Funkcije proteinov Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb) Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) Oporna funkcija (strukturni proteini, npr keratini, kolagen ...) Kontraktilni proteini Membranski proteini, vključeni v transport molekul/ionov preko bioloških membran Proteini, vključeni v prenos signala (receptorji, G-proteini, kinaze ...) Obramba pred tujki/invazivnimi organizmi (Ig) Kataliza biokemijskih reakcij (encimi)

Biosignaliziranje/prenos signala (“signal transduction”) informacija (molekula iz okolja ...) celica z receptorjem celični odziv (kemični proces)

Biosignaliziranje Biološki signali so zelo raznoliki (nekaj primerov: antigeni, oligosaharidi, signali razvoja, komponente EM, rastni faktorji, hrmoni, svetloba, mehanski dotik, nevrotransmiterji, hranila, dišeče molekule, feromoni ...) Celični odgovori so različni Celice imajo le nekaj mehanizmov prenosa in spreminjanja signalov (signal transduction) Mehanizmi signaliziranja so evolucijsko ohranjeni Primeri signaliziranja - prenos živčnih signalov - odziv na hormone in rastne faktorje - zaznava slike (vid), vonja (voh), okusa - uravnavanje celičnega cikla

Značilnosti prenosa signala Specifičnost: molekulska komplementarnost med molekulo-signalom in receptorsko molekulo Ojačenje signala Izguba občutljivosti (“desensitization”) - prilagoditev na signal (“adaptation”) Integriranje signalov

Specifičnost interakcije signalne molekule z receptorjem Specifičnost vezave: – signalna molekula in vezavno mesto na receptorju sta komplementarna – selektivna vezava – visoka afiniteta → Kd <10-9 M Rec + S1 ↔ Rec·S1 Kd1 Rec + S2 ↔ Rec·S2 Kd2 Kd1 < < Kd2 S1 – molekula, komplementarna z vezavnim mestom receptorja S2 – molekula, ki ni komplementarna z vezavnim mestom

Ojačenje signala: encimska kaskada Ojačenje signala lahko poteče za nekaj redov velikosti v msek

Izguba občutljivosti/prilagoditev (“desnzitisation/adaptation”) Aktivacija receptorja sproži povratni odgovor, ki “zapre” receptor ali ga odstrani s celične površine (endocitoza)

Seštevanje (integration) signalov Če imata dva dražljaja nasprotni učinek na metabolične karakteristike, npr. koncentracija sekundarnega obveščevalca [X] ali membranski potencial Vm , je končni učinek (odziv) vsota obeh dražljajev na receptor 1 in receptor 2 odgovor

Evkariontske celice: 6 splošnih vrst mehanizmov prenosa signala 4 2 1 6 5 3 Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

6 splošnih vrst mehanizma prenosa signala: (nadaljevanje) 1. ionski kanalčki z zaporo (npr. nikotinski receptor, acetilholinski receptor) 2. membranski receptorski encimi (npr. receptor za inzulin) 3. membranski receptorji, povezani z G proteini (npr receptor za adrenalin) 4. jedrni receptorji (vežejo steroidne hormone, tiroidne hormone in vitamin D) delujejo kot transkripcijski faktorji 5. membranski receptorji, ki privlačijo in aktivirajo topne proteine (npr. proteinske kinaze) iz citoplazme 6. adhezijski receptorji, ki posredujejo informacijo med ekstracelularnim matriksom in citoskeletom

Primeri mehanizma prenosa signala: 1. ionski kanalčki z zaporo Ionski kanalčki so osnova za električno signaliziranje vzdražnih celic - ionski kanalčki, odvisni od napetosti primer: Na+ kanalček v živčnih in v živčno-mišičnih sinapsah - ionski kanalčki, odvisni od liganda primera: nikotinski receptor acetilholinski receptor

Transmembranski električni potencial K+Na+ATPaza ustvarja transmembranski potencial -60 mV depolarizacija hiperpolarizacija depolarizacija depolarizacija (b) Ioni težijo h gibanju v smeri elektrokemijskega gradienta skozi polarizirano membrano- spremembe transmembranskega potenciala Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Primer: ionski kanalček, odvisen od napetosti: Na+ kanalček v živčnih in v živčno-mišičnih sinapsah Na+ kanalčki so selektivni (K+ in Ca2+ 100 x slabše prehajata) Hitrost pretoka > 107 ionov/sek Kanalčki se odprejo kot odziv na zmanjšanje membranskega potenciala (“voltage-gated”) Hitro se inaktivirajo Kanalček sestavlja membranski protein (1 840 ak ostankov)

Primer: ionski kanalček, odvisen od napetosti: Na+ kanalček nevrona, uravnavan s transmembransko napetostjo α-podenota kanalčka – domene I, II, III, IV Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Na+ kanalček nevrona, uravnavan s transmembransko napetostjo Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Primer: ionski kanalček, odvisen od liganda: nikotinski acetilholinski receptor Receptor je bistvena komponenta električnega signala, ki se prenese od motoričnega nevrona do mišičnega vlakna (v živčno-mišični sinapsi) Naravni ligand – acetiholin (ACh) (ligand je tudi nikotin) Vezava ACh na receptor povzroči konformacijsko spremembo receptorja → odpre se ionski kanalček Kationi prehajajo v notranjost celice → depolarizacija membrane Ionski kanalček je prepusten za Na+, Ca2+ in K+ Na+ prehaja v smeri nižje konc. (2 x 10-7 ionov/s)

Primer, ionski kanalček, odvisen od liganda: acetilholinskega receptorja - Podenote: 2α, β, γ, δ; na α podenotah vezavno mesto za ACh Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Konformacijska sprememba ionskega kanalčka po vezavi acetilholina (AcH) Polarni ak ostanki Leu zaprt ionski kanalček hidrofobni –R ak levcin preprečuje pretok ionov odprt ionski kanalček – konformacijska sprememba hidrofobni –R ak levcina se je umaknil, v notranjost kanalčka se izpostavijo polarne ak Leu Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Tri stanja ACh receptorja Neaktivno (mirovanje) Aktivno (aktivacija) Neobčutljivo (desenzitizacija) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Prenos živčnega impulza hiperpolarizacija - Električni impulz (akcijski potencial) potuje od živčne celice po aksonu preko sinaps do naslednje celice - Tri vrste ionskih kanalčkov, odvisnih od napetosti: Na+, K+ in Ca2+ kanalčki - Na+ in K+ kanalčki se zaporedno odpirajo - enosmerna depolarizacija membrane - Ca2+ kanalčki se odprejo, Ca2+ sproži eksocitozo ACh - ACh se sprosti v sinaptično režo, aktivira Na+ / Ca2+ kanalčke na postsinapričnem nevronu ... acetilholin-esteraza (AChE) katalizira hidrolizo AChE → utišanje signala depolarizacija dve vrsti kanalčkov: -odvisni od napetosti -odvisni od liganda

Utišanje signala: razgradnja liganda acetilholina (ACh) z encimom acetilholin-esterazo ↔ + H2O CH3COOH + HOCH2CH2N+(CH3)3 ocetna kislina holin acetilholin

Naravni strupi, ki delujejo na ionske kanalčke – interferirajo s prenosom živčnega impulza Tetrodotoksin (riba), veže se na Na+ kanalčke in prepreči prenos impulza Saksitoksin (dinoflagelati v južnih morjih), veže se na Na+ kanalčke Dendrotoksin (mamba – afriška kača) inhibira K+ kanalčke Tubokurarin, (aktivni strup kurare-ja, s katerim so ob Amazonki zastrupljevali puščice), veže se na ACh receptor Kobratoksin in bungarotoksin (kačja strupa), vežeta se na ACh-receptor z visoko afiniteto (Kd = 10-15 M) in inhibirata prenos impulza

Strukture nekaterih naravnih strupov, ki inhibirajo ionske kanalčke Tetrodotoksin

Bolezni, ki izvirajo iz okvar ionskih kanalčkov Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Nevroni vsebujejo ionske kanalčke, ki se odzivajo na različne nevrotransmiterje – primeri: ionski kanalček ACh Na+, Ca2+ glicin Cl- serotonin Na+, K+, Ca2+ glutamat

Evkariontske celice: 6 splošnih vrst mehanizmov prenosa signala 4 2 1 6 5 3

Primeri mehanizma prenosa signala: 2 Primeri mehanizma prenosa signala: 2. membranski receptorski encimi – receptor za inzulin Tyr inzulinski receptor – tetramer 2α, 2β zunajcelični del α – vezavno mesto za inzulin znotrajcelični del β – kinazna encimska aktivnost, sledi fosforilacija subatrata IRS in nadaljnje interakcije med proteini Po vezavi inzulina se izvrši avtofosforilacija inzulinskega receprtorja na Tyr  podenote znotraj celice Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Aktivna domena – 3 tyr ostanki Aktiviranje inzulinskega receptorja – tirozinske kinaze z avto-fosforilacijo→sprememba konformacije Neaktivna domena tirozinske kinaze Aktivna domena – 3 tyr ostanki fosforilirani Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Osnovni učinki inzulina Hitri (sekunde): pospešen transport glukoze, ak in K+ v celice, občutljive na inzulin Srednje hitri (minute): - stimulacija sinteze, inhibicija razgradnje glikogena - stimulacija sinteze, inhibicija razgradnje proteinov - stimulacija razgradnje, inhibicija sinteze glukoze Zapozneli (ure): povišana koncentracija encimov, ki sintetizirajo lipide inzulin

Inzulin uravnava prenos prenašalca glukoze v miocitu (hitri učinek inzulina) Nelson DL, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

transkripcijski faktor Uravnavanje ekspresije gena z inzulinom (počasni učinek) IRS-1 insulin receptor substrat adaptorski protein kinaze inzulinski receptor Raf MEK ERK Ras G protein transkripcijski faktor trankripcija genov, ki kodirajo encime, vključene v metabolizem glukoze Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Evkariontske celice: 6 splošnih vrst mehanizmov prenosa signala 4 2 1 6 5 3

Primeri mehanizma prenosa signala: 3 Primeri mehanizma prenosa signala: 3. membranski receptorji, sklopljeni z G proteini Sestavine signaliziranja preko receptorjev, sklopljenih z G proteini Receptor s 7 transmembranskimi α-vijačnicami zazna signalno molekulo S Protein, ki veže gvanozinski nukleotid - heterotrimerni G protein (podenote Gα, Gβ, Gγ) Encim v membrani, ki katalizira reakcijo nastanka sekundarnega obveščevalca, npr. adenilatna ciklaza (AC) → cAMP, fosfolipaza C (PLC) → IP3 S encim produkt - sekundarni obveščevalec substrat

3. membranski receptorji, sklopljeni z G proteini - ojačenje signala (kaskadna reakcija) AC, PLC ... G protein receptor cAMP, cGMP ... fosforilacija Vezava signala na receptor aktivira več molekul G proteinov Vsaka G podenota aktivira več encimov (efektorjev) Vsak encim katalizira nastanek več molekul sek. obveščevalcev Vsak sek. obveščevalec aktivira več encimov kinaz Vsaka kinaza fosforilira (aktivira) več encimov, vlkjučenih v določeno metabolično pot aktivni encimi

3. membranski receptorji, povezani z G proteini Sekundarni obveščevalci, si se sintetizirajo po aktivaciji G-proteinov - nekaj primerov cAMP, cGMP - delovanje nekaterih hormonov, npr. adrenalin - delovanje svetlobe (molekulske osnove vida) - delovanje dišečih molekul (molekulske osnove vonja) - delovanje okusnih molekul (molekulske osnove okusa) diacilglicerol (DAG), inozitol-3-fosfat (IP3) in Ca2+

Primer signaliziranja preko G proteinov: signal adrenalin β-adrenergični receptor veže adrenalin → cAMP → aktivirana proteinske kinaze → aktivirana metabolična pot (razgradnja glikogena) kot celični odgovor Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Nastanek sekundarnega obveščevelca cAMP ATP → cAMP + PPi

Utišanje signala, ki ga je sprožil adrenalin in ki deluje preko cAMP Hidroliza cAMP s fosfodiesterazo Hidroliza GTP z endogeno GTPazno aktivnostjo Gα podenote Desenzitizacija receptorja z arestinom 1. hidroliza cAMP s fosfodiesterazo cAMP adenozin 5‘-monofosfat (AMP)

2. Hidroliza GTP z endogeno GTPazno aktivnostjo Gα podenote Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

3. Desenzitizacija signaliziranja β-adrenergičnega receptorja z arestinom -adrenergična arestinska kinaza (-ARK) arestin endocitoza Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Signali, ki uporabljajo cAMP kot sekundarni obveščevalec Kortikotropin Adrenalin Glukagon Histamin Lutenizirajoči hormon Dišeče molekule Prostaglandini Somatostatin Molekule okusa Hormon, ki stimulira ščitnico kortikotropin Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Primer signaliziranja preko G proteinov Inozitol-3-fosfata (IP3) kot sekundarni obveščevalec Aktiviranje fosfolipaze C (PLC) s hormonom in delovanje IP3 na ionske kanalčke za Ca2+ v membrani endoplazmatskega retikuluma Encim: fosfolipaza C Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Dražljaji, ki se prenašajo preko fosfolipaze C in IP3 Peptid, ki sprošča gastrin Glutamat (signaliziranje v možganih) Gonadotropin-sproščujoči hormon (hipofiza) Histamin Oksitocin Vazopresin Serotonin Tirotropin-sproščujoči hormon

Kalmodulin – proteinski posrednik pri mnogih encimskih reakcijah, ki jih stimulira Ca2+ Aktivnost nekaterih proteinov uravnavata Ca2+ in kalmodulin Adenilil-ciklaza (možgani) Ionski kanalčki za Ca2+ v sarkoplazmatskem retikulumu cAMP fosfodiesteraza Ionski kanalčki, odvisni od cAMP pri sprejemanju vonja Miozinske kinaze Sintaza NO Ca2+ ATPaza v plazemski membrani Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Primer signaliziranja preko G proteinov: Sprejem svetlobe v očesu vretenčarjev Struktura očesa

Struktura paličnic diski

Protein rodopsin v membrani diska citosol notranjost retinal

Indukcija hiperpolarizacije celic paličnic s svetlobo → → → razgradnja cGMP → zaprtje ionskih kanalčkov aktiviranje s svetlobo stanje mirovanja Paličnica, za svetlobo občutljiva čutna celica v mrežnici, ki sestoji iz paličke, perikariona in nevrita Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Interakcija med rodopsinom (receptor za svetlobo) in transducinom (G protein) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Vitamin A in njegovi produkti izomerizacija 11-cis-retinala v trans retinal pod vplivom svetlobe - prvi v zaporedju dogodkov v vidnem ciklu → konformacijska sprememba rodopsina ...

Molekulski dogodki, ki jih sproži svetloba v diskih Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Absorpcijski spektri rodopsina in rdečih, zelenih in modrih receptorjev celic čepkov Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Konzervirane Daltonove oči John Dalton ni razlikoval barv. Po njegovi smrti 1844 so konzervirali njegove oči in leta 1990 analizirali DNA – primerjava nukleotidnih zaporedij različnih opsinov (barvnih pigmentov). Ugotovitev: ni bilo gena za pigment za absorpcijo svetlobe zelene barve Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Značilnosti sistemov signaliziranja kot odziv na hormone, svetlobo, vonj in okus Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Inaktiviranje G proteinov z bakterijskimi toksini: ADP-ribozilacija G podenote → inhibicija signalne poti Bakterijski toksini – encimi, ki katalizirajo ADP-ribozilacijo G proteinov – povzročijo oslovski kašelj (Pertussis toxin) in kolero (Cholera toxin)

Nekatere skupne značilnosti signalnih poti, ki vključujejo sekundarni obveščevalec: Vezava signalne molekule na receptor v plazemski membrani sproži interakcije protein-protein (sodelujoči proteini so receptorji, adaptorji, encimi (kinaze) → → nastanek majhne molekule – sekundarnega obveščevalca (“second messenger”) - hidrofilni sekundarni obveščevalci: cAMP, cGMP, IP3, Ca2+ - hidrofobni sekundarni obveščevalci: diacilglicerol, fosfatidil-inozitol fosfati → aktivacija določene signalne poti – biološki odgovor celice Kaskadne reakcije (ojačanje signala) znotraj celice po vezavi signalne molekule na receptor v membrani

Evkariontske celice: 6 splošnih vrst mehanizmov prenosa signala 4 2 1 6 5 3

Primeri mehanizma prenosa signala: 4 Primeri mehanizma prenosa signala: 4. jedrni receptorji, ki vežejo steroidne in tiroidne hormone, vitamin D in retinoide Hormon sproži biološki odgovor v odzivnih tkivih, ki vsebujejo jedrne receptorje za hormon Hormon se veže na receptor z visoko afiniteto (Kd ≈ 10-9 M) in specifičnostjo v kompleks hormon-receptor Ob vezavi hormona se receptor konformacijsko spremeni, na njem se odkrije vezavno mesto za DNA, kompleks se veže na specifična mesta na DNA (HRE, hormone responsive element) in s tem uravnava (aktivira) prepisovanje določenih genov; s hormonom aktivirani receptor deluje kot transkripcijski faktor, RNA-polimeraza sintetizira mRNA Informacija se prenese do ribosomov, kjer se sintetizira določen protein kot odgovor na signal - hormon

Uravnavanje ekspresije genov z jedrnimi receptorji Ligandi, ki aktivirajo jedrne receptorje 1,25 dihidroksi -holekalciferol tiroksin Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Mehanizem delovanja steroidov genomsko delovanje preko steroidnih receptorjev znotraj celice (“klasična” signalna pot steroidov) negenomsko delovanje preko steroidnih receptorjev v plazemski membrani (v novejšem času odkrita signalna pot steroidov)

Motnje v biosignaliziranju: izražanje onkogenov Onkogeni so mutirane oblike genov, ki kodirajo proteine, ki uravnavajo celični cikel Odkriti v virusih, ki povzročajo tumorje Virusni onkogeni zelo podobni genom v živalih – gostiteljicah virusov, protoonkogenenom Protoonkogeni kodirajo proteine, ki uravnavajo celično rast Med virusno infekcijo se lahko protoonkogen vgradi v virusni genom in se spremeni (mutacije, skrajšanje gena) Ob naslednji infekciji virusa se mutirani protoonkogen – onkogen - izrazi v celici-gostiteljici, kjer prepreči normalno uravnavanje rasti celice → rakava rast

Onkogeni: pretvorba regulatornega gena v virusni onkogen Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Vzroki za pretvorba protoonkogenov v onkogene Virusna infekcija Prerazporeditev kromosomov Kemične učinkovine UV sevanje Mutacija, ki privede do onkogenov, je genetsko dominantna

Primer onkogena, ki kodira okrnjen receptor za epidermalni rastni faktor (EGF) – motnja v odzivu na zunanji stimulus - stalno aktivirana signalna pot Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Signaliziranje, ki uravnava mitozo Vse evkariontske celice – ohranjen mehanizem uravnavanja mitoze Intenzivna delitev celic poteka med med embrionalnim razvojem; v odraslem organizmu počasna delitev celic Celično delitev uravnavajo zunanji rastni faktorji Vstop celice v celično delitev (celični cikel) in prehod iz ene v drugo fazo cikla uravnavajo proteinske kinaze/ fosforilacija proteinov Če so regulatorni mehanizmi, ki uravnavajo delitev celic okvarjeni, sledi nekontrolirana rast → rakava rast Mitóza je proces pri delitvi jedra somatskih celic, sestavljen iz niza faz, ki zagotavlja ohranitev enakega števila kromosomov in množine DNA v na novo nastalih jedrih, sledi delitev citoplazme (citokineza), Slovenski medicinski slovar 2004