Funkcije proteinov Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb) Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) Oporna funkcija (strukturni.

Παρουσίαση με θέμα: "Funkcije proteinov Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb) Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) Oporna funkcija (strukturni."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Funkcije proteinov Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb) Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) Oporna funkcija (strukturni proteini, npr keratini, kolagen ...) Kontraktilni proteini Membranski proteini, vključeni v transport molekul/ionov preko membrane Proteini, vključeni v prenos signala (receptorji, G-proteini, kinaze ...) Obramba pred tujki/invazivnimi organizmi (Ig) Kataliza biokemijskih reakcij (encimi)

2 Vezava ligandov na protein
Molekula – ligand se reverzibilno veže na protein Ligand se veže na vezavno mesto proteina, ki je komplementarno glede velikosti in oblike liganda, naboja, hidrofobnih in hidrofilnih interakcij Vezavno mesto je selektivno, torej specifično za določen ligand Vezava liganda povzroči konformacijsko spremembo proteina, ki vodi k močnejši vezavi; strukturna adaptacija med proteinom in ligandom – inducirano prilagajanje Pri multimernih proteinih povzroči vezava liganda na eno podenoto konformacijsko spremembo drugih podenot Interakcije med proteini in ligandi so uravnavane s specifičnimi interakcijami drugih ligandov. Ti drugi ligandi povzročijo konformacijsko spremembo proteina, ki vpliva na vezavo prvega liganda.

3 Vezava liganda na protein: proteini, ki vežejo kisik mioglobin (Mb) in hemoglobin (Hb)
Prostetična skupina hem Mioglobin – eno vezavno mesto za kisik Kvantitativni opis interakcije protein-ligand Transport kisika s hemoglobinom Struktura Hb Strukturne spremembe Hb po vezavi kisika Kooperativna vezava kisika na Hb Alosterični proteini – kvantitativni opis vezave Hb prenaša tudi H+ in CO2 Uravnavanje vezave kisika na Hb z 2,3-bisfosfogliceratom Anemija srpastih celic

4 Topnost nekaterih plinov v vodi
Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005 Večje živali – potreba po sistemu, ki prenaša in shranjuje kisik Za vezavo kisika primerni elementi prehoda – Fe veže kisik in ga s tem naredi manj reaktivnega Fe – bistven del prostetične skupine (hem) proteinov, ki vežejo kisik (Mb. Hb)

5 Prostetična skupina hem
Fe s šestimi koordinativnimi vezmi porfirin protoporfirin IX - hem Fe vezano s 4 koordinatinvini vezmi na N pirolovih obročev (vsi atomi ležijo v isti ravnini) 2 vezi sta prosti

6 Struktura mioglobina (Mb)
3D struktura – globinsko zvitje (“fold”) kompaktna molekula, v notranjosti le 4 molekule H2O 8 segmentov (A-H) -vijačnic (7-23 ak) 75% strukture: α-vijačnica hidrofobni –R v notranjosti, hidrofilni –R proti vodnemu okolju nehelični segmenti označeni AB, CD... Pro na mestih β-zavojev prostetična skupina hem vezan v žep med E in F vijačnicama Mb se nahaja v mišičnih celicah, rdeče/rjave barve Mr = , 1 polipeptidna veriga, 153 ak 3D strukturo ugotovil l. 1950, John Kendrew s sod. z uklonom Rtg. žarkov

7 Umestitev hema v protein (globin)
Pogled s strani Ravnina, v kateri leži porfirin Fe vezano s 4 vezmi v hemu, z eno vezjo na His ostanek proteina, prosta ostane ena koordinavina vez za ligande O2 NO CO His

8 Reverzibilna vezava kisika na Mb: Mb + O2 ↔ MbO2
distalni His (vijačnica E) v Mb proksimalni His (vijačnica F)

9 Reverzibilna vezava liganda na protein
P – protein L – ligand PL – kompleks protein-ligand P + L ↔ PL Ka – asociacijska konstanta za nastanek kompleksa PL Kd – disociacijska konstanta kompleksa PL

10 Vezava liganda (L) na protein: enačba in grafična predstavitev
Vezava kisika na Mb: Mb + O2 ↔ MbO2 Ligand L – O2  – delež zasedenih vezavnih mest Kd – disociacijska konstanta kompleksa MbO2 Koncentracijo plinov izražamo s parcialnim tlakom plinov - p pO2 – parcialni tlak kisika P50 – parcialni tlak kisika, kjer je 50% vezavnih mest zasedenih

11 Disociacijske konstante nekaterih kompleksov protein·ligand
Kd (M) avidin biotin 1 x 10-15 inzulinski receptor inzulin 1 x 10-10 anti-HIV Ig protein na površini virusa HIV Ni-vezavni protein Ni2+ 1 x 10-7 kalmodulin Ca2+ 1 x 10-6

12 Sterični vplivi za vezavo liganda (O2, CO) na hem Mb
Vezava CO na hem v raztopini: CO veže z x večjo afiniteto kot O2 Vezava kisika pod določenim kotom Vezava CO pravokotno na ravnino hema Vezava CO in O2 na hem v Mb: His v E7 Mb prepreči vezavo CO pod pravim kotom – afiniteta Mb do CO le še 200x večja kot do O2 Zaradi prostorskih ovir, ki jih predstavlja His v vijačnici E7, se O2 veže pod določenim kotom na Fe v hemu

13 Mb ni primeren za prenos kisika iz pljuč v tkiva
Vezava O2 na Mb Razmere v pljučih: PO2 13,3 kPa oz. 90 mm Hg Razmere v tkivih: PO2 4 kPa oz. ~30 mm Hg Glede na vezavno krivuljo bi bil O2 stalno vezan na Mb Mb ni primeren prenašalec kisika od pljuč v tkiva To nalogo opravlja hemoglobin (Hb)

14 Kisik se prenaša po krvi s hemoglobinom (Hb)
Hb se nahaja v eritrocitih Eritrociti – nepopolne celice, namenjene prenosu O2 V citosolu vsebujejo ~34% Hb Arterijska kri ~96% zasičena s kisikom, venska ~64% → O2 se sprosti v tkivih, kjer se porabja za oksidacijo metaboličnih hranil (glukoza), pri čemer nastajata CO2 in H+, ki se prenašata iz tkiv v pljuča Hb prenese v telesu 500 g O2/dan = 15,6 molov O2/dan Eritrociti – ploščate krvne celice premera  6-9 m Rdeča barva izvira is hema

15 Vloga Hb v prenosu kisika
oksigeniran Hb neoksigeniran Hb tkiva pljuča srce O2 dobimo z dihanjem in se prenaša iz pljuč (PO2 13,3 kPa oz. 90 mm Hg) v tkiva (PO2 4 kPa oz. ~30 mm Hg)

16 Hemoglobin (Hb) Hb: tetramer (α2β2) kroglaste oblike, Mr 64 000
α veriga: 141 ak ostankov, β veriga 145 ak ostankov Hb zarodka: ζ veriga (podobna α) in ε veriga (podobna β) 3D struktura štirih verig Hb je tetraednična Hemi se nahajajo v vdolbinah na zunanjosti molekule Ak zaporedje verig Hb in Mb ni enako, samo 27 ak ostankov identičnih, terciarna struktura zelo podobna – globinsko zvitje Hb veže O2 Hb + O2 <-> HbO2 HbO2 + O2 <-> Hb(O2)2 Hb(O2)2 + O2 <-> Hb(O2)3 Hb(O2)3 + O2 <-> Hb(O2)4 Sumarna reakcija: Hb + 4O2 -> Hb(O2)4 2 2 2 1 ( Mb + O2 ↔ MbO2 )

17 Primerjava strukture Mb in β-podenote Hb
Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

18 Najpomembnejše interakcije med neenakimi podenotami Hb (αβ)
Največ šibkih interakcij med neenakima podenotama Največ šibkih interakcij med neenakima podenotama Hb obstaja v dveh konformacijah: stanju R (relaxed) in stanju T (tense) O2 ima večjo afiniteto do stanja R Stanje T stabilizirano, če ni kisika, stanje T-deoksihemoglobin Vezava kisika povzroči konformacijsko spremembo T→R

19 Stabilizacija T konformacije Hb z ionskimi interakcijami
Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

20 Prehod Hb iz stanja T v stanje R
HbO2

21 Konformacijska sprememba v Hb v bližini hema po vezavi kisika
Vezava kisika na Fe v hemu spremeni 3D strukturo hema (sploščenje molekule) Sprememba 3D strukture hema se odrazi na proteinskem delu molekule, ki je povezana s hemom preko his ostanka → konformacijska sprememba proteina

22 Konformacijska sprememba Hb po vezavi kisika

23 Kooperativna vezava O2 na Hb – sigmoidna vezavna krivulja
Stanje R - visokoafinitetno stanje Prehod iz nizko v visokoafinitetno stanje Stanje T – nizkoafinitetno stanja Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

24 Alosterični proteini Vezava liganda (modulatorja) na eno vezavno mesto spremeni vezavne lastnosti drugih vezavnih mest Konformacijska sprememba, povzročena z vezavo modulatorja: manj aktiven protein v bolj aktiven protein Modulatorji: inhibitorji ali aktivatorji Modulator - normalni ligand, homotropična interakcija Modulator - druga molekula, heterotropična interakcija Hb in O2 – pozitivna homotropična interakcija (modulator O2 je aktivator); kooperativna vezava, značilna sigmoidna krivulja

25 Strukturne spremembe multimernega proteina – kooperativna vezava liganda
stabilno manj stabilno nestabilno

26 Hb prenaša tudi CO2 in H+ med pljuči in mišicami
CO2, ki nastaja z oksidacijo organskih hranil, reagira z vodo (reakcijo katalizira encim karbonska anhidraza) CO2 + H2O ↔ HCO3- + H+ Reverzibilna vezava kisika na Hb: Hb + O2 ↔ HbO2 Na vezavo kisika na Hb vpliva H+ (Bohrov efekt) HbO2 + H+ ↔ HHb+ + O2 Posledica: - v pljučih se na Hb veže kisik, sprosti se H+ - v tkivih se s HbO2 sprosti kisik, veže se H+

27 Vpliv pH na vezavo kisika na Hb
O2 in H+ se vežeta na Hb z obratno afiniteto

28 Vezava CO2 na Hb - CO2 se veže na N-konec polipeptidne verige, nastane karbamat
Bohrov efekt karbamat H+ in CO2 ojačita kooperativno delovanje O2 med podenotami Hb

29 Heterotropični alosterični modulator vezave O2 na Hb - 2,3-bisfosfoglicerat BPG
Visoka koncentracija BPG v eritrocitih BPG se veže v centralni žep med β podenotami v stanju T – 1 molekula BPG se veže na 1 molekulo Hb Vezavni žep za BPG izgine po prehodu T → R stanje BPG zniža afiniteto do O2, stabilizira T stanje Hb HbBPG + O2 ↔ HbO2 + BPG T stanje R stanje

30 Vezava 2,3-bisfosfoglicerata na Hb v T stanju

31 Vpliv koncentracije BPG na vezavo O2 na Hb
Normalna konc. BPG v krvi na višini morske gladine ~ 5 mM Konc. BPG v krvi na višjih nadmorskih višinah ~ 8 mM

32 Modulatorji aktivnosti alosteričnega proteina Hb glede vezave O2
O2 - pozitivni homotropični modulator vezave O2 na Hb CO2, H+, BPG negativni heterotropični modulatorji vezave O2 na Hb – vsi se vežejo na Hb z obratno afiniteto kot O2

33 Najpomembnejši človeški Hb
Vrsta Struktura podenot Razširjenost HbA (odrasli) α2β2 97% Hb odraslih HbA2 (odrasli) α2δ2 2-3% Hb odraslih HbF (fetalni) α2γ2 Najpomembnejši Hb v 3. trimestru nosečnosti

34 Vezavna krivulja Hb matere in zarodka
Zaradi večje afinitete zarodkovega Hb do kisika je omogočen prenos kisika iz materine v zarodkovo kri

35 Motnje pri prenosu O2 po krvi
Vezava CO na Hb Oksidacija Fe2+ v Fe3+ Cianoza 1. Vpliv CO na vezavo O2 na Hb

36 1. Vpliv CO na vezavo O2 na Hb
Koncentracija CO v krvi odvisno od koncentracije CO v okolju Vezavne krivulje O2 na Hb Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

37 2. Oksidacija Fe2+ v Fe3+ v hemu: methemoglobim
methemoglobin ne veže O2 methemoglobin normalno prisoten do 3% oksidanti (anilinska barvila, aromatske nitro spojine, nitriti) spremenijo Fe2+ v Fe3+ obramba eritrocitov pred oksidacijo Fe2+ v Fe3+ - eritrociti vsebujejo antioksidante (askorbinska kislina, glutation) - encim methemoglobin-reduktaza reducira Fe3+ v Fe2+ (redek genski defekt: pomanjkanje reduktaze → kongenitalna methemoglobinemija; zdravljenje z barvilom mtilensko modro)

38 3. Cianoza bolnik ima sivo/škrlatno barvo kože
vzrok – visoka koncentracija deoksi-Hb pod površino zvišana koncentracija deoksi-Hb je posledica bolezni srčnega ali pljučnega sistema → slaba cirkulacija → nezadostna oksigenacija krvi anemični bolniki niso cianotični – imajo premalo Hb v krvi

39 Nenormalna tvorba Hb - bolezni
Ak zaporedje globinskih verig je določeno v globinskih genih (kromosoma 11 in 16) Znanih je ~ 1000 nenormalnih Hb Hemoglobinopatije – nastanek nenormalnih globinskih verig (primer srpasta anemija - HbS) Talasemije – globinske verige so strukturno normalne, nastajajo pa v manjši količini ali določene verige sploh ni - napaka v regulatornem delu globinskega gena (primer talasemija α, talasemija β)

40 Srpasta anemija (a) (a) normalni eritrocit vsebuje HbA
Hemoglobin A Hemoglobin S (a) normalni eritrocit vsebuje HbA (b) Okvarjeni eritrocit vsebuje HbS) (a) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

41 Vzrok za nastanek HbS (α2βS2) – mutacija v β verigi Hb: Glu → Val
HbS - nespremenjena hitrost sinteze Hb HbS - nespremenjena afiniteta do O2 HbS - hidrofobne interakcije med Val na površini  verige Hb → zlepljanje molekul HbS zmanjšana topnost HbS v deoksigenirani obliki netopni skupki HbS preprečujejo normalen pretok krvi v kapilarah

42 Srpasta anemija – heterozigoti (70% HbA in 30% HbS)
prisotnost HbS se pri normalnih razmerah sploh ne pokaže težave v velikih višinah (znižan PO2) in pri intenzivni obremenitvi rezistentni na malarijo – parazit malarije (Plasmodium falciparum) ne preživi v srpastih eritrocitih Geografska pojavnost srpaste anemije

43 Talasemije globinske verige strukturno normalne
globinske verige nastajajo v manjši količini ali določene verige sploh ni napaka v regulatornem delu globinskega gena talasemija α - napake pri nastajanju α verig talasemija β - napake pri nastajanju β verig

44 α-talasemije: teža bolezni pogojena s številom delecij gena za α-globin
Tihi nosilec α-talasemija minor 1 delecija 2 deleciji (na istem ali na različnih kromosomih) bolezen se ne zrazi ni simptomov ni kliničnih simptomov, rahla anemija Bolezen se ne i Fetalni Hb - Bartov sindrom Hemoglobin H 3 delecije 4 delecije anemija intrauterina hipoksija zarodek umre

45 β-talasemije: mutacije v β-globinski podenoti
β0 talasemija – ni β-verige β+ talasemija – zmanjšana tvorba β-verig