RAKENDUSBIOLOOGIA II Geenitehnoloogia Koostas Kersti Veskimets

Fundamentaalteadused ja rakendusteadused Fundamentaalteadused püüavad välja selgitada loodusseadusi. Rakendusteadused otsivad avastatud loodusseadustele kasutamisvõimalusi. Tooge näiteid, kus sellest kasu saab?

Bioloogias on samuti… fundamentaalteadused … ja rakendusteadused… BIOTEHNOLOOGIA – rakendusbioloogia valdkond, kus kasutatakse organisme, et toota inimesele vajalikke aineid. Peamiselt bakterid, seened, GM-loomad ja GM-taimed.

Biotehnoloogia eelised: Säästab energiat Vähem ja kahjutud jäätmed Odav tooraine ja puudused: Ajakulu vastavate organismide leidmiseks, kasvatamiseks. Tundlikkus keskkonnategurite suhtes.

GEENITEHNOLOOGIA …on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse geene (geeni osi) ühest organismist teise või muudetakse muul viisil geene, saadakse GMO. Organisme, kellele on viidud võõraid geene, nim. transgeenseteks. Esimene transgeenne bakter tehti 1973.a. Nokautorganism – organism, kellel teatud geen on maha surutud.

Noored “biotehnoloogid” TTÜ Loodusteadustemaja õppelaboris Autori fotod

Kuidas geenid kohale viia? Bakteri plasmiidiga - tema väike DNA Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime-tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4. Taimedesse Agrobakteriga DNA fragmendid kullaosakesel http://www.nanonews.tv/documents/nanoforpeople.htm

Konjugatsioon - bakter annab plasmiidi teisele bakterile.. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Bacterial_Conjugation_en.png

Geenide ülekandmine on võimalik restriktaaside abil. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks – need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”. Selliste otstega DNA lõike on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. ASILOMARI lepe 1974.a: teadlaste leping, et reombinantset DNA-d võib toota vaid sellistes bakterites, kes looduses ei jää ellu!

Restriktaasid lõikavad DNA molekuli nii, et tekivad "kleepuvad otsad" http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://www.mhhe.com/biosci/esp/2001_gbio/folder_structure/ge/m6/s1/assets/images/gem6s1_1.jpg http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://www.biology.iupui.edu/biocourses/N100H/images/15restriction.gif

Kleepuvad otsad ühinevad Vektor Restriktaas Lõigatud DNA Restrikataas (sama) Soovitud geen Lõigatud vektor Soovitud geen Kleepuvad otsad ühinevad Rekombinantne plasmiid

Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud. Näiteks kasutatakse GFP geeni (helenduvat valku määrav geen) markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis. Nii saab üle viidud geeni avaldumist organismis kindlaks teha: vaatad ja näed, et helendub, st ka soovitud geen on üle kandunud.

Fluorestseeruv valk – GFP on saadud meduusist. O.Shimura eraldas esimesena Nobeli preemia 2008 http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/images/aequorin-2.jpg

Plasmiid, mis sisaldab GFP-geeni ja antibiootikumiresistentsust määravat geeni

Inimese kasvajat põhjustavale geenile on lisatud GFP- geen. See on viidud hiire rakkudesse ning nüüd on võimalik jälgida kasvaja arengut, siirdeid, uurida ravi võimalusi. http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://www.biken.osaka-u.ac.jp/act/images/okabeA.png

Helenduvad geenid on lisatud vaid markerina, et olla kindel geeni ülekandes. Albiino jänes hüppab ringi nagu iga tavaline jänku, kuid pimedas toas UV-valgusel hakkab helenduma. Helenduv kärss http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/images/piggies2.jpg http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://www.viewingspace.com/genetics_culture/pages_genetics_culture/gc_w03/kac_webarchive/gfp_bunny_page/albagreen.jpeg

Sebrakalad on helenduma pandud ilu pärast http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://www.funnyphotos.net.au/images/glow-fish-genetically-engineered-fish1.jpg

Transgeensed mikroorganismid 1. GM-bakterid meditsiinis Esimene (1978) oli insuliin soolekepikeses (E.coli). Inimese kasvuhormoon. Erütropoietiin aneemia raviks. Interferoon, mis reguleerib immuunsüsteemi. Vere hüübimisfaktorid. Difteeria ja teetanuse vaktsiin. Pärmseened teevad B-hepatiidi vaktsiini. Putukarakud toodavad papilloomi vaktsiini. Sellised vaktsiinid on ohutumad, kui nõrgestatud haigusetekitajad.

Katsetatud on Soomes nii haigete kui tervete peal. HIV-vaktsiini töötatakse välja prof. Mart Ustavi juhtimisel eesti teadlaste poolt. Katsetatud on Soomes nii haigete kui tervete peal. 2006.a. algasid I ja siis ka II faasi kliinilised katsetused LAV-s. I faasis määratakse minimaalne toksiline doos. II faasis bioloogiline efekt ja kõrvaltoimed. http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://www.akadeemia.ee/_repository/Image/akadeemikud/ustav.jpg

2. GM-bakterid toiduainetetööstuses amülaas - lagundab tärklise maltoosiks (maltaas glükoosiks) Kas viljateras on amülaasi? kümosiin - kõvas juustus, enne saadi vasikatelt paksendajad - ksantaan - määrdejuustudes maitsetugevdajad - glutamaat emulgaatorid - letsitiin happelisuse regulaatorid - sidrunhape vitamiinid - C, B2, B12, kunstlikud magustajad - aspartaam värvaained - β-karoteen (lõhe värvus) säilitusained - natamütsiin, nisiin, lüsotsüüm loomasöödas lihasmassi tõstmiseks - lüsiin (aminohape)

Glutamaat Lisalugemiseks: Glutamaat-retseptorite ülestimulatsioon põhjustab rakusisese kaltsiumioonide sisalduse tõusu, mis kahjustab mitokondreid ning käivitab apoptoosimehhanismi ehk raku surma.  Glutamaat, mis esineb aminohappena toidu koostises loomulikul kujul, ei ole enamasti tervisele ohtlik, sest ta laguneb ja imendub sooles aeglaselt, andes veres madalamaid kontsentratsioone. Liigse glutamaadi kuhjuminetekib toidu lisaainete tarbimisel. Glutamiinhape (E620) ja glutamiinhappe soolad (E621-625) on toidukeemias väga laialt levinud lihatoitudes, puljongikuubikutes ja mujal, tuntud kui maitsetugevdajad.

Lisalugemiseks: Sünteetilist magusainet, lõhna ja maitse tugevdajat aspartaami (E951) esineb rohkesti karastus-jookides, maiustustes, kondiitritoodetes jne. Põhjalik ülevaade on sellest eesti keeles saadaval järgneval aadressil: http://ardisala.planet.ee/raamatud/E-ainetest_Martinilt.rtf  Levinumad probleemid on migreen, astma , südame rütmihäired, ja -pekslemine iiveldus oksendamine, depressioon, uimasus, ärrituvus jt.  Liigne glutamaat võib mõjutada imikute ja laste aju arengut, mille tagajärjel areneb tähelepanu defitsiidi häire ja hüperaktiivsus (ADHD), autism, tserebraalparalüüs, seostatud ka skisofreeniaga. http://www.toitumisteraapia.ee/eksitotoksiinid.html

3. GM-bakterid biokütuse- ja materjalitööstuses GM-soolekepikese genoomi on viidud rasvhapete ja alkoholi fermenteerimisel osalevate ensüümide geenid - sünteesib biodiislit otse taimeõli ja suhkrusegust. 45 erinevat bakteriliiki on võimelised sünteesima polühüdroksübutüraati, millest saab bioplasti. GM-bakter pannakse tootma aktiivsemalt. Bioplast mittea ainult kottideks vaid ka implantaadid, ravimite kapslid jne.

4. Bakterid bioremediatsioonis (biotervenduses) Inimene on tootnud tuhandeid looduses mitte-esinevaid aineid. Me ei tea, mis neist looduses saab. Luuakse GM-baktereid, mis lagundaksid naftat, fenoolseid ühendeid, radioaktiivseid ühendeid jne. Seni lubatakse vaid suletud süsteemides. Miks? Eestis uuritakse pinnasebakteri Pseudomonas putida fenoolseid ühendeid lagundavaid omadusi.

Tegelikult ei hakka bakterirakus inimese geen kohe tööle. Miks? Päristuumsete (loomade, seente ja taimede) geenis on intronid ja eksonid. Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult kokkuliidetud eksonid moodustavad mRNA , mille alusel sünteesitakse valk. Kui tahame bakterisse inimese geeni viia, siis peame selle mRNA alusel tegema DNA - õnneks on avastatud pöördtranskriptaas, mis selle töö ära teeb - ja nüüd bakterisse viima. Nüüd teeb bakter sama valku, mis see geen inimese rakuski teeb.

RNA trans- kript http://faculty.ircc.edu/faculty/tfischer/images/introns-exons.jpg

Transgeensed loomad Esimene transgeenne hiir saadi 1981.a: roti kasvuhormooniga kasvas 2 X suuremaks. Transgensed hiired on head mudelid inimeste haiguste uurimiseks. Miks hiiri kasutatakse kõige rohkem? Transgeensete suurimetajate saamine on keerukas: munarakk kahjustub, embrüosiirdamine ei ole sageli edukas jne. Tartus plaanitakse luua lehm, kes toodab insuliini (Sulev Kõks ja Ülle Jaakmaa).

. Organite kasvatamiseks GM-loomade baasil. http://declubz.com/blog/2008/08/26/mouse-with-human-ear

GM-loomad organidoonoriks Sea südameklappe saab siirdada, kuid immuunvastus on vaja kõrvaldada. See on õnnestunud geneetilise muutmise abil. http://www.tbc.school.nz/elearning/localsites/heartlab/dissection/1.jpg http://www.greenbiz.com/blog/2010/04/01/can-gmo-pigs-shrink-gulfs-dead-zone

Loomad muudetakse ravimeid tootvateks (kliinilised katsed): GM-kitse piimas antitrombiin (päriliku puudulikkuse vastu) kasutusel alates 2006.a. GM-lehma piimas laktoalbumiin enneaegsetele lastele GM-küüliku piimas osteoporoosi ravim http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://news.bbc.co.uk/olmedia/600000/images/_600551_300cowandcalf.jpg

Esimene transgeenne lammas – Polly (1997), kelle piimas on inimese vere hüübimisvalk, mida kasutatakse hemofiilia raviks. http://www.achievement.org/achievers/wil0/large/wil0-012.jpg

Geenitehnoloogia loomade tõuaretuses Sigade ja lammaste kaal kasvas 30% Kalkunite munevus suurenes Lihaloomad, kelle tailiha ja rasva osakaal on täpselt määratud Forell, lõhe jt kalade kasv 2 korda suurem http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://www.gourmet.com/images/foodpolitics/2008/09/fp_potp_gmsalmon608.jpg

Transgeensed taimed Tehakse, et saavutada: Herbitsiidiresistentsus: I oli soja (Monsanto 1996), mais, puuvill, lina, raps, suhkrupeet, lutsern) Putukaresistentsus - Bt-toksiini (palju erinevaid) määrav geen on viidud taimesse ja mürke polegi vaja (tomat, mais, puuvill, kartul). Inimesele ei mõju, sest ainult putuka soolestikus on valk, mis aktiveerib mürgi. Saadakse ka mitme geeniga muudetud taimi. Monsanto laseb kohe turule 8 geeni muudatusega sojaoa: lisaks talub põuda, on rohkem omega-3 rasvhappeid jne.

Viirusresistentsus - papaia, suvikõrvits, maguskartul Hawail harilike papaia sortide kasvatamine keelati, sest need levitasid viiruseid. Kõik on GM-papaiad. Autori foto http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://deni1978.files.wordpress.com/2010/04/papaia.jpg

Suurem toiteväärtus: β-karoteeniga (A-vitamiini allikas) kuldne riis (ei olegi veel turul!) http://qwickstep.com http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://www.greenpeace.org.uk/files/images/migrated/MultimediaFiles/Live/Image/7003.JPG

Viljade pikem säilivusaeg Tomat, banaan, mango, papaia. Tomatile viidi arktilise kala geen, kuid see GM-tomat ei ole enam kasutusel. Madalam allergeensus Jne http://www.brighthub.com/environment/green-living/articles/69993.aspx?image=74570

Uuemad suunad GM-taimede loomisel Soovitakse luua taimi - "bioreaktoreid" ehk farmataimi, mille abil saab toota: vaktsiine, antikehasid, ravimeid, toorainet materjali- ja keemiatööstusele. Paljud on juba jõudnud põllukatsete faasi või kliiniliste katsete faasi. Kuid taimed ksvatavad oma osi aeglaselt...

Väike lemmel kasvab kiiresti ja toodab juba 35 erinevat valku, nt C-hepatiidi ravimit (ei ole veel tootmises) http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://biofuelsdigest.com/bdigest/wp-content/uploads/2010/08/petroalgae0709c.jpg http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://farm2.static.flickr.com/1255/1412642927_d282832c7e.jpg

Kliiniliste katsetusteni on jõudnud ravimid: Hambakaariesele - tubakataimes Reisijahaigusele - maisis ja kartulis B-hepatiidile - kartulis ja salatis Marutaudile - spinatis

GM-taimed kütusetööstuses Biokütuse (bioetanool) tootmiseks muudetakse taime tselluloosi, ligniini sisaldust, et lagunemine toimuks kiiremini. Lisaks on maisile viidud sisse bakteri geen, mis ka kõrgel temperatuuril tärklist lagundab (ei ole veel tootmises). Otsitakse uusi kiiresti kasvavaid taimi, et neid kasutama hakata: eukalüpt, itaalia kukeleib, punavetikas.

GM-taimed materjalitööstuses Biolaguneva plastiku tootmiseks on taimesse viidud bakteri geen, mis toodab looduslikku plastikut (praegu on müügil vaid bakterite toodetud plastik) Kartulis on muudetud amülopektiini osakaalu suuremaks, et oleks parem tooraine paberi-, tekstiili- ja liimitööstusele. GM-taimed bioremediatsioonis Paplisse on viidud bakteri geen ja nüüd kogub pappel tõhusamalt raskemetalle (Hg).

GM-taimede kasvatamise levik maailmas 2008.a. seisuga: Soja 53% Mais 30% (maisi saagikus on tõusnud 30%) Puuvill 12% Raps 5% Suurimad kasvatajad: USA, Argentiina, Brasiilia, Kanada, Hiina ja India. USA arvel on ligi 50% GMT kogupindalast EL -s vaid 0,01% ( söödamais) 2010.a anti luba tärklisekartuli kasvatamiseks söödaks

GMO hektarite kasv 1996 – 2015 maailmas

Suurimad kasvatajad milj/ha Rank Country 2014 2015 1 USA* 73.1 70.9 2 Brazil* 42.2 44.2 3 Argentina* 24.3 24.5 4 India* 11.6 5 Canada* 11.0 6 China* 3.9 3.7 7 Paraguay* 3.6 8 Pakistan* 2.9 9 South Africa* 2.7 2.3

GM-soja, -puuvilla, -maisi, -rapsi levik maaailmas

http://www. google. ee/imgres. imgurl=http://www. bioneer http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://www.bioneer.ee/static/files/096/gmode_valmistamine_2.jpg

Sordiaretuse ajaloost? 10 000.a. tagasi põllumajanduse algus – valiti juhuslikult. 19. saj. selektiivne ristamine 20. saj. algus mutagenees ja selektsioon 1987.a. esimesed GM-taimed 1990-ndad GM-taimede levik USA-s, Aasias jm. 1998.a. EL keelustas kõik GMO-d. Nüüd on Euroopas lubatud, kui taotled loa. (ülikeeruline, meeletu paberi, aja ja raha raiskamine) GM-taimede loomine on täppissordiaretus.

Kus on sordiaretuse piirid?

GMO-aretuse poolt: Kiiremad tulemused Geenid teistelt liikidelt Geenide avaldumist saab reguleerida Teatakse täpselt, millist geeni üle kantakse, mis muutub uues sordis. Põldudel kasutatakse vähem keskkonnamürke. Geneetilise reostuse vältimiseks on loodud enesetapja tehnoloogia - seeme ei idane.

GMO-aretuse vastu: Kahjurid võivad muutuda resistentseks. Geenid võivad üle kanduda umbrohule. Erinevate organismide geenide koostoime võib olla ettearvamatu. GM-taimede maitseomadused on tavaliselt halvemad. uute allergiate teke toksiin, mis on kahjulik putukale võib mõjutada ka inimest

Geeninokaut Geen lülitatakse välja. On loodud sadade geenide suhtes “nokauti löödud” hiiri. Tehnika on keeruline: Geenivektor (vigane geen+marker) viiakse hiire embrüonaalsetesse tüvirakkudesse. Vektor satub ristsiirdega genoomi. Selektiivsöötmel jäävad ellu mutantsed rakud, need on nokautrakud.

4. Nokautrakud siiratakse uude embrüoblasti 5. Tekib kimäärne embrüo 6. See embrüo viiakse hiire emakasse 7. Sünnivad kimäärsed hiired (neid hoitakse) 8. Järgneva ristamise tulemusena sünnib ka homosügootseid nokauthiiri.

Geeniteraapia Inimesel on teada üle 3000 päriliku puude. Kaks võimalust: Asendada haige geen tervega Vaigistada haige geen. Neid tegevusi ei tehta munarakuga, need ei pärandu järglastele. On kohati häid tulemusi, kuid enamasti mitte.

Immuunpuudulikkuse ravi oli 1990.a. suhteliselt edukas. Parkinsonitõve ravi ajutiselt. Geenivaigistamiseks kasutatakse mikro-RNA (miRNA) molekule. Kui mi-RNA-d ühinevad mRNAga, siis viimane lagundadakse. Nii saaks ravida Huntingtoni haigust. Geenivaigistamine on täiesti uus suund!

Muid geenitehnoloogia rakendusi Molekulaargeneetiline diagnostika Enamasti põhineb mutantsete geenide äratundmisel: DNA-kiibid - võrdlus DNA-lõigud, millega patsiendi geene kõrvutada – saab tuvastada haiguse ja siis vastavalt määrata ravi (kiibil on markerid) Paljude haiguste puhul on see juba võimalik: rinnavähk, tsüstiline fibroos, sirprakuline aneemia, kurtus, Huntingtoni tõbi jne.

2. DNA-sõrmejälgede metoodika Võrreldakse 10 või enama lookuse pikkust: Lookusi saab DNA-st "välja lõigata" ja paljundada väga kiiresti polümeraasse ahelreaktsiooni ehk PCR-meetodit kasutades. Lõigatud fragmendid on erineva pikkusega, kuid lahuses segamini. See proov pannakse geeli, geel pannakse elektrolüüsi vanni. DNA-lõigud jooksevad + pooluse poole, seda kiiremini, mida lühemad nad on.

PCR metoodika: Ependorfis segatakse kokku: nukleotiidid (kõiki nelja erinevat) DNA-polümeraas oma DNA lahus praimerid - lühikesed DNA lõigud, mis on komplementaarsed analüüsitava DNA-piirkonna mõlema “otsaga”. Ependorf pannakse 3 tunniks PCR-masinasse. eppendorf

PCR-masinas toimub DNA uuritavate lõikude paljundamine tänu pidevale temperatuuride vaheldumisele: 92oC - DNA denatureerub 58C - praimerid liituvad 72oC - DNA-polümeraas käivitab replikatsiooni. See tsükkel kordub masinas 34 korda. http://www.google.ee/imgres?imgurl=http://www.molecularstation.com/molecular-biology-images/data/509/pcr-machine.jpg

Kuumutatakse 90 –ni, DNA denatureerub PCR Fragment, mida tahetakse paljundada Kuumutamisel 90-ni DNA denatureerub Praimerid ühinevad madalamal temp-l DNA-polümeraas saab replikatsiooni alustada ainult 3` otsast Kuumutatakse 90 –ni, DNA denatureerub

DNA-polümeraas replikeerib, Praimerid ühinevad DNA-polümeraas replikeerib, alustades 3`otsast Need 2 fragmenti on esimesed tulemused. Tsüklit korratakse 34X, saadakse 30 miljonit

Tulemus: uuritavaid DNA-lõike on paljundatud vähemalt 30 miljonile. Nii suurt kogust saab näha geelelektroforeesil. PCR-masinast võetud DNA-proovid pannakse geeli auku.

Geel asetatakse elektroforeesivanni, DNA-lõigud liiguvad + pooluse poole seda kiiremini, mida väiksemad nad on. http://www.nofima.no/mat/en/researcharea/preserving-and-shelf-life

Umbes tunni aja pärast näeme UV-kiirgusel lahutatud DNA-lõikude “bände” Saame isikute sarnasusi/erinevusi näha ja võrrelda.

Embrüodiagnostika

Allikad 1. Viikma, M., Tartes, U. Bioloogia gümnaasiumile II osa 3. kursus. Tartu: Eesti Loodusfoto 2008, 128 lk. 2. Sarapuu, T., et al. Bioloogia gümnaasiumile II osa 4. kursus. Tartu : Eesti Loodusfoto, 2006, 120 lk. 3. Sarapuu, T., Kallak, H. Bioloogia gümnaasiumile I osa. Tartu : Eesti Loodusfoto,1997, 212 lk.

Tänan tähelepanu eest!