Τεχνικές και Μεθοδολογία

Παρουσίαση με θέμα: "Τεχνικές και Μεθοδολογία"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Τεχνικές και Μεθοδολογία
για τη μελέτη της μεμβράνης, το ρόλο της στη λειτουργία του κυττάρου ιστού και οργανισμού Χ. Λαμπρακάκης 2014

2 Προσομοίωση (μαθηματική ανάλυση/μοντελλοποίηση λειτουργίας) Ηλεκτροφυσιολογία καταγραφή δυναμικού της μεμβράνης (Voltage) καταγραφή του ρεύματος πού ρέει απο τους δίαυλους Φαρμακολογία Γενετική μηχανική Βιοχημικές μεθόδοι, Ανοσοϊστοχημία Κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ Φθορισμός/FRET (Biophotonics) Οπτογενετική

3 Προσομοίωση βιολογικών συστημάτων

4 Τί είναι η προσομοίωση (simulation)
απομίμηση της λειτουργίας φυσικών διαδικασιών (φαινομένων) και συστημάτων στο χρόνο

5 Γιατί τα χρησιμοποιούμε;
Τα βιολογικά συστήματα είναι πολύπλοκα αναγωγική απλοποίηση μελέτης συνθετική προσέγγιση της βιολογικής έρευνας επιτρέπουν διορατικότητα των βιολ. συστημάτων ερμηνεία πειραματικών δεδομένων δεν καταλαβαίνουμε όλες τις πτυχές της πολυπλοκότητας πολυπλοκότητα και τυχαιότητα (στοχαστική λειτουργία) εντοπισμός άγνωστων στοιχείων και σχέσεων μελέτη δυναμικών πτυχών δεν μπορούμε να ελέγξουμε όλες τις υποθέσεις πειραματικά στη φύση/in vitro βελτιστοποίηση βιολογικών πειραμάτων προτάσείς για νέες υποθέσεις, ποσοτικός και ποιοτικός έλεγχος υποθέσεων μείωση πειραμάτων με ζώικά μοντέλα Τα μοντέλα προσομοίωσης μπορούν να συνδέσουν διαφορετικά επίπεδα λεπτομέρειας (πχ από την πρωτεΐνη –δίαυλος- στο πληθυσμό κυττάρων – νευρ. δίκτυο) Τα μοντέλα μπορούν να προβλέψουν εκπαιδευτικοί σκοποί

6 Τα μοντέλα προσομοίωσης μπορεί να είναι απλοποιημένα ή σύνθετα

7 Προσομοίωση νευρικού συστήματος
απο το μόριο διαύλοι/ιόντα, νευρικό κύτταρο/δυναμικά ενέργειας νευρικό δίκτυο εγκέφαλος και συμπεριφορά BlueBrain

8 Τhe Blue Brain Project The ultimate goal of the Blue Brain Project is to reverse engineer the mammalian brain. To achieve this goal the project has set itself four key objectives: Create a Brain Simulation Facility with the ability to build models of the healthy and diseased brain, at different scales, with different levels of detail in different species   Demonstrate the feasibility and value of this strategy by creating and validating a biologically detailed model of the neocortical column in the somatosensory cortex of young rats   Use this model to discover basic principles governing the structure and function of the brain   Exploit these principles to create larger more detailed brain models, and to develop strategies to model the complete human brain

9

10

11 Το NEURON είναι ένα λογισμικό περιβάλλον (πρόγραμμα) το οποίο επιτρέπει τη δημιουργία πολύπλοκων μοντέλων νευρικών κυττάρων (και υποδομών π.χ. μεμβρανικούς διαύλους, συνάψεις, συγκεντρώσεις ιόντων) και τη προσομοίωση των λειτουργιών νευρικών κυττάρων και νευρικών δικτύων

12 Μοντέλα Προσομοίωσης με το NEURON
Στοχαστικό άνοιγμα και κλείσιμο καναλιών Κινητική ρευμάτων Ηλεκτρικές ιδιότητες της μεμβράνης (ρεύματα, δυναμικά) Κινητική συνάπτικών ρευμάτων Επεξεργασία της πληροφορίας στο κύτταρο Νευρικά δίκτυα

13 C:\nrn71\lib\hoc\nrngui.hoc

14 File>working dir Z:/neuron

15 άλλα περιβάλλοντα προσομοίωσης
Genesis Matlab Channellab

16 Μελέτη της μεμβράνης Μελέτη της: σύστασης δομής λειτουργίας της

17 Η σύσταση μιας μεμβράνης
Λιπίδια Πρωτεΐνες

18 Χρήση χρωματογραφίας και φασματομετρία μάζας για τη μελέτη της σύστασης σε λιπίδια

19 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών
Το μοριακό βάρος και ήλεκτρικά φορτία (φορτισμένα αμινοξέα) συνδράμουν στο διαχωρισμό διαφορετικών πρωτεϊνών Δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση, χρησιμοποιούνται περισσότερες ιδιότητες για το διαχωρισμό Χρήση ειδικών αντισωμάτων για αναγνώριση πρωτεϊνών

20 Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού
Πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός: Οι ατομικοί πυρήνες οταν βρίσκονται σε μαγνητικό πεδίο απορροφούν και εκπέμπουν ηλεκτρομαγνητισμό Το χημικό περιβάλλον των μορίων επηρεάζει τον συντονισμό Η ιδιότητα αυτή επιτρέπει τη διάγνωση της δομής μακρομορίων (Πρωτεϊνες , λιπίδια)

21 Ηλεκτρονική μικροσκοπία

22 Atomic Force Microscope (AFM)
Σάρωση μίας επιφάνειας Η άκρη της κεφαλής σάρωσης αποτελείται απο λίγα άτομα Ατομικές δυνάμεις (πχ van der Waals) ανιχνεύουν τη δομή της επιφάνειας Αναλυτική ικανοτητα νανομέτρων. Η κεφαλή

23 Atomic Force Microscope (AFM)
Απεικόνηση διαύλου του υποδοχέα του γλουταμινικού οξέος (ετεροτετραμερής) Απεικόνηση διαύλου του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (ετεροπεντααμερής) Απεικόνιση οργανικών ενώσεων

24 Περίθλαση Ακτινών X Κυσταλλογραφία
Ακτίνες Χ, μικρά μήκη κύμματος – δομή ατόμων Περιοδική επαναλαμβανόμενη δομή – εστιασμένο σήμα Μη επαναλαμβανόμενη δομή - Διαχυτο σήμα

25 Μέτρηση των αποστάσεων μεταξύ των διαθλασμένων ακτινών χρησιμοποιείται για την δημιουργία τρισδιάστατης δομής

26 Τεχνικές ηλεκτροφυσιολογικών καταγραφών
Εξωκυττάρια καταγραφή ηλεκτρόδιο καταγραφής κύτταρο Παίρνουμε μετρήσεις των δυναμικών του ηλεκτρικού πεδίου

27 Τεχνικές ηλεκτροφυσιολογικών καταγραφών
ηλεκτρόδιο καταγραφής κύτταρο Τα βιολογικά δυναμικά και ρεύματα είναι μικρά σε μέγεθος και χρειάζονται ενίσχυση για να τα μελετήσουμε

28 Εξωκυττάρια καταγραφή
Σύνθετο δυναμικό ενέργειας ισχιακού νεύρου Λήψη πολλαπλών εξωκυτ. καταγραφών απο τομή ζωντανού ιστού Ηλεκτροεγκεφαλογράφημα

29 Εξωκυττάριες καταγραφές
Απομονωμένα δυναμικά απο νευρικά κύτταρα (που δέν είναι σύνθετα δηλαδή) ηλεκτρόδιο καταγραφής κύτταρο

30 Το γυάλινο μικροηλεκτρόδιο

31 Ενδοκυττάριες καταγραφές
(καταγραφές με αιχμηρά ηλεκτρόδια) Μέτρηση της διαφορά δυναμικού μεταξύ του εσωτερικού και του εξωτερικού της μεμβράνης = το δυναμικό της μεμβράνης, δυναμικό ενέργειας κύτταρο

32 Καταγραφή του δυναμικού της μεμβράνης
Εισαγωγή στο κύτταρο λεπτής γυάλινης μικροπιπέτας (ηλεκτρόδιο) Η διάμετρος του άκρου είναι μικρότερη του 1 μm. Στο εσωτερικό έχουν πυκνό αλλατούχο διάλυμα (π.χ. KCl). Στην πιπέτα υπάρχει μεταλλικό ηλεκτρόδιο συνδεδεμένο με ενισχυτή για τη παρακολούθηση της διαφοράς δυναμικού. (η άλλη άκρη του ενισχυτή είναι συνδεδεμένο με ηλεκτρόδιο που βρίσκετε στο εξωκυττάριο υγρό) Καταγραφή του δυναμικού της μεμβράνης

33 Ενδοκυττάριες καταγραφές: έγχυση χρωστικών στο υπο μελέτη κύτταρο
Γιατί; Μελέτη της μορφολογίας του κυττάρου Συσχέτηση φυσιολογίας - μορφολογίας

34 Ενδοκυττάριες καταγραφές Η τεχνική καθήλωσης της τάσης
μέτρηση και του δυναμικού της μεμβράνης, και των ιονικών ρευμάτων που τη διαπερνάνε για έναν άξονα, χρειάζονταν δύο ηλεκτρόδια κατα μήκος του, ένα για την μέτρηση της τάσης (διαφορά δυναμικού) κι ένα για την έγχυση ρεύματος (που θα καθηλώνει την τάση)

35 Μελέτες στον γιγαντιαίο άξονα του καλαμαριού

36 Τεχνική καθήλωσης της τάσης
Marmot (1949), Cole (1949), Hodgkin, Huxley and Katz(1949)

37 Ενδοκυττάρια καταγραφή patch-clamp
Τεχνική καθήλωσης της τάσης σε μικρή επιφάνεια της μεμβράνης Αναρρόφηση μικρής επιφάνειας (patch) της μεμβράνης στη πιπέτα Απομόνωση ηλεκτρικά το εσωτερικό από το εξωτερικό = Λιγότερος ηλεκτρικός θόρυβος μέτρηση ιονικών ρευμάτων προσαρμογή της τεχνικής για ολόκληση την επιφάνεια του υττάρου

38 καταγραφή ιονικών ρευμάτων σε μεμονωμένο δίαυλο
τεχνική patch clamp

39 Τεχνική Patch clamp Επιτρέπει την καταγραφή από μεμονομένους δίαυλους

40 Καταγραφή του ρεύματος που διαπερνά τη μεμβράνη
Τεχνική καθήλωσης της τάσης Σταθεροποίηση του δυναμικού της μεμβράνης σε προκαθορισμένο επίπεδο. Παρακολούθηση του δυναμικού. Πηγή ρεύματος για εισαγωγή ρεύματος με το οποίο η μεμβράνη οδηγήτε σε συγκεκριμένο επίπεδο πόλωσης. Ένας δίαυλος ανοίγει Εισροή (ή εκροή) ιόντων (=ρεύμα). Μεταβολή του δυναμικού της μεμβράνης Η τεχνική παρεμβαίνει στη διεργασία αυτή παράγοντας ρεύμα ίσο και αντίθετο. Εμποδίζοντας ετσι τη μεταβολή του δυναμικού της μεμβράνης Το ρεύμα που παράγεται είναι ίσο με αυτό που διαπερνά τον δίαυλο και αποτελεί την καταγραφή. Η τεχνική επιτρέπει τον προσδιορισμό της επίδρασης των μεταβολών του μεμβρανικού δυναμικού στην αγωγιμότητα της μεμβράνης Όταν το δυναμικό παραμένει σταθερό εξαλείφουμε (μηδενίζουμε) το ρέυμα του πυκνωτή (μεμβράνη) κα απομονώνουμε το ρεύμα που διαπερνά την αντίσταση (δίαυλος)

41 Αναρρόφηση μικρής επιφάνειας (patch) της μεμβράνης στη πιπέτα
Απομόνωση ηλεκτρικά το εσωτερικό από το εξωτερικό = Λιγότερος ηλεκτρικός θόρυβος Διαμορφώσεις: Cell-attached = μετρήσεις απο ένα μικρό κομμάτι της μεμβράνης. Η εσωτερική πλευρά της μεμβράνης παραμένει ενδωκυτταρικά Whole cell = μετρήσεις απο όλη τη μεμβράνη του κυττάρου. Το εσωτερικό του κυττάρου έχει διαλυθεί στο διάλυμα της πιπέτας Outside-out = μικρό κομμάτι της μεμβράνης, με την ενδοκυττάρια πλευρά στο εσωτερικό της πιπέτας και την εξωκυττάρια στο περιβάλλονδιάλυμα. Inside-out = μικρό κομμάτι της μεμβράνης, με την ενδοκυττάρια πλευρά στο περιβάλλον διάλυμα και την εξωκυττάρια στο εσωτερικό της πιπέτας.

42 In vitro Σε απομονωμένα κύτταρα / κυτταροκαλλιέργιες Σε τομές ζωντανού ιστού In vivo

43 BIOPHOTONICS - ΟΠΤΟΓΕΝΕΤΙΚΗ
Ο συνδιασμός γενετικής μηχανικής με τεχνικές που χρησιμοποιούν τις ιδιότητες του φωτος (οπτική) σε ζωντανό βιολογικό υλικό

44 Η Αρχή GFP: Green Fluorescent Protein (Πράσινη φθορίζουσα πρωτεϊνη)
Απομονώθηκε από τη μέδουσα Aequorea victoria Ιδότητα βιοφθορισμού

45 Γενετική μηχανική  Στοχευμένες μεταλλάξεις
Παραγωγή: BFP: Blue Fluorescent Protein CFP: Cyan Fluorescent Protein YFP: Yellow Fluorescent Protein RFP: Red Fluorescent Protein

46 Έκφραση πρωτεϊνών που φθορίζουν σε ζωντανά κύτταρα
DNA Προαγωγός κυτταροειδικων γονιδίων γονίδιο GFP εκφραση πρωτεϊνης Υποκυτταρικό επίπεδο Επίπεδο οργανισμού

47 Αναγνώρηση ανασταλτικών νευρικών κυττάρων στον ραxιαίο νωτιαίο μυελό
Labrakakis et al. (2009) Interference contrast Fluorescence Combined

48 GFP

49 Cameleon Οσφρητικός βολβός ποντικού Pyridine Caproic Acid
ανταποκριτής ασβεστίου fluorescence resonance energy transfer (FRET). Οσφρητικός βολβός ποντικού Pyridine Caproic Acid Wang et all (2003) Cell 112,

50 ανταποκριτής ιόντων χλωρίου
Clomeleon ανταποκριτής ιόντων χλωρίου Συνθετική πρωτεϊνη χίμαιρα μεταξύ του cyan fluorescent protein (CFP) και του yellow fluorescent protein (YFP) FRET Το YFP είναι ευαίσθητο στο χλώριο

51 ανταποκριτής συναπτικής έκκρισης
SynaptopHluorin (spH) ανταποκριτής συναπτικής έκκρισης Παραλλαγή της GFP που είναι ευαίσθητη pH στο συνδεδεμένη στην ενδοκυστιδιακή πλευρά μιας πρωτεϊνης των συναπτικών κυστιδίων (π.χ synaptobrevin, synaptophysin)

52 FlaSh ανταποκριτής μεβρανικού δυναμικού
GFP συνδεδεμένη με τον τασικό δίαυλο καλίου Shaker Το σύμπλεγμα μεταφέρετε στη μεμβράνη και είναι ευαίσθητο στη τάση

53 Διαπερατό στα Na+, K+, Ca2+
Οπτογενετική Channelhodopsin Chlamydomonas reinhardtii Δίαυλος πρωτονίων Δίαυλος κατιόντων Διαπερατό στα Na+, K+, Ca2+ Γρήγορη μεταροπή φωτός σε ρεύμα

54 Γρήγορη μεταροπή φωτός σε ρεύμα

55 Χαρτογράφηση νευρικών δικτύων ΚΝΣ

56 Συνδιασμός τεχνικών Οπτογενετικής
Επιδραστική Ανταποκριτές

57 Channelrhodopsin Halorhodopsin Natronomonas pharaonis
Δίαυλος κατιόντων διεγερτικό Αντλία χλωρίου ανασταλτικό

58 Οπτογενετική in vivo Μελέτη της συμπεριφοράς ελέγχοντας τη λειτουργία συγκεκριμένων νευρικών κυττάρων και νευρικών δικτύων

59 Οπτογενετική μελέτη διακυτταρικής επικοινωνίας απο πρωτεϊνες G
Χρήση Ροδοψίνης θηλαστικών

60 Φωτόλυση παγιδευμένων χημικών ενώσεων
Τεχνική Φωτόλυση παγιδευμένων χημικών ενώσεων

61 χημ. ένωση Ενέργεια (φώς) Χημική ένωση παγίδα –(χημ. ένωση)
Οι χημικές ενώσεις που μπορούμε να απελευθερώσουμε είναι μερικοί νευροδιαβιβαστές όπως το GABA και το γλουταμινικό οξύ, ATP αλλά και ιόντα όπως το Ca2+ Η απελευθέρωση μπορέι να γίνει ενδοκυτταρικά ή εξωκυτταρικά Η χημική ένωση που μας ενδιαφέρει θα πρέπει να ειναι μη ενεργή στην παγιδευμένη μορφή και να έχει βιολογική δράση όταν απελευθερώνεται Η χρήση μικροσκοπίου και Laser επιτέρπει την απευλευθέρωση χημικών ενώσεων με χωρικό και χρονικό έλεγχο

62 Παραδείγματα:

63 Μελέτη της δράσης του γλουταμινικού οξέως στην μορφολογία και κινητικότητα των δενδριτικών ακάνθων (dendritic spines)

64 Χειρισμός μορίων και κυττάρων με την οπτική λαβίδα Optical tweezers
Laser Οπτικό μικροσκόπιο Η εστιασμένη δέσμη laser προκαλεί δυνάμεις απώθησης ή έλξης σε σωματίδια. Γίνετε αλληλεπίδραση του φωτός με τα σωματίδια λόγω δυνάμεων που αναπτύσσονται από την ορμή διάθλασης του φωτός.

65 χειρισμός και μετακίνηση γυάλινων μικροσκοπικών σφαιριδίων
παραδείγματα χειρισμός και μετακίνηση γυάλινων μικροσκοπικών σφαιριδίων σύντηξη δύο κυττάρων υποκυτταρικά όργανα (πχ μιτοχόνδρια) μακροπρωτεϊνικά σύμπλοκα Χρωμοσώματα

66 Χρήση των Optical tweezers για την μελέτη και μέτρηση των δυνάμεων πού ασκεί ένα μόριο κινεσίνης
FLaser Fκινεσίνη