Ravni strukture proteinov Primarna struktura Sekundarna struktura Terciarna struktura Kvartarna struktura (oligomerni proteini) primarna sekundarna terciarna kvartarna struktura zaporedje 3D zvitje asociacija več ak ostankov α-vijačnica polipeptidne verige polipeptidnih verig (podenot) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Ravni strukture proteinov Primarna struktura: zaporedje aminokislinskih (ak) ostankov v polipeptidni verigi Sekundarna struktura – nanaša se na lokalno konformacijo (bližnji ak ostanki) nekaterih delov polipeptida; primeri: - α-desnosučna vijačnica - β-struktura (paralelna, antiparalelna, mešana) - β-zavoj Terciarna struktura – trodimenzionalna (3D) struktura polipeptidne verige v prostoru Kvartarna struktura – 3D struktura več polipeptidnih verig (podenot), ki sestavljajo molekulo proteina (oligomerni proteini)

Primarna struktura proteinov: ak zaporedje v polipeptidni verigi Frederich Sanger 1958 Nobelova nagrada za kemijo – področje sekvenciranja proteinov Identifikacija sproščenih ak z metodo HPLC Princip: postopno odcepljanje označene ak z N-terminalnega dela polipeptidne verige

Glede na podobnost v zaporedju ak ostankov v polipeptidnih verigah razvrstimo proteine v družine in naddružine Družine – velika podobnost v ak zaporedju (primarna struktura) in/ali v terciarni strukturi in funkciji (npr. globinski motiv). Proteini ene družine kažejo evolucijsko bližino organizmov. Naddružine – dve ali več družin, katerih proteini ne kažejo podobnosti v ak zaporedju, imajo pa iste/podobne vzorce zvitja (motive) in opravljajo podobno funkcijo.

Informacije, ki jih dobimo iz znane primarne strukture proteinov Primerjava primarne strukture proteinov → predvidevanje podobnosti glede strukture in funkcije proteinov. vrzel Primer: pravnava ak zaporedja dela proteina EF-Tu bakterij E.coli in Bacillus subtillis Dve zaporedji sta homologni, če kažeta zaporedji visoko stopnjo podobnosti; izhajata iz istega gena Konzervativna substitucija ak pomeni, da je prišlo do zamenjave ene ak z drugo, enako polarno ak (konzervativna substitucija je pogosta pri proteinih različnih živalskih vrst) Če se določena ak nahaja na istem položaju v različnih proteinih – “invariant residues” - nespremenljivi ak ostanki; ti imajo ključno vlogo pri določanju strukture/funkcije proteina vrzel

Trodimenzionalna (3D) struktura proteinov – konformacija (razporeditev vseh atomov v prostoru) 3D struktura je določena z ak zaporedjem polipeptida Izolirani protein običajno obstaja v eni ali le nekaj stabilnih oblikah (nativna konformacija, ki odraža funkcijo proteina; je na najnižjem energijskem nivoju, G min.) Za stabilizacijo strukture so najpomembnejše šibke interakcije in v nekaterih primerih kovalentne disulfidne vezi (-S-S- mostički) Le nekaj različnih osnovnih strukturnih vzorcev najdemo v tisočih naravnih proteinih Funkcija proteina je odvisna od njegove strukture

Dejavniki, ki določajo 3D strukturo proteina

Interakcije med ak ostanki v 3D strukturi proteina ionske interakcije vodikove vezi disulfidni mostički hidrofobne interakcije

Nativna konformacija hipotetičnga proteina, kjer je prikazan pomen nekovalentnih interakcij v 3D strukturi proteina Boyer R: Temelji biokemije, Študentska založba Scripta, Ljubljana 2005

Interakcije, ki vzdržujejo konformacijo proteinov – primeri Disulfidni mostiček Vodikove vezi Elektrostatske interakcije

Zvijanje polipeptidne verige je omejeno z naslednjimi zahtevami dolžine vezi med atomi in koti med vezmi naj bodo čim manj deformirani atomi se ne morejo približati bolj, kot je vsota njihovih van der Waals-ovih radijev zvitje proteinov je stabilizirano s šibkimi interakcijami (vodikove, hidrofobne, van der Waalsove, ionske interakcije) zaradi omejitev, ki jo predstavlja toga amidna/peptidna vez (ni možna rotacija okrog CO-NH vezi), je dovoljena samo rotacija okrog enojnih vezi N-Cα in Cα-CO

Enojni/dvojni značaj vezi v peptidni skupini Ravnotežje med resonančnimi oblikami Del polipeptidne verige s poudarjenimi ravninami (modro), v katerih ležijo atomi peptidnih vezi C

Cis-trans izomerija peptidne vezi Prostorska orientacija atomov peptidne vezi in relativna orientacija ravnin, v katerih ležijo peptidne vezi Rotacija okrog enojnih vezi peptidne skupine Cis-trans izomerija peptidne vezi (99,95%) Možne rotacije kotov  in  za +1800 in -1800 “prepovedana” vrednost kotov  in  zaradi prostorskih (steričnih) ovir Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Zaporedje planarnih peptidnih skupin (kota Φ, C–NH in Ψ, C–CO, zavzemata 180°) Dogovor: kota Φ in Ψ zavzemata 1800, če je polipeptid v popolnoma iztegnjeni konformaciji in ležijo vse peptidne skupine v eni ravnini Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Ramachandranov diagram – soodvisnost vrednosti kotov Φ in Ψ belo področje – nedovoljene konformacije obarvano področje – različne proteinske strukture

Ravni strukture proteinov Primarna struktura Sekundarna struktura – nanaša se na lokalno konformacijo (bližnje ak) nekaterih delov polipeptida - α-desnosučna vijačnica - β-struktura (paralelna, antiparalelna, mešana) - β-zavoj Terciarna struktura Kvartarna struktura (oligomerni proteini)

Sekundarna struktura: desnosučna α-vijačnica Interakcije, ki jo vzdržujejo: vodikove vezi, elektrostatske in hidrofobne interakcije med ak radikali Elektrostatske interakcije Pro in Gly redko v α-vijačnici Položaj radikalov –R pogojuje njihove medsebojne interakcije vodikove vezi

Sekundarna struktura: desnosučna α-vijačnica Pogled v smeri osi α-vijačnice 3,6 ak / zavoj Φ = -600 Ψ med -450 in -500 Pogled v smeri s strani Vodikove vezi tvorijo kisikovi atomi karbonilnih skupin (-CO-) in vodikovi atomi –NH– skupin vseh peptidnih vezi Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Dejavniki, ki vplivajo na stabilnost α-vijačnice Elektrostatski odboji/privlaki med –R zaporednih ak ostankov v polipeptidu Sterične motnje med velikimi –R zaporednih ak ostankov v polipeptidu Interakcije med –R ak, ki so oddaljene za 3 oz. 4 ak v zaporedju (elektrostatski odboji/privlaki, hidrofobne interakcije, sterične ovire) Pojav Gly ali Pro (redko v α-vijačnici) Interakcije med nabitimi ak na konceh polipeptidne verige, kjer je ustvarjen električni dipol (– na C-koncu in + na N-koncu)

Sekundarna struktura: β-struktura (β-konformacija, β-naguban list) Interakcije, ki jo vzdržujejo: vodikove vezi med sosednjimi polipeptidnimi verigami Glicin in alanin sta pogosti ak v β-strukturi Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Primer β-strukture: fibroin (β-keratin) svile ali pajkove mreže Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Sekundarna struktura: β-zavoj Interakcije, ki vzdržujejo strukturo: vodikove vezi med 1. in 4. ak ostankom V β-zavoju se 6% Pro nahaja v cis-konfiguraciji Glicin in prolin sta pogosti ak v β-zavoju Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Relativna verjetnost za pojavljanje določene ak v treh vrstah sekundarne strukture Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Ramachandranov diagram: vrednosti kotov (psi)  in  (phi) v nekaterih sekundarnih strukturah

Nivoji strukture proteinov Primarna struktura Sekundarna struktura Terciarna struktura – 3D razporeditev vseh atomov proteina, konformacija – vključuje tudi interakcije med oddaljenimi ak in ak, ki so v različnih vrstah sekundarnih struktur. Vzdržujejo jo šibke interakcije in -S-S- mostički. Kvartarna struktura (oligomerni proteini)

Primerjava oblike in velikosti proteina, sestavljenega iz istega št Primerjava oblike in velikosti proteina, sestavljenega iz istega št. ak ostankov Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Razvrstitev proteinov po strukturi Fibrilarni proteini dolga nitasta struktura, netopni v vodi Globularni proteini “kroglasta” oblika, topna v vodi   struktura različne sekundarne strukture struktura sekundarna struktura ene vrste funkcija encimi, regulatorni proteini, transportni proteini funkcija strukturna opora celicam in tkivom (sesalci) zunanja opora organizma (žuželke...)

Terciarna struktura proteinov– primer globularnega proteina: mioglobin (različne predstavitve) Mr 16 700 153 ak prostetična skupina hem kompaktna molekula hidrofobne ak znotraj hidrofilne ak na površini Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Terciarna struktura – primeri globularnih proteiov: citokrom c, lizocim, ribonukleaza 104 ak lizocim 129 ak ribonukleaza 124 ak Strukturo globularnih proteinov stabilizirajo: hidrofobne interakcije (tudi Van der Waalsove) v notranjosti molekule vodikove interakcije na površini molekule pri majhnih globularnih proteinih je veliko število disulfidnih mostičkov Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Terciarna struktura proteinov – delež sekundarnih struktur v nekaterih globulatnih proteinih Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Terciarna struktura proteinov - zvitje proteinov je osnova za strukturno klasifikacijo globularnih proteinov (podatkovna baza SCOP – Structural Clasification of Proteins) Do danes znanih ~1000 različnih zvitij. Terciarna struktura je bolj ohranjena kot primarna struktura (znana 3D struktura več kot 10 000 proteinov) Primerjava terciarne strukture proteinov → podatki o evolucijski oddaljenosti organizmov Isti strukturni motivi (zvitja) v različnih proteinih opravljajo podobno funkcijo, npr. vezava ligandov, vezava drugih proteinov... Primeri zvitja proteinov: povezava  struktur križna povezava  struktur -sodček -- zanka  -  kot Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Terciarna struktura proteinov: Domene globularnih proteinov Domena: stabilna globularna enota v molekuli proteina

Razvrstitev proteinov V družine – velika podobnost v ak zaporedju (visoka stopnja homologije) in/ali v terciarni strukturi in funkciji (npr. globinski motiv). Proteini ene družine kažejo evolucijsko bližino organizmov. V naddružine – dve ali več družin, katerih proteini ne kažejo podobnosti v ak zaporedju, imajo pa iste/podobne vzorce zvitja (motive) in opravljajo podobno funkcijo.

Kako določiti 3D strukturo proteina? Uklon Rtg žarkov na kristalu proteina Nuklearna magnetna resonanca (NMR), protein v raztopini → metoda omogoča identifikacijo različnih konformacij proteina (merjenje jedrnega spinskega kotnega momenta – kvantnomehanska funkcija, ki jo vsebujejo nekatera jedra: (1H, 13C, 15N, 10F, 31P)

Uklon Rtg žarkov na kristalu proteina Izvor Rtg žarkov (X žarkov) Snop Rtg žarkov Kristal proteina Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Analiza 3D strukture mioglobina z NMR Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Ravni strukture proteinov Primarna struktura Sekundarna struktura Terciarna struktura Kvartarna struktura – oligomerni proteini (več polipeptidnih verig – podenot/protomerov, povezanih s šibkimi interakcijami) - dimer - oligomer (npr. tetramer) - multimer - različne podenote, asimetrična struktura - enake podenote ali skupki podenot, simetrična struktura;

Kvartarna struktura: proteini iz več podenot (protomerov) – multimeri Dimer – 2 podenoti Oligomer – 4-8 podenot (npr. tetramer) Multimer – večje št. podenot - različne podenote, asimetrična struktura - enake podenote ali skupki podenot, simetrična struktura; - rotacijska simetrija - podenote se prekrijejo z rotacijo okrog določene osi simetrije molekule – kompaktna struktura - vijačna (helična) simetrija – podenote se dodajajo na način vijačnice (odprta struktura)

Kvartarna struktura proteinov Simetrija multimernega proteina Rotacijska simetrija - podenote se prekrijejo z rotacijo okrog določene osi simetrije molekule – kompaktna struktura Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Kvartarna struktura proteinov - simetrija multimernega proteina - primer: virusni plašč Poloivirus rotacijska simetrija Virus tobačnega mozaika vijačna (helična) simetrija – podenote se dodajajo na način vijačnice (bolj odprta struktura)

Kvartarna struktura proteinov - nekatere funkcije proteinov iz več podenot Regulatorna vloga: vezava liganda sproži interakcije med podenotami → velika sprememba v aktivnosti proteina kot odraz na majhne spremembe konc. regulatornih molekul. (Primer: hemoglobin) Strukturna vloga: asociacija fibrilarnih proteinov v višjo strukturo. (Primer: kolagen) Kataliza večstopenjskih reakcij. (Primer: ribosom) hemoglobin

3D struktura proteinov – denaturacija in zvitje; denaturacija/renaturacija proteinov Denaturacija: porušenje 3D strukture (terciarne, kvartarne) proteina, s tem tudi izguba njegove funkcije Vzroki za denaturacijo: - povišana temperatura (poruši šibke interakcije, predvsem H-vezi) - sprememba pH (spremenijo se elektrostatske interakcije med nabitimi –R in H-vezi) - organska topila kot etanol in aceton (porušijo se predvsem hidrofobne interakcije) - spojine kot je urea in gvanidin-hidroklorid, detergenti (porušijo se predvsem hidrofobne interakcije) Renaturacija: odvzamemo vzrok za denaturacijo

3D struktura proteinov - Primer: denaturacija in renaturacija RNAze nativno stanje, katalitično aktivno reducent, ki poruši disulfidne mostičke dodatek uree in reducenta razvito stanje, neaktivno; disulfidni mostički reducirani v Cys (-SH) odstranitev uree in reducenta Nativno, katalitično aktivno stanje, disulfidne povezave na pravih mestih Renaturacija denaturirane RNAze - prvi dokaz (1950), da je z ak zaporedjem v polipeptidni verigi določena 3D struktura proteina

Razvitje (denaturacija) proteina odvisno od pogojev v okolju Določitev temperature tališča proteina Tm

3D struktura proteinov - kako poteka zvitje polipeptida? Hipoteza I : postopno zvitje polipeptida; lokalno se ustvarijo sekundarne strukture → supersekundarna struktura → domene → nativni protein (kooperativni proces) Hipoteza II: zvitje se prične s spontanim kolapsom polipeptida v kompaktno stanje – “molten globule”/razrahljani klobčič - hidrofobni kolaps Hipoteza III: Polipeptidi se zvijejo s pomočjo drugih molekul, šaperonov, ki usmerjajo in pospešujejo proces zvijajna. Šaperoni so v vseh kraljestvih (eubacteria, archaea in eukariontih) ------------------------------------------ Zvijanje proteina je zelo hiter proces; E. coli naredi aktivno molekulo proteina iz 100 ak v 5 sek; ni naključen proces, gre za vodeno zvijanje polipeptidne verige. (Če bi bil proces povsem slučajen, 1077 let)

Kako poteka zvitje polipeptida? Hipoteza I: postopno zvitje polipeptida Lokalno se ustvarijo sekundarne strukture → supersekundarna struktura → domene → nativni protein (kooperativni proces) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Kako poteka zvitje polipeptida Kako poteka zvitje polipeptida? Hipoteza II: zvitje polipeptida poteka po”lijaku proste energije” (TD vidik) Stanje razrahljanega klobčiča Cilj zvitja proteina je nastanek maksimalnega števila šibkih interakcij (vodikovih, hidrofobnih, Van der Waalsovih, ionskih) - stabilna konformacija

Kako poteka zvitje polipeptida Kako poteka zvitje polipeptida? Hipoteza III: šaperoni pomagajo pri zvijanju polipeptida proteini toplotnega šoka (hsp) šaperon Primer: šaperon bakterije Thermus thermophilus

Kako poteka zvitje polipeptida Kako poteka zvitje polipeptida? Hipoteza III: šaperoni pomagajo pri zvijanju polipeptida V nekaterih primerih je za zvijanje proteina s pomočjo šaperonov potrebna energija (hidroliza ATP)

Napake v zvitju polipeptida vodijo do nekaterih bolezni Cistična fibroza – okvarjen je membranski protein, ki je odgovoren za prenos Cl- Bolezni vezivnega tkiva – okvarjen strukturni protein kolagen Prionske bolezni, TSE (Transmissible Spongiform Encephalopathies) spremenjena konformacija proteina priona (proteinaceous infectious only), Mr = 28 000. “nore” krave kuru

Napake v zvitju polipeptida primer: Prionska bolezen Stanley Prusiner 1997 Nobelova nagrada za medicino in fiziologijo za odkritje prionov – nov princip infekcije: napačno zviti proteini, ki povzročijo degenerativne spremembe v živčnem tkivu Prioni prisilijo druge proteine, da sodelujejo → infekcija se širi → degenerativne spremembe in smrt celic 1972 pacient umrl zaradi CJD, Prusiner iz možganov izoliral protein prion Izolirali protein z visoko stopnjo homologije iz možganov živali s sorodno boleznijo 3D struktura priona miši in hrčka

Lastnosti prionov Prioni so neobčutjivi na Rtg žarke, proteinaze, RNAze, DNAze Prioni so normalna, funkcionalna komponenta živčnih celic – sodelujejo pri specifičnem prenosu signala v možgani Prionske bolezni so dedne, infekcijske ali sporadične CJD: Histopatološka slika prednjega možganskega režnja – gobasta degeneracija (Spongiophorm Encephalophathia) A. Barvanje s Schiffovim barvilom B. Detekcija prionov s protitelesi

Prioni – povzročitelji degenerativnih sprememb možganov izvor bolezen mehanizem prenosa človek kuru Infekcijski ritualni kanibalizem CJD (Creutzfeldt-Jakobova bolezen) Infekcija z BSE, genska okvara, somatska mutacija GSS (Gerstmann-Straussler-Scheineker bol.) Mutacija gena za prion FFI (Fatal Familial Insomnia) Infekcija od ovc ali goveda ovca praskavica (scarpie) Kanibalizem, infekcija s PrPSc govedo BSE (Bovine Spongioform Encephalophathia)

Model 3D struktura priona PrPc, normalna molekula; PrPSc, infektivna molekula Ak zaporedje PrPc in PrPSc je isto. Vzrok za spremembo 3D strukture priona ni znan. Ena izmed hipotez: okvarjen protein X, ki sodeluje kot šaperon pri normalnem zvitju PrPc

Preprečevanje in zdravljenje prionskih bolezni Preprečiti je treba pretvorbo PrPc v PrPSc Droge, ki stabilizirajo PrPc , ki naj bi se vezale na normalni protein in ga s tem zaščitila Droge, ki stabilizirajo šaperon protein X Droge, ki destabilizirajo 3D strukturo PrPSc Droge, ki zmotijo interakcijo med PrPc in PrPSc Droge, ki upočasnijo ekspresijo gena za PrP