Funkcije proteinov Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb) Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) Oporna funkcija (strukturni proteini, npr keratini, kolagen ...) Kontraktilni proteini Membranski proteini, vključeni v transport molekul/ionov preko bioloških membran Proteini, vključeni v prenos signala (receptorji, G-proteini, kinaze ...) Obramba pred tujki/invazivnimi organizmi (imunoglobulini/Ig) Kataliza biokemijskih reakcij (encimi)

Encimi Splošne lastnosti Kofaktorji, koencimi in prostetične skupine Klasifikacija encimov Mehanizmi encimske katalize Encimska kinetika Encimska inhibicija Uravnavanje encimsko kataliziranih biokemijskih reakcij Encimi v medicinski diagnostiki

Splošne lastnosti Encimi - biokatalizatorji - so visokospecializirani proteini (in RNA) - visoka katalitična moč - visoka specifičnost Encimi omogočajo reakcije v blagih pogojih (temperatura, pH, tlak) Delujejo oragnizirano – katalizirajo reakcijska zaporedja po stopnjah: razgradnja hranilnih molekul in shranjevanje/transformacija energije → biosinteze makromolekul, transmembranski transport, gibanje ... Bolezenske spremembe - spremenjena encimska aktivnost (znižana, zvišana) → diagnostika, terapija Uporaba encimov: v farmacevtski, živilski industriji in agronomiji

Reakcije vseh metaboličnih poti katalizirajo encimi

Zgodovina V 18. stoletju – raziskave razgradnje mesa z izločki želodca V 19. stoletju – razgradnja sladkorja s slino in rastlinskimi izvlečki 1850 Luis Pasteur: kvasovke fermentirajo sladkor → aklohol; predpostavka: fermeniti so v živih celicah (vitalizem) 1897 Eduard Buchner: izvlečki iz kvasovk fermentirajo sladkor → aklohol; predpostavka: fermenti so aktivne molekule - encimi 1926 James Sumner: encim ureaza je protein 1930 J.B.S. Haldane: katalitično moč encimov pogojujejo šibke interakcije med encimom in substratom

Encimi, kofaktorji, koencimi Encimi (biokatalizatorji) – Mr od 12 000 do 106 Za aktivnost encima pomembna 3D struktura Encimi - proteini (sestavljeni samo iz polipeptidne verige) → → katalitska funkcija - proteini + kofaktorji (ioni) → katalitska funkcija - proteini + koencimi (kompleksne organske molekule) → koencim ni stalno vezan na proteinski del prostetična skupina = koencim, trdno vezan na proteinski del molekule HOLOENCIM = APOENCIM + PROSTETIČNA SKUPINA encim proteinski del neproteinski del molekule

Anorganski elementi – kofaktorji encimov Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

VITAMINI, KOENCIMI IN PROSTETIČNE SKUPINE + vitamin C PREKURZOR (VITAMIN) SKUPINA PRENOSA KOENCIM tiamin (vitamin B1) aldehidna skupina tiamin pirofosfat riboflavin (vitamin B2) elektroni in protoni FMN, FAD nikotinska kislina (niacin) hidridni ion (H-) NAD pantotenska kislina in druge molekule acilne skupine koencim A piridoksin (vitamin B6) amino skupine piridoksal fosfat vitamin B12 H-atomi in alkilne skupine kobalamin biotin CO2 (-COOH) biocitin folna kislina skupine z enim C-atomom tetrahidrofolna kislina liponska kislina elektroni in acilne skupine Večina koencimov izhaja iz vitaminov in so ključni za katalitsko reakcijo

Nomenklatura encimov Zgodovina: Končnica –aza k substratu ali k reakcijski aktivnosti, npr. ureaza, DNA-polimeraza ... Opis široke funkcije telesne tekočine, ki vsebuje določen encim, npr. pepsin (iz grščine prebava), lizocim (liza – razgradnja bakterijske celične stene) ... Zmešnjava: en encim več imen ali več encimov isto ime Danes: Sistematska klasifikacija encimov v 6 razredov glede na vrsto reakcije, ki jo katalizirajo; razredi razdeljeni na podrazrede ... Vsak encim točno definiran s 4 številkami, npr. EC 2.7.1.1 (EC, Enzyme Commission number)

Sistematska klasifikacija encimov (6 razredov) 1. oksidoreduktaze – prenos elektronov (tudi kot hidridni ion H- in H atom) 2. transferaze – prenos skupin z ene na drugo molekulo 3. hidrolaze – prenos skupin na H2O 4. liaze – adicija na dvojno vez/nastanek dvojne vezi 5. izomeraze – prenos skupin znotraj molekule → druga izomerna oblika 6. ligaze – nastanek kovalentnih vezi C-C, C-S, C-O in C-N (kondenzacijske reakcije ob porabi energije ATP)

Klasifikacija encimov razred vrsta reakcije pomembni podrazredi 1. oksidoreduktaze dehidrogenaze oksidaze peroksidaze oksigenaze (monooksigenaze, dioksigenaze) 2. transferaze C1-transferaze glikozil-transferaze amino-transferaze fosfo-transferaze (kinaze) 3. hidrolaze 4. liaze (sintaze) C-C liaze C-O liaze C-N liaze C-S liaze + + Ared Boks Aoks Bred + + A-B C A C-B esteraze (fosfataze) glikozidaze peptidaze amidaze + + A-B H2O A-H B-OH + A B A-B

Klasifikacija encimov (nadaljevanje) razred vrsta reakcije pomembni podrazredi 5. izomeraze epimeraze cis-trans izomeraze intramolekularene transferaze 6. ligaze (sintetaze) poraba energije!! C-C ligaze C-O ligaze C-N ligaze C-S ligaze A izo-A A + XTP + XDP + P B A-B

Primer 1: 1. razred podrazred oksidoreduktaze dehidrogenaze oksidaze peroksidaze oksigenaze (monooksigenaze, dioksigenaze) Dehidrogenaze – odvzem atomov vodika H z molekule substrata Oksidaze – oksidacijska reakcija, kjer je akceptor elektronov kisik O, nastane H2O (prostetična skupina pogosto flavoprotein FMN, FAD) (citokrom oksidaza v dihalni verigi) Peroksidaze – oksidacijska reakcija, kjer je akceptor elektronov H2O, nastane H2O2 Oksigenaze – kisik O se vgradi v molekulo substrata, nastane –OH ali –C=O - monooksigenaze – 1 atom O v substrat (hidroksilaze, oksidaze z mešano funkcijo) Monooksigenaze pogosto vsebujejo v aktivnem centru hemski del - citokrom P450 kot akceptor elektronov

Primer: Reakcijska shema oksidacije substrata s citokromom P450 Nadaljevanje - monooksigenaze Primer: Reakcijska shema oksidacije substrata s citokromom P450 Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Primer: Oksidacija triptofana Nadaljevanje: - dioksigenaza – 2 atoma O v substrat Primer: Oksidacija triptofana Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Primer 2: ATP + D-glukoza → ADP + D-glukoza-6 fosfat razred podrazred 2. transferaze fosfotransferaze ATP + D-glukoza → ADP + D-glukoza-6 fosfat Št. encima: EC 2.7.1.1. 1. št. - 2. razred transferaze 2. št. - 7. podrazred, kjer so encimi fosfotransferaze 3. št. - 1. fosfotransferaze, ki imajo –OH kot akceptor fosforilne skupine 4. št. - 1. akceptor fosforilne skupine je glukoza Trivialno ime heksokinaza – še vedno večinoma uporabljano

Klasifikacija encimov in njihova vloga Več primerov encimsko kataliziranih reakcij v: R.Boyer: Temelji biokemije, Študentska založba, Ljubljana, 2005 Klasifikacija encimov in njihova vloga

encimsko katalizirana kemijska reakcija Kako encimi delujejo? nekatalizirana kemijska reakcija S ↔ P substrat produkt Substrat, vezan na aktivno mesto encima encimsko katalizirana kemijska reakcija E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P E – encim S – substrat P – produkt ES – kompleks encim-substrat EP – kompleks encim-produkt Encim predstavlja za molekule, ki reagirajo /substrate/, specifično okolje, reakcija poteče na aktivnem mestu encima

Reakcijski koordinatni diagram kemijske reakcije nekatalizirana reakcija in katalizirana reakcija nekatalizirana reakcija ΔG0‘ sprememba standardne proste energije pri prehodu S→P ΔG# S→P energijska bariera za prehod S → # (prehodno stanje) ΔG# P→S energijska bariera za prehod P → # (nekatalizirana reakcija) ΔG0‘nekatalizirana = ΔG0‘katalizirana katalizator ne vpliva na reakcijsko ravnotežje ES, EP intermediata katalizirane reakcije ΔG#cat energijska bariera katalizirane

Hitrost reakcije S → P določa hitrostna konstanta k V = k · [S] reakcija S → P V = k · [S1] · [S2] reakcija S1 + S2 → P k – hitrostna konstanta k – Boltzmanova konstanta h – Planckova konstanta ΔG# – aktivacijska energija R – splošna plinska konstanta T – temperatura

Primerjava nekatalizirane in katalizirane reakcije Nekatalizirana reakcija S ↔ P Ravnotežje Visoka aktivacijska energija Nizka reakcijska hitrost Reakcijski mehanizem preko prehodnega stanja Katalizirana z encimom E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P Ravnotežje Nizka aktivacijska energija Visoka reakcijska hitrost Reakcijski mehanizem preko drugih reakcijskih intermediatov Aktivacijska energija ΔG# pogojuje hitrost reakcije Katalizatorji pospešijo hitrost reakcije (znižajo aktivacijsko energijo), ne spremenijo pa ravnotežja reakcije

Reakcijski koordinatni diagram reakcije kemijska reakcija: S ↔ P encimsko katalizirana reakcija: E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P ΔG‘o = ΔG‘o = - RT ln K‘o ΔG#↓ V↑ Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Ravnotežna konstanta Kravn (Keq) in sprememba standardne proste energije ΔG‘o Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005 8,3 J/molK reakcija: S ↔ P ΔG‘o = - RT ln K‘eq 298 K

Značilnosti encimskih reakcij E + S ↔ ES ↔ ES1 ↔ ES2 ↔ EP ↔ E + P če je reakcija sestavljena iz zaporedja več reakcij, hitrost celotne reakcije določa najpočasnejša stopnja (najvišja aktivacijska energija) – “rate limiting step” energijske bariere so ključnega pomena za življenje – če jih ne bi bilo, bi se makromolekule spontano razgrajevale v osnovne gradnike ... tekom evolucije so se razvili encimi, ki selektivno znižujejo aktivacijsko bariero

Zvišanje reakcijske hitrosti z encimi – katalitična moč encimov Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

K energijski barieri ΔG# prispeva: Zmanjšanje entropije - manjša svoboda gibanja dveh molekul v raztopini Hidratacijski plašč vode obdaja biomolekule in jih stabilizira Deformiranje (prelom) substrata v reakciji Potreba po pravilnem prileganju katalitičnih funkcionalnih skupin encima s substratom Od kod energija za znižanje energijske bariere?

ES - komplementarnost substrata z vezavnim mestom na encimu Komplementarnost substrata in vezavnega mesta na encimu Zgodovina: Emil Fischer 1894 E vs. S - ključ v ključavnico Danes: Inducirano prilagajanje encima substratu Encim je komplementaren reakcijskemu prehodnemu stanju Aktivacijska energija se zniža zaradi sproščene vezavne energije ob nastanku šibkih interakcij med encimom in substratom

Prileganje substrata in encima Model mehanizma hipotetične reakcije razcepa substrata: A, ključ (substrat) v ključavnico (encim) B, encim je komplementaren reakcijskemu prehodnemu stanju A, Prileganje substrata in encima B, Inducirano prilagajanje encima substratu

Imaginarni encim, ki katalizira prelom kovinske palice Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Od kod katalitična moč? → nastanek kompleksa ES Prerazporeditev kovalentnih vezi med encimom in substratom – kemijske reakcije med funkcionalnimi skupinami aktivnega mesta encima (-R ak, ioni, koencimi) in substratom Prehodne kovalentne vezi aktivirajo substrat za reakcijo, znižajo aktivacijsko bariero → nizkoenergijska pot preko intermediatov Šibke interakcije med encimom in substratom (ES) – vezavna energija ΔGV (angl. ΔGB) zniža aktivacijsko bariero → nizkoenergijska pot preko intermediatov Šibke interakcije prispevajo h katalizi in k specifičnosti - pomen velikosti molekule encima Šibke interakcije so maksimalne v reakcijskem prehodnem stanju (aktivno mesta encima komplementarno prehodnemu stanju substrata)

Vezavna energija prispeva h katalizi in k specifičnosti Šibke interakcije 4 - 30 kJ/mol Znižanje ΔG# za 60 -100 kJ/mol Iste interakcije prispevajo k specifičnosti – maksimalno št. interakcij med encimon in substratom v prehodnem stanju (intermediatom) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Mehanizmi encimske katalize Kompleks ES stabilizirajo šibke interakcije Sledi razcep ES in nastanek vezi po različnih mehanizmih, ki vključujejo prehodni nastanek kovalentnih vezi - splošna kislinsko-bazna kataliza - kovalentna kataliza - kataliza s kovinskimi ioni

Mehanizem encimskih reakcij: Specifična/splošna kislinsko-bazna kataliza primer: razcep amida Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Kislinsko-bazna kataliza: Specifična - proton donor in proton akceptor je molekula H2O Splošna - proton donor in proton akceptor je druga molekula (šibke organske kisline ali šibke baze) Aktivna mesta encimov sestojijo iz šibkih kislin in šibkih baz → povišanje hitrosti reakcije za 102 do 105 x Večina encimskih reakcij poteka po mehanizmu sploške kislinsko-bazne katalize

Aminokislinski ostanki, ki lahko sodelujejo v splošni kislinsko-bazni katalizi Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

pK vrednosti ak, ki sodelujejo v splošni kislinsko bazni katalizi aminokislina pK1 pK2 pKR His 1,82 9,17 6,00 Glu 2,19 9,67 4,25 Lys 2,18 8,95 10,53 Cys 1,96 10,28 8,18 Tyr 2,20 9,11 10,07 Pozor: Vrednost pKR se lahko zelo spremeni, ko je ak vpeta v polipeptidno verigo – na disociacijo vplivajo bližnji –R v 3D srtukturi proteina

Ionizacijske oblike His in Glu pri različnih pH (ponovitev pojmov pK1, pK2, pKR)

Mehanizem encimskih reakcij: Kovalentna kataliza Med encimom in substratom nastane prehodna kovalentna vez Primer: hidroliza vezi med A in B Katalizator: encim z nukleofilno skupino X: se prehodno veže na substrat Reakcija poteče, če ta pot poteka preko nižje energijske bariere kot nekatalizirana reakcija

Primer kovalentne in kislinsko-bazne katalize: razcep peptidne vezi s kimotripsinom (v aktivnem mestu Ser) R2−NH2 stopnja: kovalentna kataliza stopnja: kislinsko-bazna kataliza Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

Mehanizem encimskih reakcij: Kataliza s kovinskimi ioni Kovinski ioni so ali trdno vezani na encim ali prihajajo iz okolja Ionske interakcije med ionom in substratom orientirajo substrat v položaj za reakcijo, stabilizirajo nabito reakcijsko prehodno stanje Sprosti se vezavna energija šibkih interakcij Lahko pride do izmenjave elektronov med kovinskim ionom in substratom (oksidoredukcijska reakcija) Približno ena tretjina encimov potrebuje kovinski ion za svojo aktivnost