Μεμβρανική Βιοφυσική Χ. Λαμπρακάκης 2015

Μεμβρανική Βιοφυσική: μελέτη των κυτταρικών μεμβρανών με φυσικοχημικές μεθόδους

Μεμβρανικοί δίαυλοι: Δομή και λειτουργία Κυτταρική φυσιολογία

λιπιδιακή διπλοστιβάδα (μηχανική, πιέσεις, ροή λιπιδίων και πρωτεϊνών, σύντηξη) μεμβρανικοί υποδοχείς (που δεν είναι δίαυλοι) αντλίες ιόντων και μεταφορείς μικρομορίων άλλες πρωτεΐνες

Ερωτήματα Είναι όλες οι μεμβράνες ίδιες; Διαφέρουν οι ιδιότητες της μεμβράνης απο κύτταρο σε κύτταρο; Διαφέρουν οι ιδιότητες της μεμβράνης σε περιοχές του ίδιου κυττάρου; Τι προσφέρουν στη λειτουργία των κυττάρων η μεγάλη πληθώρα διαύλων; Γιατί χρησιμοποιούνται διαφορετικά ιόντα; Πώς η κίνηση των ιόντων διαμέσου των διαύλων σε συδυασμό με το δυναμικό της μεμβράνης συμβάλλουν στη παράγωγή, διαχειρίση και επεξεργασία βιολογικής πληροφορίας Πως οι ιδιότητες της μεμβράνης και των διαύλων της επηρεάζουν τη λειτουργία των κυττάρων Πως η λειτουργία του κυττάρου επηρεάζει της ιδιότητες της μεμβράνης και των διαύλων Πως η δυσλειτουργία των διαύλων οδηγούν στη παθογένεση ασθενειών; Πως η ροή ιόντων και το δυναμικό της μεμβράνης επιτυγχάνουν στη δημιουργία πολύπλοκων λειτουργιών όπως η μνήμη ή η συνείδιση;

εργαστηριακές ασκήσεις Προσωρινό πρόγραμμα Εισαγωγή Τεχνικές και Μεθόδοι Οι ηλεκτρικές ιδιότητες της κυτταρικής μεμβράνης (3 ασκήσεις) Η δομή των ιονικών διαύλων Το δυναμικό ενέργειας και το μοντέλο των Hodgkin και Huxley (2 ασκήσεις) Ηλεκτροφυσιολογικά χαρακτηριστικά των διαύλων Ι. Τασεοελεγχόμενοι δίαυλοι. Ηλεκτροφυσιολογικά χαρακτηριστικά των διαύλων ΙI. Συνδεματικοί δίαυλοι. Φαρμακολογία ιονικών διαύλων. Μοριακή, κυτταρική και εξελικτικήβιολογία ιονικών διαύλων εργαστηριακές ασκήσεις Χρήση του περιβάλλοντος προσομοίωσης NEURON για τη μελέτη μεμβρανών, διαύλων, κυττάρων και νευρικών δικτύων

διαφάνειες παρακουλούθηση ερωτήσεις εργασία τεστ

Βιβλία Βιβλιογραφία απο ερευνητικά άρθρα και άρθρα ανσκόπησης Μοντέρνες ερευνητικές τεχνικές διαδίκτυο κ.α.

Βαθμολογία Τέστ (πρόοδος) αναθέσεις ασκήσεων προσομοίωσης Προετοιμασία - παρουσίαση εργασίας 50 % 5% 45 %

Εργασία Συνθετική εργασία με βάση 3–4 πρωτότυπων ερευνητικών άρθρων Προφορική παρουσίαση (20 min) επιλογή θέματος της αρεσκείας σας, αλλά σχετικό με το μάθημα αναζήτηση πρωτότυπων άρθρων συζήτηση με τον διδάσκοντα πανω στο θέμα/άρθρα παρουσίαση συμπερασμάτων απο την ανασκόπιση και σύνθεση των άρθρων

ΗΜΕΡ 13-14/02 20/02 Εισαγωγή 06-07/03 Τεχνικές και Μεθόδοι 13-14/03 Ηλεκτρικές ιδιότητες της μεμβράνης (Ασκ. 1) 20-21/03 Ηλεκτρικές ιδιότητες της μεμβράνης (Ασκ. 2) 27-28/03 Ηλεκτρικές ιδιότητες της μεμβράνης (Ασκ. 3) 03-04/04 Δομή ιοντικών διαυλων 24-25/04 Το δυναμικό ενέργειας (Ασκ 4) 02/05 Το δυναμικό ενέργειας (Ασκ 5) 08-09/05 Τασεοελεγχόμενοι δίαυλοι 15-16/05 Συνδεματικοί δίαυλοι 22-23/05 Φαρμακολογία διαύλων 29-30/05 Μοριακή και κυτταρική βιολογία διαύλων Παρουσιάσεις

Ποιές οι λειτουργίες της μεμβράνης; Η κυτταρική μεμβράνη περιβάλλει τα κύτταρα Τα οριοθετεί απο το εξωκυττάριο περιβάλλον Προστασία του ενδοκυτταρικού περιβάλλοντος Αποτελεί φραγμό στην ελεύθερη διάχυση μορίων & ιόντων (επιτρέπει όμως την εκλεκτική μεταφορά) Μηχανική υποστήριξη

Ιοντικοί Δίαυλοι* Πρωτεϊνικά μακρομόρια διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη Δημιουργούν δίαυλους (H2O) διαπερατά σε ιόντα Επικοινωνία ενδο-εξω-κυτταρικού περιβάλλοντος * = μεμβρανικοι δίαυλοι/κανάλια/πόροι

Πιστευόταν ότι έπαιζαν ρόλο μόνο σε διεγέρσιμες μεμβράνες (νευρικά & μυικά κύτταρα) Αλλά βέθηκαν καί σε μή διεγέρσιμα κύτταρα όπως: ηπατοκύτταρα εξωκρινή κύτταρα αδένων

ηλεκτρική δραστηριότητα στο Ε. coli Επιπλέον βρέθηκαν ... Και σε φυτά Βακτήρια Μύκητες πρωτόζωα Μετάδωση κίνησης των φύλλων για μιμόζα Mimosa pudica ηλεκτρική δραστηριότητα στο Ε. coli

‘Εξελικτικό δένδρο’ διαύλων Οι ιοντικοί δίαυλοι σε όλο το φάσμα της εξέλιξης των ειδών

Σχέσεις συγγένειας μεταξύ μεμβρανικών δίαυλων απο την αλληλουχία γονίδιου/πρωτεϊνης Οικογένειες δίαυλων - όνομα

Η σημασία της μελέτης των μεμβρανικών δίαυλων Γνώση λειτουργίας βιολογικών συστημάτων Φυσιολογικής Παθολογικής Ευκαιρίες φαρμακευτικής αγωγής για θεραπείες Σημαντικό ρόλο στο νευρικό σύστημα Διάδοση του πληροφορίας (γρήγορα και πιστά) αισθητήρια -> εγκέφαλος -> μύες Μετάδοση πληροφορίας απο το ένα κύτταρο στο άλλο συνάψεις , διακυτταρική επικοινωνία Επεξεργασία πληροφορίας Κωδικοποίηση,υπολογιστική ικανότητα εγκεφάλου Βάση για: τη μάθηση, σκέψη, εμπειρία, συνείδηση ...

Κανναλοπάθειες (Channelopathies) Ασθένειες που προκαλούνται απο διαταραχές στην λειτουργία των ιοντικών δίαυλων Εκ γενετής (πχ μεταλλάξεις στους δίαυλους) Επίκτητη (πχ αυτοανοσία κατα του δίαυλου)

Καρδιακές κανναλοπάθειες – κυρίως καρδιακές αρρυθμίες Congenital long QT syndrome (LQTS)

Ευκαιρίες ανάπτυξης φαρμακευτικών ουσιών για τη θεραπεία νόσων Τά ζωικά δηλητήρια (π.χ. του σκορπιού) περιέχουν ουσίες που αλληλεπιδρούν με ιοντικούς διαύλους. Αλλάζουν τη λειτουργικότητα του καναλιού. Κάποιες ουσίες έχουν και θεραπευτική δράση Παράδειγμα: Αγχολυτικά και ηρεμιστικά φαρμακά που επιδρούν σε δίαυλους GABA (γ-αμινοβουτυρικό οξύ, κύριος ανασταλτικός νευροδιαβιβαστής), αυξάνοντας τη λειτουργικότητα τους

Δομή Δίαυλος ιόντων καλίου

Κατηγορίες διαύλων Τασικοί Συνδεματικοί Μηχανοευαίσθητοι Φωτοευαίσθητοι Χασμικές συνδέσεις Φωτοευαίσθητοι δίαυλοι Ανακάλυψη 2002 (Chlamydomonas reinhardtii) Channelrhodopsin ChR1, ChR2, VChR1 + συνθετικοί *Οψίνες = Φωτοϋποδοχείς, δεν είναι δίαυλοι αλλα G-protein-συνδεδ Συνδεματικοί Πρόσδεση μορίων Εξωκυτταρικά (πχ Νευροδιαβιβαστές) Ενδοκυτταρικά (κυκλικά νουκλεοτίδια/c-AMP, Ca2+)

C O Μηχανισμός λειτουργίας κλειστή – ανοιχτή Ροή ιόντων μέσω Ροή ιόντων μέσω του δίαυλου Εκλεκτικότητα στο είδος ιόντων Κατάσταση ιονικού δίαυλου κλειστή – ανοιχτή

Εκλεκτικότητα: Κατιοντικά (+) Ανιοντικά (-) Να+, Κ+, Ca2+ Η ροή των ιόντων μέσω του δίαυλου γίνετε παθητηκά ... κατεύθυνση της ροής ... άνοιγμα/κλείσιμο με αλλαγές στη τρισδιάστατη δομή

Χαρακτηριστικά ιοντικών δίαυλων Φαρμακολογία Σχέση ρεύματος-δυναμικού (αγωγιμότητα)

Άλλοι ρόλοι ιοντικών δίαυλων Οσμοτική ρύθμιση Έκκριση Κυτταρική κινητικότητα Μορφογένεση Μιτογένεση Αισθητήριους υποδοχείς

Θεμελιώδη ερωτήματα Χημικός μηχανισμός εκλεκτικότητας Πως επηρεάζουν τις κυτταρικές διεργασίες Πως επηρεάζονται απο τις βιολογικές διεργασίες

[K+]o=3 [Na+]o=140 [Cl-]o=140 [Ca2+]o=1.5 [K+]i=140 [Na+]i=7 [Cl-]i=7 [Ca2+]i=0.0001 πρωτεϊνες πυρήνας μιτοχόνδριο Ενδοπλασματικό Δίκτυο - [Ca2+]

Δυναμικό μεμβράνης Vm=Vin-Vout Διαφορά δυναμικού Εσωτερικό πιό αρνητικό Δυναμικό ηρεμίας = Δυναμικό μεμβράνης όταν δεν υπάρχει ηλεκτρική δραστηριότητα (π.χ. Δυναμικά ενέργειας) Δημιουργία δυναμικού μεμβράνης: διαφορά στη συγκέντρωση ιόντων στις δύο πλευρές και διαφορετική διαπερατότητα καθε ιόντος

Πως δημιουργείται/διατηρείται η διαβάθμιση ιοντικών συγκεντρώσεων; Αντλία ιόντων Η μεταφορά των ιόντων από τις αντλίες είναι ενεργητική Δηλ. Είναι απαραίτητη η κατανάλωση ενέργειας Γίνετε αντίθετα με τη φυσική τους ροή

Η κίνηση ενός μορίου στο χώρο (αέρας, διάλυμα)

Brownian Motion: Προσομοίωση της τυχαία κίνηση σωματιδίων σε υγρό ή αέριο περιβάλλον Είναι αποτέλεσμα συγκρούσεων με τα μόρια του υγρού/αέρα αλλά και των σωματισδίων μεταξύ τους Εικόνες απο wikipedia

Πως θα κινηθεί το αρνητικό ιόν; + + + + + + + + + - - - - - - - - - - Η ροή (Jηλ) ενός φορτισμένου σωματιδίου σε ηλεκτρικό πεδίο επηρεάζεται: z = φορτίο του σωματιδίου ΔV = διαφορά δυναμικού του πεδίου

Πως θα κινηθεί το μόριο/ιόν στο κέντρο της εικόνας; Η ροή/διάχυση (Jδιαχ) ενός σωματιδίου στο χώρο επηρεάζεται: Δ[C] = διαφορά της συγκέντωσης το σωματίδιο θα διαχυθεί απο την υψηλότερη στη χαμηλότερη συγκέντρωση (Νόμος του Fick)

Ηλεκτροχημική διαβάθμιση K+ K+ K+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Vm = - 60 mV - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ καθαρή ροή J = Jδιαχ + Jηλ

J = Jηλ + Jδιαχ Πότε δεν θα υπάρχει ροή μέσα απο τον δίαυλο; 1. J = 0

Jηλ = -Jδιαχ z ΔV = - [C]o / [C]i ΔV = - (1/z) [C]o / [C]i Υπο ποιές συνθήκες οι παράγοντες που επηρεάζουν τη ροή των ιόντων δεν θα προκαλούν καθαρή ροή ιόντων; Jηλ = -Jδιαχ z ΔV = - [C]o / [C]i *οι εξισώσεις αυτές δεν είναι πραγματικές αλλά ελλειπές και δίνονται μόνο για εκπαιδευτικούς σκοπούς ΔV = - (1/z) [C]o / [C]i Σημαίνει ότι για συγκεκριμένες συγκεντρώσεις και φορτίο , αν το δυναμικό της μεμβράνης λάβει τιμή ΔV δεν θα υπάρχει καθαρή ροή ιόντων. ή η ροή λόγω ηλεκτρικού πεδίου με δυναμικό ΔV είναι ισοδύναμη και αντίθετη με τη ροή διάχυσης που προκαλείται απο τη συγκεκριμένη αναλογία συγκεντρώσεων σε κάθε άλλο δυναμικό η καθαρή ροή δεν θα είναι 0 (ανάλογα με το δυναμικό μπορεί να είναι προ τα μέσα ή προς τα έξω)

Η διαβάθμιση της συγκέντρωσης ώς ηλεκτρικό δυναμικό Η εξίσωση του Nernst Eion = δυναμικό ισορροπίας (mV) Eion= ln( ) [ion]i RT zF [ion]o R = σταθερά ιδανικού αερίου T = θερμοκρασία (Kelvin) z = φορτίο ιόντος F = σταθερά Faraday (Coulomb/mol) [ion]o = συγκέντρωση έξω (mM) [ion]i = συγκέντρωση μέσα (mM) ln = λογάριθμος με βάση το e (= 2.303 log) Eion= log( ) [ion]i 58 z [ion]o Είναι το δυναμικό εκείνο που θα προκαλέσει κίνηση των ιόντων λόγω του ηλεκτρικού πεδίου με κατεύθυνση αντίθετη της κίνηση τους λόγω της διάχυσης (=διαφορ. συγκ.) Τα ιόντα ρέουν ισότιμα προς το εσωτερικό και εξωτερικό με καθαρή ροή = 0

Ηλεκτρισμός: Νόμος του Ohm dV = διαφορά δυναμικού I = ρεύμα R = αντίσταση g = αγωγιμότητα g=1/R dV = I R I= g dV

Iion = g (Vm-Eion) Ο νόμος του Ohm στους διαύλους I= g dV Δηλαδή, Vm = Eion  Iion = 0 g = αγωγιμότητα Eion= ln( ) [ion]i RT zF [ion]o Eion = δυναμικό ισορροπίας (mV)

Κατά συνθήκη, κατά την εισροή + ιόντων το ρεύμα έχει αρνητικό πρόσιμο (π.χ. η ροή ιόντων Na+ απο το εξωτερικό προς το εσωτερικό του κυττάρου δημιουργεί αρνητικό ρεύμα) Ερώτηση: Ποιό είναι το πρόσιμο του ρεύματος που δημιουρήται με την εκροή ιόντων χλωρίου; Σχεδιαγραμματικά, το αρνητικό ρεύμα παριστάνεται ως μεταβολή προς τα κάτω: 0 pA ρεύμα -10 pA Σχεδιάγραμμα: καταγραφές ρεύματος Αξονας Χ: χρόνος Αξονας Υ: ένταση ρεύματος

I1 = I2 + I3 Ηλεκτρισμός: Η αρχή διατήρησης του φορτίου Transporters

Χ EGHK = δυναμικό ισορροπίας (ηρεμίας) της μεμβράνης Η εξίσωση Goldman-Hodgkin-Katz EGHK= ln( ) PK[K+]i + PNa[Na+]i + PCl[Cl-]o RT zF PK[K+]o + PNa[Na+]o + PCl[Cl-]i p = σχετική διαπερατότητα K, Na, Cl = τα ιόντα στα οποία είναι περατή η μεμβράνη στη κατάσταση ηρεμίας Χ Ισχύει μόνε σε σταθερή κατάσταση (όταν δεν μεταβάλλεται η τάση)

Δυναμικό ισορροπίας ιόντος Δυναμικό ισορροπίας δίαυλου Αν είναι διαπερατό σε ένα μόνο ιόν = δυναμικό ισορροπίας ιόντος Αν είναι διαπεράτό σε περισσοτερα ιόντα = εξίσωση Goldman-Hodgkin-Katz Δυναμικό ηρεμίας μεμβράνης νευρικού κυττάρου

Αλλαγές στο δυναμικό της μεμβράνης (Vm) Εκπόλωση επαναπόλωση -40 Δυναμικό ηρεμίας -60 -70 Υπερπόλωση mV

Πειραματική αλλαγή δυναμικού ηρεμίας Εκπόλωση Υπερπόλωση 1. Φαρμακευτική ουσία που ανοίγει κανάλια (πχ Κ+) 1. Αύξηση συκγέντρωσης Κ+ εξωτερικά 2. Φαρμακολογική ουσία που ανοίγει κανάλια (πχ Να+) 2. Εφαρμογή αρνητικού ρεύματος στο εσωτερικό 3. Εφαρμογή θετικού ρευματος στο εσωτερικό

Δυναμικό Μεμβράνης = διαφορά δυναμικού μεταξύ εσωτερικού και εξωτερικού του κυττάρου Δυναμικό ηρεμίας = Το σταθερό διαμεμβρανικό δυναμικό ενος κυττάρου όταν δέν παράγει ηλεκρτικό σήμα Δυναμικό ισορροπίας (ιόντος) = διαφορά δυναμικού που παράγει ροή ιόνων ιση αλλά αντίθετης φοράς από τη ροή που οφείλεται στη διαβάθμιση της συγκέντρωσης Δυναμικό ενέργειας = Σύντομη «όλα ή τίποτα» εκπόλωσητης μεμβράνης που αναστρέφει την πολικότητα (>0 mV) στους νευρώνες. Έχει ουδό και δέν φθίνει καθώς άγεται. Κλιμακωτό δυναμικό = αλλαγή του δυναμικού μεμβράνης ποικίλου εύρους και διάρκειας, δεν έχει ουδό και φθίνει καθώς άγεται συναπτικό αισθητήρα βηματοδότη Δυναμικό ηρεμίας Κλιμακωτό δυναμικό Δυναμικό ενέργειας

Το νευρικό κύτταρο Δενδρίτες Πυρήνας Συναπτικές απολήξεις Σώμα Άξονας AIS Αρχικό τμήμα άξονα μυελίνη