Κεφάλαιο 4ο: Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης Γ΄ Τάξης Ενιαίου Λυκείου Κεφάλαιο 4ο: Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA Θοδωρής Καλαϊτζής

Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Ανασυνδυασμένο μόριο DNA: Τεχνητό μόριο DNA με γονίδια από 2 ή περισ. οργανισμούς. Εισαγωγή του (τους) σε βακτήρια ή ευκαρ. κυτ.  Γενετικά τροποποιημένα κυτ. ζουν και αναπαράγονται  Ιδιότητες (απογόνους) ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ: Τεχνικές με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό. Α. Κατανόηση μυστηρίων ζωής και εξέλιξης (Γη) Β. Βελτίωση υγείας και τρόπου διαβίωσης Θοδωρής Καλαϊτζής

Μεταφορά γεν. υλικού μεταξύ οργανισμών Κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA: Απομόνωση ολικού DNA (δότης) + Κόψιμο με περιοριστικές ενδονουκλεάσες + Ένωση με φορέα κλωνοποίησης (= πλασμίδιο ή DNA φάγων  ανεξάρτητος αυτοδιπλασιασμός) Μεταφορά του σε κύτ. ξενιστή: Εισαγωγή σε βακτήριο = Μετασχηματισμός. Επιλογή & Απομόνωση ξενιστών: Μόνο τα κυτ. με ανασ/νο DNA  Αυτά πολ/νται και δίνουν βακτηριακούς κλώνους Επιλογή κλώνου με επιθυμητό τμήμα DNA: Με ειδικά μόρια ανιχνευτές Θοδωρής Καλαϊτζής

ΚΛΩΝΟΙ Κλώνος: Ομάδα πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών. Κλωνοποίηση: Κατασκευή (κατά προτίμηση μεγάλου αριθμού) πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών. Χιλιάδες κλώνοι που παράγονται με βήμα 3 (προηγούμενη διαφάνεια): Καθένας περιέχει ένα ανασυνδυασμένο μόριο DNA διαφορετικό από τους υπόλοιπους κλώνους (ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ!) Θοδωρής Καλαϊτζής

Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Περιοριστικές ενδονουκλεάσες Παραγωγή από βακτήρια Προστασία από εισβολή «ξένου» DNA (φυσιολογικός ρόλος) Αναγνώριση ειδικών αλληλουχιών 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA (και ειδικό κόψιμό τους) Π.χ. EcoRI (Ε. coli): 5΄-GAATTC- 3΄ 3΄-CTTAAG- 5΄ Μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις στα κομμένα άκρα Σχηματισμός δ. Η μεταξύ άκρων και βάσεων άλλων κομματιών DNA (κομμένων με ίδιο τρόπο) Αλληλουχία GAATTC διάσπαρτη σε γονιδιώματα οργαν. Θοδωρής Καλαϊτζής

Φορείς κλωνοποίησης Κόψιμο γονιδιώματος σε χιλιάδες κομμάτια με την EcoRI  Ενσωμάτωση κομματιών σε ειδικούς φορείς κλωνοποίησης (πλασμίδια, DNA φάγων) Πλασμίδια που επιλέγονται: Αλληλουχία 1 φορά μόνο [1ο κριτήριο επιλογής] + Κόψιμο από EcoRI και δημιουργία γραμμικού μορίου με μονόκλωνα άκρα Ανάμιξη δύο ειδών DNA και ένωση με DNA δεσμάση  Δημιουργία ανασυνδυασμένων πλασμιδίων (κάποια ξαναγίνονται κυκλικά, χωρίς DNA του οργανισμού) Θοδωρής Καλαϊτζής

Μηχανισμοί ανασυνδυασμού του DNA Θοδωρής Καλαϊτζής

Μετασχηματισμός Βακτήρια-ξενιστές: δέχονται μικρό αριθμό πλασμιδίων - μερικά μόνο πλασμίδια (ακόμα λιγότερα) είναι ανασυνδυασμένα. Χρησιμοποίηση ως ξενιστές: Βακτήρια χωρίς πλασμίδια (ευαισθησία σε αντιβιοτικά)  Επιλογή αυτών των (ελάχιστων) βακτηρίων παρουσία αντιβιοτικού λόγω γονιδίου ανθεκτικότητας (που βρίσκεται στο ανασυνδυασμένο πλασμίδιο) [2ο κριτήριο επιλογής] Είσοδος πλασμιδίου σε βακτήρια, λόγω προηγούμενης κατεργασίας  Τοιχώματα παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια Θοδωρής Καλαϊτζής

Κλωνοποίηση Είναι η διαδικασία δημιουργίας κλώνων βακτηρίων (εξειδικευμένος ορισμός εδώ) ΚΑΘΕ ΒΑΚΤΗΡΙΟ ΜΕ 1 ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟ ΠΛΑΣΜΙΔΙΟ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΖΕΤΑΙ ΚΑΙ ΔΙΝΕΙ 1 ΚΛΩΝΟ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ: Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχει το συνολικό DNA του οργανισμού δότη Επιλογή ενός κλώνου (με το επιθυμητό γονίδιο): με ειδικά μόρια-ανιχνευτές. Μεγαλύτερα τμήματα ξένου DNA  Φορέας: βακτηριοφάγος λ. Θοδωρής Καλαϊτζής

Ανακεφαλαίωση Θοδωρής Καλαϊτζής

Κλωνοποίηση mRNA: Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης (1) Ανώτεροι ευκαρ. οργ. : Μεταγραφή πολλών γονιδίων σε ορισμένους κυτ. τύπους (π.χ. αιμοσφαιρίνες->πρόδρομα ερυθροκύτταρα) Κλωνοποίηση γονιδίων που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα: cDNA βιβλιοθήκες. Αυτές: 1. Περιέχουν αντίγραφα όλων των, εκφραζόμενων στα κύτταρα αυτά, γονιδίων 2. Απομόνωση μόνο εξωνίων (αλληλουχιών που μεταφράζονται σε αμινοξέα). Θοδωρής Καλαϊτζής

Κλωνοποίηση mRNA: Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης (2) mRNA ως καλούπι για σύνθεση cDNA (αντίστροφη μεταγραφάση)  υβρίδια mRNA-cDNA Διάσπαση mRNA (χημ. ουσίες) ή αποδιάταξή του με θέρμανση cDNA ως καλούπι για σύνθεση συμπληρ. αλυσίδας DNA  δίκλωνα DNA Εισαγωγή δίκλωνων μορίων σε πλασμίδια ή φάγους και κλωνοποίησή τους ΕΤΣΙ: Σύνθεση σε κυτ. Ξενιστή της επιθυμητής πρωτ. Θοδωρής Καλαϊτζής

Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης Θοδωρής Καλαϊτζής

Υβριδοποίηση νουκλεϊκών οξέων (1) Αποδιάταξη: Σπάσιμο δ. Η μεταξύ συμπληρωματικών αλυσίδων DNA-DNA (ή DNA-RNA) και αποχωρισμός τους, λόγω επίδρασης χημ. ουσιών ή αύξησης θερμ.  Επανασύνδεση συμπληρ. αλυσίδων σε κατάλληλες συνθήκες Υβριδοποίηση: Σύνδεση μονόκλωνων συμπληρ. αλυσίδων DNA-DNA ή DNA-RNA. Λόγω υβριδοποίησης: Ανίχνευση με γνωστό μόριο DNA, του συμπληρωματικού του (μέσα σε χιλιάδες άλλα κομμάτια) Θοδωρής Καλαϊτζής

Υβριδοποίηση νουκλεϊκών οξέων (2) Γονιδιωματική βιβλιοθήκη (κομμάτια κλωνοποιημένου χρωμοσωμικού DNA): Κομμάτια με ολόκληρα γονίδια Κομμάτια τμήματα γονιδίων Κομμάτια με τμήματα DNA που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες Από όλα αυτά, «ψαρεύουμε» αυτό (ή αυτά) που θέλουμε με χρήση ιχνηθετημένων μορίων DNA ή RNA (μόρια ανιχνευτές) [σελ. 14- Ιχνηθέτηση?] Θοδωρής Καλαϊτζής

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Δημιουργία πολλών αντιγράφων 1 γονιδίου  Μελέτη συγκεκριμένου γονιδίου & Παραγωγή πρωτεΐνης (σε μεγάλες ποσότητες) PCR: Επιλεκτική αντιγραφή (εκατομμύρια φορές) ειδικών αλληλουχιών DNA από ένα σύνθετο μείγμα μορίων DNA, χωρίς τη μεσολάβηση ζωντανού κυττάρου. Από 1985: Ιατρική (διάγνωση ασθενειών π.χ. AIDS), Εγκληματολογία (διαλεύκανση υποθέσεων) & Παλαιοντολογία (μελέτη DNA από απολιθώματα) Θοδωρής Καλαϊτζής

PCR Θοδωρής Καλαϊτζής