Επίδραση της στέρησης τροφής στο μεταβολισμό του ήπατος Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων Άσκηση 6 Επίδραση της στέρησης τροφής στο μεταβολισμό του ήπατος 2016 Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ

[Glu] στο αίμα Γεύμα πλούσιο σε υδατάνθρακες Αποθηκεύεται στο ήπαρ και τους μύες με τη μορφή γλυκογόνου Αποθηκεύεται στο ήπαρ και τους μύες με τη μορφή γλυκογόνου Οξειδώνεται για τις ενεργειακές ανάγκες των ιστών C6H12O6 + 6O2 → 6CO2+ 6H2O + Ενέργεια

Η συγκέντρωση της γλυκόζης στο αίμα… πρέπει να είναι αυστηρά εντός συγκεκριμένων ορίων όταν μειώνεται σε επικίνδυνα επίπεδα … υπογλυκαιμία: εμφανίζονται συμπτώματα όπως ίλιγγοι, ταραχή, αδυναμία σωστής ομιλίας, λιποθυμία βλάβες στο νευρικό σύστημα αφού ο εγκέφαλος χρησιμοποιεί αποκλειστικά γλυκόζη για την παραγωγή ενέργειας Ανάμεσα σε δύο γεύματα το γλυκογόνο του ήπατος χρησιμοποιείται για να διατηρηθεί σταθερή η [Glu] στο αίμα

Ο μεταβολισμός διαφοροποιείται ανάλογα με τη διαθεσιμότητα της τροφής Στέρηση Τροφής Πρόσβαση σε Τροφή Σύνθεση ενεργειακών αποθεμάτων Γλυκογόνου Τριγλυκεριδίων Πρωτεϊνών Αποδόμηση Γλυκογόνου Τριγλυκεριδίων Πρωτεϊνών

Στέρηση Τροφής Κατανάλωση της γλυκόζης Κατανάλωση του γλυκογόνου του ήπατος τις πρώτες 24-48 ώρες (γλυκογονόλυση) Γλυκονεογένεση: το ήπαρ παράγει 6-P-γλυκόζη από μη υδατανθρακικές πρόδρομες ενώσεις (παρέχονται στο ήπαρ από το αίμα): γαλακτικό οξύ που προέρχεται από το γλυκογόνο των μυών γλυκερόλη η οποία προέρχεται από το μεταβολισμό των λιπών αμινοξέα που προέρχονται από την αποδόμηση των πρωτεϊνών

6-Ρ-γλυκόζη + Η2Ο Γλυκόζη + Pi Φωσφατάση 6-Ρ-γλυκόζη + Η2Ο Γλυκόζη + Pi 1ος σκοπός της άσκησης είναι να μελετηθεί η μεταβολή στη δραστικότητα της φωσφατάσης της 6-P γλυκόζης μετά από μια περίοδο στέρησης τροφής Η 6-Ρ πρέπει να μετατραπεί σε γλυκόζη για να περάσει τη μεμβράνη των ηπατικών κυττάρων και να απελευθερωθεί στο αίμα. Τι περιμένουμε να συμβεί στη δραστικότητα της φωσφατάσης;

Πειραματική Διαδικασία Θυσιάζουμε δύο πειραματόζωα: Το Α είχε ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή, ενώ το Β είχε στερηθεί τροφή, για τουλάχιστον 48 ώρες. Αφαιρούμε το ήπαρ και το ομογενοποιούμε σε αναλογία 1:20.

6-Ρ-γλυκόζη + Η2Ο Γλυκόζη + Pi Προσδιορισμός της δραστικότητας της φωσφατάσης της 6-φωσφορικής γλυκόζης Φωσφατάση 6-Ρ-γλυκόζη + Η2Ο Γλυκόζη + Pi Η μέθοδος προσδιορισμού στηρίζεται στη μέτρηση του ανόργανου φωσφορικού (Pi) που παράγεται.

6-Ρ-γλυκόζη + Η2Ο Γλυκόζη + Pi Ενζυμική αντίδραση Η δραστικότητα ενός ενζύμου υπολογίζεται σε moles του υποστρώματος που καταναλώνονται ή σε moles του προϊόντος που παράγεται ανά γραμμάριο βάρους του ιστού ανά λεπτό. 6-Ρ-γλυκόζη + Η2Ο Γλυκόζη + Pi Φωσφατάση Όταν μελετούμε μια ενζυμική αντίδραση μετράμε την δραστικότητα του ενζύμου. υπόστρωμα ομογενοποίημα Υπόστρωμα, εκχύλισμα (ένζυμο), χρόνος, προϊόν

“Φωτομετρική” αντίδραση Χρησιμοποιείται για να υπολογιστεί η ποσότητα του παραγόμενου προϊόντος της ενζυμικής αντίδρασης Η προς υπολογισμό ουσία ή κάποιο παράγωγό της αλληλεπιδρά με κάποια άλλη ουσία και το σύμπλοκο που δημιουργείται απορροφά φως συγκεκριμένου μήκους κύματος. Ασκορβικό οξύ Pi +  (NH4)2MoO4 (ΝΗ4)3[ΡΜο12Ο40] Mπλε Mολυβδαινίου 660nm

Στη φωτομετρική αντίδραση, απαιτείται η χρήση «τυφλού» και «πρότυπου»

Τυφλό… Περιέχει όλες τις ουσίες που χρησιμοποιούνται στην αντίδραση εκτός από την ουσία την ποσότητα της οποίας θέλουμε να υπολογίσουμε. Χρησιμοποιείται για να μηδενιστεί το φωτόμετρο και έτσι να αφαιρεθεί η απορρόφηση που δεν οφείλεται στην προς μέτρηση ουσία.

Πρότυπο διάλυμα Διάλυμα γνωστής συγκέντρωσης ή ποσότητας της προς προσδιορισμό ουσίας Μέτρηση οπτικής πυκνότητας (OD) Ένα διάλυμα ή πρότυπη καμπύλη

Στην ενζυμική αντίδραση, απαιτείται η χρήση «μάρτυρα».

Ο μάρτυρας… Περιέχει όλες τις ουσίες που χρησιμοποιούνται σε μια ενζυμική αντίδραση εκτός του υποστρώματος (MO) του ομογενοποιήματος/εκχυλίσματος (MY). Χρησιμοποιείται για να υπολογιστεί η προς υπολογισμόν ουσία που παράγεται ΜΟΝΟΝ από την ενζυμική αντίδραση και όχι από Προσμίξεις που υπάρχουν στα χημικά Ουσία προϋπάρχουσα στο εκχύλισμα Οι απορροφήσεις των μαρτύρων αφαιρούνται από την απορρόφηση των δειγμάτων που περιέχουν και το υπόστρωμα και το ένζυμο.

Όταν μελετούμε ενζυμικές αντιδράσεις χρησιμοποιούμε «μάρτυρα» (ενζυμική), «τυφλού» (φωτομετρική) και «πρότυπου» (φωτομετρική) δείγματος.

Συνολικός όγκος αντίδρασης: 1 ml ODΔ- ODΜΥ- ODΜΟ Ρυθμιστικό διάλυμα (0,1Μ Tris/HCl pH 7,6)   0,5 EDTA 10mM 0,1 6-Ρ γλυκόζη (5mM) - 0,2 Διαλύματα (ml) α1 α2 α3 α4 α5 Η2Ο  Προεπωάζουμε τους σωλήνες για 5 λεπτά στους 37°C και αρχίζουμε την αντίδραση προσθέτοντας τα ομογενοποιήματα ως εξής:   Ομογενοποίημα Α (ml) Ομογενοποίημα Β (ml) α1 0,2 - α2 α3 α4 α5 Δ ΜΟ ΜΥ Συνολικός όγκος αντίδρασης: 1 ml ODΔ- ODΜΥ- ODΜΟ

Αναμιγνύουμε και επωάζουμε για 15 λεπτά στους 37°C. Τερματίζουμε την αντίδραση προσθέτοντας 1ml 10% (κ.ο) τριχλωροξικού οξέος (TCA). Φυγοκεντρούμε στις 3000 στροφές/λεπτό για 3 λεπτά. Από κάθε σωλήνα παίρνουμε 1ml από τα 2ml του υπερκείμενου για τον προσδιορισμό του ανόργανου φωσφορικού και το μεταφέρουμε α'1-α'5 (φωτομετρική αντίδραση). Στο σωλήνα α'6 προσθέτουμε νερό και τον χρησιμοποιούμε ως Σειρά μεταφοράς: α2>α1>α4>α3>α5 τυφλό.

ΠΙΝΑΚΑΣ 6.2: Φωτομετρική Αντίδραση Διαλύματα (ml) α'1 α'2 α'3 α'4 α'5 α'6 Τ Δείγμα 1,0 - H2O 1,5 2,5 (1%) Ασκορβικό οξύ 1 (5%) (NH4)2MoO4 0,2 6N H2SO4 0,3 Αναμιγνύουμε και επωάζουμε για 15΄ σε θερμοκρασία δωματίου. Μετρούμε την απορρόφηση του μπλε χρώματος στα 650 nm (ODΔ- ODΜΥ- ODΜΟ)

Κατασκευή Προτύπου Καμπύλης Φωσφορικών

απορρόφησης – ποσότητας (μmoles) ανόργανου φωσφορικού. ΠΙΝΑΚΑΣ 4.4 Διαλύματα (ml) Δοκιμαστικοί σωλήνες   2 3 4 5 6 7 Πρότυπο διάλυμα Pi (1,25mΜ) - 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1,0 H2O 2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2,0 1,5 (1%) Aσκορβικό οξύ 1 (5%) (NH4)2MoO4 6Ν H2SO4 Επωάζουμε για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και μετρούμε την οπτική πυκνότητα στα 650 nm. Κατασκευάζουμε τη γραφική παράσταση απορρόφησης – ποσότητας (μmoles) ανόργανου φωσφορικού.

Πρότυπη καμπύλη φωσφορικών Για την πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιείται διάλυμα Κ2ΗΡΟ4 συγκέντρωσης 1,25mM. Υπολογίστε την ΠΟΣΟΤΗΤΑ, σε μmols, των ΡΟ43- σε κάθε σωλήνα και σχεδιάστε πρότυπη καμπύλη.

Ροζ: γλυκογόνο σε ηπατοκύτταρα (καφέ: πυρήνας) Αφού το «ροζ» εξαντληθεί και ο οργανισμός εξακολουθεί να μην έχει πρόσβαση σε τροφή…

Για παράδειγμα η αργινάση καταλύει την αντίδραση: Αν η έλλειψη τροφής συνεχιστεί ο οργανισμός στρέφεται σε άλλες πηγές για παραγωγή ενέργειας λίπη Κετονοσώματα πρωτεΐνες Από τον καταβολισμό των πρωτεϊνών προκύπτουν αμινοξέα τα οποία μεταβολίζονται περαιτέρω. Για παράδειγμα η αργινάση καταλύει την αντίδραση:   Αργινίνη + Η2Ο Ορνιθίνη + Ουρία Αργινάση Αργινάση: το πιο σημαντικό από τα ένζυμα του κύκλου της ουρίας μέσω του οποίου παράγεται η ουρία (το τελικό προϊόν του μεταβολισμού των πρωτεϊνών)

Αργινίνη + Η2Ο -----> Ορνιθίνη + Ουρία 2ος σκοπός της άσκησης είναι να δειχθούν οι μεταβολές στην δραστικότητα της αργινάσης μετά από μία περίοδο στέρησης τροφής. Αργινάση Αργινίνη + Η2Ο -----> Ορνιθίνη + Ουρία  Ο προσδιορισμός της δραστικότητας του ενζύμου γίνεται με τη μέτρηση του ποσού της ουρίας που απελευθερώνεται από την αντίδραση.

Πειραματική Διαδικασία, Β’ μέρος Θυσιάζουμε δύο πειραματόζωα: Το Α είχε ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή, ενώ το Β είχε στερηθεί τροφή, για τουλάχιστον 48 ώρες. Αφαιρούμε το ήπαρ και το ομογενοποιούμε σε αναλογία 1:120.

Η OD στο Δείγμα β5 και β3 που οφείλεται στην δράση της αργινάσης ΠΙΝΑΚΑΣ 6.3 Αργινίνη (0,5Μ) - 1 MnSO4 (4mM) 0,5 Διαλύματα(ml) β1 M β2 β3 Δ β4 β5 H2O Προεπωάζουμε για 5 λεπτά, σε 37°C και προσθέτουμε τα εκχυλίσματα ήπατος (αραιωμένα κατά την ομογενοποίηση 1: 120 w/v): Eκχύλισμα Α΄ (ml) 0,5 -   β1 β2 β3 β4 β5 Eκχύλισμα Β΄ (ml) Η OD στο Δείγμα β5 και β3 που οφείλεται στην δράση της αργινάσης Είναι: ODβ5- ODβ4- ODβ2 και ODβ3- ODβ1- ODβ2

Αναμιγνύουμε και επωάζουμε για 20 λεπτά στους 37°C. Τερματίζουμε την αντίδραση με προσθήκη 2,5ml 10% υπερχλωρικού οξέος (PCA). Το δείγμα αραιώνεται στα Φυγοκεντρούμε Φωτομετρική αντίδραση Μεταφέρουμε 0,02ml από το υπερκείμενο κάθε σωλήνα και τα μεταφέρουμε σε αντίστοιχους σωλήνες β'1-β'5 για να προσδιορίσουμε την ουρία σειρά μεταφοράς β1, β4, β2, β3, β5 0,5ml 4,5 ml.

Πίνακα 6.4. β'6: πρότυπο διάλυμα ουρίας (400 mg/l, MB 60) Υπερκείμενο 0,02 - Πρότυπο διάλυμα ουρίας Διαλύματα (ml) β'1 β'2 β'3 β'4 β'5 β'6 Η2Ο Αντιδραστήριο Α 2 Αντιδραστήριο B 2 2 2 2 2 2 2 β'7 β'6: πρότυπο διάλυμα ουρίας (400 mg/l, MB 60)

Για τους υπολογισμούς… Αφαιρέσεις μαρτύρων Ποιοι σωλήνες αντιστοιχούν στα δείγματα «μάρτυρες», και ποιοι στα «δείγματα»; Ποια είναι η απορρόφηση που οφείλεται αποκλειστικά στην παραγωγή του προϊόντος; Ποιο είναι το προϊόν της αντίδρασης που μετρούμε και σε ποιον όγκο δείγματος το μετράμε; Για πόσο χρόνο πραγματοποιήθηκε η αντίδραση;

Υπολογισμοί Ξεκινάμε πάντα από τον τελευταίο πίνακα. Αφαιρούμε τις ΟΠ των μαρτύρων ΟΠα3΄-ΟΠα1΄-ΟΠα2΄ ΟΠα5΄-ΟΠα4΄-ΟΠα2΄ Χρησιμοποιώντας την πρότυπη καμπύλη φωσφορικών υπολογίζουμε την ποσότητα των φωσφορικών (Φ μmols).

Υπολογισμοί Τα Φ μmols περιέχονται στο 1ml Τα 2Φμmols παρήχθηκαν σε 2ml αντίδρασης, τα οποία περιείχαν ml ομογενοποιήματος 0,2

Υπολογισμοί Τα 2Φ μmoles προέρχονται από 0.2 ml ομογενοποίημα Χ; 20 ml Διαιρούμε με το 15 και παίρνουμε τα μmoles φωσφορικών ανά g ανά λεπτό

Υπολογισμοί Β’ μέρους 1. Υπολογίζουμε τη συγκέντρωση του προτύπου της ουρίας. 400 mg ουρίας/l, 1M ουρίας είναι 60 g X; τα 0.4 g X=6.6 mmoles/l ή 6.6 μmoles/ml 2. Υπολογίζουμε τις συγκεντρώσεις των δειγμάτων αφού αφαιρέσουμε τις τιμές των μαρτύρων Τα 6.6 μmoles/ml δίνουν OD Προτύπου Χ; OD Δείγματος Χ= 6.6 μmoles/ml x OD Δείγμ/ OD Προτ = α μmoles/ml Σημείωση: Η αναλογία προϊόντος-αντιδρώντος είναι 1:1

3. Στο 1 ml περιέχονται α μmoles Στα 4,5 ml χ; χ=4,5 x α μmoles=β μmoles 4. Τα 4,5ml περιείχαν 0,5ml ομογενοποιήματος. Τα 0,5 ml ομογενοποιήματος παρήγαγαν β μmoles ουρίας Τα 120 ml X; Χ=βx120/0,5 μmoles ανά g. 5. Διαιρούμε με το 20 και παίρνουμε τα μmoles ουρίας ανά g ανά λεπτό