiozin A. aktin tropomiozin B. aktin relaksirano stanje kontrahirano stanje miozin Meisenberg H, Simmons WH, Principles of Medical Biochemistry,1998

Interakcija miozinske glave z monomerno enoto (dimer G-aktina) aktina miozinska glava aktinski filament Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Prerez vlakna (“fiber”) skeletne mišice > 100 vlakenc vlakno – fiber premer 20-100 μm vlakence – miofibrila premer 2 μm mišično vlakno, velika celica z več 100 (do 1000) vlakenc celica vsebuje več jeder obdana je s plazemsko membrano (sarkolemo) mitohomdriji so med miofibrilami

Struktura skeletne mišice Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Elektronsko-mikroskopska slika progaste mišice debeli filamenti tanki filamenti relaksirana mišica sarkomera kontrahirana mišica prekrivanje debelih/tankih filamentov - prerez I pas (Izotropni) – nizka elektronska gostota, A pas (Anizotropni) – visoka elektronska gostota I pas – tanki filamenti A pas – debeli filamenti in prekrivanje tankih in debelih filamentov Z obroč – pripenjanje tankih filamentov (od Z do Z – sarkomera) M linija – pripenjanje debelih filamentov

Proteini progaste mišice -aktinin dezmin vimentin nebulin (700 ak) -vijačnica miozin relaksirana mišica aktin kontrahirana mišica paramiozin C-protein M-protein titin (26 926 ak)

Proteini progaste mišice Miozin, aktin (motorična proteina) – povezujeta se s šibkimi interakcijami Tropomiozin, troponin (uravnavanje kontrakcije) Z obroč tankih filamentov – α-aktinin, dezmin, vimentin Preko celotnega tankega vlakna – nebulin (7000 ak, α-vijačnica) M linija debelih vlaken – paramiozin, C-protein in M-protein Povezovanje debelih vlaken na Z obroč – titin (26 926 ak) določa dolžino sarkomere in preprečuje preobsežno raztegovanje mišice

Mišična kontrakcija – drsenje debelih ob tankih filamentih Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Mehanizem mišične kontrakcije Celoten krog generira silo 3-4 pN → premik tenkega filamenta ob debelem za 5-10 nm Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Mehanizem mišične kontrakcije Začetek dogodkov sproži povišana konc. Ca2+ 0,1→10 M Konformacijsko spremembo miozinske molekule povzroči vezava miozinske glave na aktin ob sprostvi ADP in Pi ATP je potreben za sprostitev miozina z aktina Meisenberg H, Simmons WH, Principles of Medical Biochemistry,1998

Uravnavanje mišične kontrakcije Interakcijo med aktinom in miozinom uravnava signal iz živčnega sistema Regulatorna proteina: troponin in tropomiozin Impulz: Ca2+ iz sarkoplazmatskega retikuluma (konc. Ca2+ 0,1 μM v mirujoči mišici → 10 μM med kontrakcijo) Troponin (3 podenote: TnT, TnI, TnC): - TnC veže Ca2+ → konformacijska sprememba, - TnI se umakne → premik tropomiozina - TnT na aktinu – sprosti se vezavno mesto za miozin → pričetek kontrakcije

Nemišični kontrakrilni proteini v citoskeletu mikrofilamenti – Φ ~7 nm, najpomembnejši protein aktin; funkcija – konsistenca citoplazme in gibanje v interakciji z nemišičnim miozinom mikrotubuli – Φ ~24 nm; najpomembnejši protein tubulin funkcija – vzdrževanje oblike celice in sodelovanje v znotrajceličnem transportu v interakciji s kinezinom

Aktin v ne-mišičnih celicah Pri človeku 6 izoformnih oblik aktina Hitra polimerizacija/depolimerizacija G-aktina→od stopnje polimerizacije je odvisna konzistenca citoplazme Gibanje makrofagov in nevtrofilcev Fagocitoza Kontrakcija črevesnih resic Sodelovanje pri nastanku delitvenega vretena med mitozo Sprememba oblike aktiviranih krvnih ploščic ------------------- Strupi gliv: - citokalazin B – inhibira polimerizacijo aktinskih filamentov (se usede na rastoči del filamenta) - faloidin (prepreči depolarizacijo)

Evkariontska celica v prerezu Mikrofilamenti: 2 zviti verigi proteina aktina; funkcija: oblika celice, mišična kontrakcija, gibanje citoplazme Intermediarni filamenti: protein -keratin funkcija: oblika celice, interakcija s sosednjimi celicami Mikrotubuli: cevke, nastale iz dimernih podenot tubulina; funkcija: gibanje organelov, gibanje bičkov in migetalk, gibanje kromosomov Citoskelet: mreža proteinskih vlaken v citoplazmi, ki daje celici obliko, umešča in giblje organele ter sodeluje pri celičnem gibanju

Znotrajcelično gibanje po mikrofilamentih “korakanje” miozina po aktinski “tračnici” Lubert Stryer, Biochemistry, 1995

Model strukture mikrotubulov -tubulin tubulin Pogled s strani -tubulin Pogled v prerezu 4 nm -tubulin -tubulin Meisenberg H, Simmons WH, Principles of Medical Biochemistry,1998

Mikrotubuli Nastanejo s polimerizacijo globularnega proteina tubulina (2 podenoti: tubulin-α in tubulin-β); polimerizacija poteka v spiralasti razvrstitvi 13 enot/zavoj, do nekaj tisoč molekul tubulina Dinamične strukture, asociacija/disociacija enot tubulina Mikrotubuli - v vseh celicah z jedri, pomembni za obliko celice Sodelujejo v transportnih procesih – med mitozo se kromosomi razmaknejo ob dveh polih mikrotubulov (vlakna mitotskega vretena), sodelujejo pri potovanju veziklov znotraj celice v sodelovanju proteinov z ATPazno aktivnostjo (kinezin) Žafranov strup kolhicin inhibira polimerizacijo tubulinov, je inhibitor mitoze - ne nastane delitveno vreteno

Funkcija mikrotubulov: gibanje organelov znotraj celice ATPazna akivnost El. mikroskopski posnetek vezikla na mikrotubulu Struktura kinezina Lubert Stryer, Biochemistry, 1995

Migetalke (cilia) in bički (flagella) Migetalke in bički so “priveski/podaljški” celic, obdani z membrani (nadaljevanje plazmaleme) Gibljejo se utripajoče, vrtinčasto Migetalke se nahajajo na mnogih epitelijskih celicah: v respiratornem traktu/sapniku, v nosnih sinusih ... Edini bički v človeškem telesu – celice spermijev (prokarionti/bakterije se gibljejo večinoma z bički) So stabilne strukture, sestavljene iz nespremenljivega števila podenot

Prerez evkariontske migetalke ali bička (9+2) Dinein vsebuje v “glavi” ATPazno aktivnost (analogija z miozinom v mišičnih celicah) Hidroliza ATP povzroči asociacijo dineina z vlaknom B mikrotubula Dineinska glava koraka po sosednjem dubletu mikrotubula (analogija s premikanjem miozinske glave po fibrilarnem aktinu Meisenberg H, Simmons WH, Principles of Medical Biochemistry,1998

Shematični prikaz gibanja migetalk in bičkov Meisenberg H, Simmons WH, Principles of Medical Biochemistry,1998

Sindrom negibljivih migetalk (immotile cilia sindrome) Dedne napake v strukturi migetalk in bičkov (1: 30 000) → bronhitis, sinuzitis, neplodnost Različne napake v strukturi molekul: okvara dineinskih ročic, ni dineinskih ročic, ni notranjih dimerov, ni povezovalnih proteinov. migetalke/bički so negibljivi ali slabo gibljivi Simptomi: kronične infekcije respiratornih poti (normalno migetalke z usklajenim gibanjem potiskajo sluz z mikroorganizmi in vdihanimi delci navzgor po sapniku – 30-40 g sluzi iz bronhijev/dan; v primeru napak v strukturi migetalk sluz zastaja) Moški so neplodni – negibljivi spermiji 50% bolnikov ima situs inversus – zamenjava notranjih organov levo/desno; vzrok – nenormalno utripanje migetalk zarodka, ki nastaja v normalno desno/levo simetrijo

Pregled kontraktilnih proteinov izvor in funkcija strukturno ogrodje motorični protein mišica (progasta, gladka) mišično delo aktin - polimer globularnih aktinov miozin (mišični) mikrofilamenti gibanje organelov miozin (nemišični) mikrotubuli citoskeleta mikrotubuli kinezin mikrotubuli (migetalke, bički) gibanje celic mikrotubuli (razporeditev 9+2) dinein