04 - Μεταθετά στοιχεία στο γονιδίωμα - DNA τρανσποζόνια

Το DNA δεν παραμένει αναλλοίωτο Barbara Mc Clintock (τέλη δεκαετίας 40): "παράξενα" γενετικά στοιχεία έχουν την ικανότητα να κατευθύνουν τα ίδια τη μετάθεσή τους μέσα στο γονιδίωμα Γεννήθηκε: 16 Ιουνίου 1902 Πέθανε: 2 Σεπτεμβρίου 1992 Nobel Ιατρικής ή Φυσιολογίας: 1983

Τα στοιχεία ελέγχου Ds στο καλαμπόκι

Μελέτη του μηχανισμού του μωσαϊκού χρώματος του καλαμποκιού και της κληρονομικότητάς του ↓ Ύπαρξη δύο γενετικών στοιχείων (Ac και Ds) με τη δυνατότητα να ενσωματώνονται και να απομακρύνονται στο γονιδίωμα

Πρότυπο έκφρασης της ανθοκυανίνης Σταθερές μεταλλαγές: όλοι οι σπόροι χρώμα λευκό (όχι Αc, Ds αναστέλλει την έκφραση των ανθοκυανινών) Ασταθείς μεταλλαγές: συχνή επανεμφάνιση μοβ χρώματος (παρουσία Ac → Ds μετακινείται με συνέπεια την εμφάνιση μοβ χρώματος) Διασταυρώσεις ανάμεσα σε φυτά με ασταθείς μεταλλάξεις και φυτά με σταθερές → υψηλή συχνότητα αγρίου τύπου ↓ Ύπαρξη δύο γενετικών στοιχείων (Ac και Ds) με τη δυνατότητα να ενσωματώνονται και να απομακρύνονται στο γονιδίωμα

Η Barbara McClintock παρατήρησε σπάνιους, παράξενους και μη αναμενόμενους φαινότυπους σπόρων στους απογόνους των διασταυρώσεων που πραγματοποίησε Στο παράδειγμα αυτό, η παρουσία του Ac αναγκάζει το Ds να αποκοπεί και το ακκεντρικό τμήμα που δημιουργείται χάνεται. Το αποτέλεσμα είναι ημιζυγωτία για όλους τους τόπους που χάνονται με το ακκεντρικό τμήμα, επιτρέποντας στους υπολειπόμενους χαρακτήρες να εκφραστούν στους απογόνους του κυττάρου που υπέστη αυτή τη θραύση νωρίς στην ανάπτυξη του σπόρου. Για το λόγο αυτό δημιουργείται ένας μωσαϊκός φαινότυπος.

Στο παράδειγμα αυτό, το Ds εντίθεται στο C νωρίς κατά την ανάπτυξη του σπόρου, καταστέλλοντας την παραγωγή χρωστικής. Στη συνέχεια, σε μερικά από τα προκύπτοντα κύτταρα το Ds ξαφνικά εξαφανίζεται. Αυτό επιτρέπει την επανεμφάνιση της φυσιολογικής λειτουργίας του C και οι περιοχές απ’ όπου έφυγε το Ds μπορούν πλέον να παράγουν χρωστική. Αυτό είναι ένα παράδειγμα του πώς ένα μεταθετό στοιχείο (Ds) μπορεί να παράγει έναν ασταθή φαινότυπο: η έκφραση αλλάζει σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές και σε διαφορετικές χρονικές στιγμές, γιατί ποτέ δεν ξέρει κανείς πότε θα φύγει το Ds επιτρέποντας το γονίδιο να επανακτήσει την αρχική του λειτουργία.

Αυτόνομα και μη αυτόνομα στοιχεία

Τα μεταθετά στοιχεία Ac και Ds στο καλαμπόκι.

Αλληλουχίες ένθεσης (IS)

Τα τρανσποζόνια φέρουν ανάστροφες επάκριες επαναλήψεις και δημιουργούν ομόρροπες επαναλήψεις στο DNA που βρίσκεται εκατέρωθεν της θέσης ένθεσης. Σε αυτό το παράδειγμα, ο στόχος του τρανσποζονίου είναι μια αλληλουχία 5 bp. Τα άκρα του τρανσποζονίου αποτελούνται από ανάστροφες επαναλήψεις 9 bp, όπου οι αριθμοί 1 ως 9 αντιπροσωπεύουν μια αλληλουχία από ζεύγη βάσεων. cis-δραστικές μεταλλάξεις που αποτρέπουν τη μετάθεση εντοπίζονται στα άκρα

Τα σύνθετα τρανσποζόνια φέρουν μονάδες IS

Γονιδιακή κινητοποίηση από σύνθετα τρανσποζόνια Γονιδιακή κινητοποίηση από σύνθετα τρανσποζόνια. Τα στοιχεία IS είναι οι δομικοί λίθοι μιας ακόμη πιο περίπλοκης δομής που ονομάζεται σύνθετο τρανσποζόνιο, η οποία σχηματίζεται όταν ένα στοιχείο IS εισάγεται εκατέρωθεν ενός ή περισσότερων γονιδίων. Όταν χρησιμοποιούνται για μετάθεση τα εξώτερα άκρα των δύο στοιχείων IS, επιτρέπουν τη μετακίνηση ολόκληρου του σύνθετου τρανσποζονίου (των δύο στοιχείων IS και των γονιδίων που βρίσκονται ανάμεσά τους). Με την πάροδο του χρόνου, το γονίδιο της τρανσποζάσης στο ένα στοιχείο IS μπορεί να χάσει τη λειτουργία του, με αποτέλεσμα η κινητοποίησή του να βασίζεται πλέον στο αντίστοιχο γονίδιο τρανσποζάσης που κωδικοποιείται από το άλλο στοιχείο IS.

Εικόνα 16.3 Ένα σύνθετο τρανσποζόνιο έχει μία κεντρική περιοχή η οποία φέρει δείκτες (όπως γονίδια ανθεκτικότητας σε φάρμακα) και περικλείεται από μονάδες IS. Οι μονάδες έχουν βραχείες ανάστροφες επάκριες επαναλήψεις. Αν οι μονάδες έχουν αντίθετο προσανατολισμό, οι βραχείες ανάστροφες επάκριες επαναλήψεις στα άκρα του τρανσποζονίου είναι πανομοιότυπες. Όταν οι δυο μονάδες IS είναι ίδιες, οποιαδήποτε μπορεί να προωθήσει τη μετάθεση. Όταν η μία εμφανίζει μειωμένη λειτουργικότητα, η μετάθεση εξαρτάται αποκλειστικά από την άλλη.

Μέσω ποιου μηχανισμού εξασφαλίζεται η μετάθεση ολόκληρου του σύνθετου τρανσποζονίου και όχι μιας μόνο μονάδας IS;

Εικόνα 16.4 Δύο μονάδες IS10 δημιουργούν ένα σύνθετο τρανσποζόνιο που μπορεί να κινητοποιήσει όποια περιοχή DNA βρίσκεται ανάμεσά τους. Όταν το Tn10 είναι μέρος ενός μικρού κυκλικού μορίου, οι επαναλήψεις IS10 μπορούν να κινητοποιήσουν τη μετάθεση οποιουδήποτε από τα δύο μισά του κύκλου Η συχνότητα μετάθεσης για τα σύνθετα τρανσποζόνια μειώνεται καθώς αυξάνεται η απόσταση ανάμεσα στις μονάδες IS. Αυτό περιορίζει το μέγεθος των σύνθετων τρανσποζονίων. Κάτω όμως από συνθήκες επιλογής των δεικτών που φέρουν στην κεντρική περιοχή τα σύνθετα τρανσποζόνια, η συχνότητα μετάθεσης μπορεί να αυξηθεί σημαντικά.

Η ανατομία του σύνθετου τρανσποζονίου Tn5 Το τρανσποζόνιο Tn5 φέρει στοιχεία IS σε κάθε του άκρο: IS50L στο αριστερό άκρο και IS50R στο δεξί Το εξωτερικό άκρο κάθε στοιχείου IS συμβολίζεται με ΟΕ και το εσωτερικό άκρο με ΙΕ Το άκρο IS50R έχει ένα λειτουργικό γονίδιο Tnp, το οποίο κωδικοποιεί μια ενεργό τρανσποζάση, ενώ το IS50L όχι Τα KanR, BleR και StrR αντιστοιχούν σε γονίδια που προσδίδουν ανθεκτικότητα στην καναμυκίνη, στην μπλεομυκίνη και στη στρεπτομυκίνη αντίστοιχα.

Η ανατομία του σύνθετου τρανσποζονίου Tn10 Το Tn10 φέρει επίσης στοιχεία IS σε κάθε του άκρο, IS10L και IS10R Μόνο το IS10 R φέρει λειτουργικό γονίδιο Tnp που κωδικοποιεί για μια ενεργό τρανσποζάση Το TetR αντιστοιχεί στο γονίδιο ανθεκτικότητας στην τετρακυκλίνη

Τα μεταθετά στοιχεία DNA μετακινούνται μέσω δύο διαφορετικών μηχανισμών Αποκοπή και επικόλληση (μη αντιγραφικός μηχανισμός) Αντιγραφή και ανασυνδυασμός (αντιγραφικός μηχανισμός)

Μετάθεση του Tn5 με μη αντιγραφικό μηχανισμό Πρόσδεση Κοπή Αναγνώριση στόχου Επικόλληση

Η κρυσταλλική δομή της τρανσποζάσης του Tn5 βοήθησε να αποσαφηνιστεί ο τρόπος κοπής των άκρων του τρανσποζονίου Στο ενεργό κέντρο του ενζύμου υπάρχουν δύο κατάλοιπα ασπαρτικού οξέος (κίτρινα) και ένα γλουταμικού (κόκκινο) (οικογένεια τρανσποζασών DDE) Αυτά τα όξινα κατάλοιπα προσδένουν απαραίτητους συμπαράγοντες δισθενών ιόντων (μοβ σφαίρα: ιόν μαγνησίου)

Μηχανισμός κοπής του Tn5 από το DNA-δότη

Μηχανισμός ένθεσης του Tn5 στο DNA-στόχο 5’-AGNTYWRANTCT-3’ Μηχανισμός ένθεσης του Tn5 στο DNA-στόχο

Συντονισμός της μετάθεσης με την αντιγραφή του DNA (Tn5) Μετάθεση του Tn10 ή του Tn5 μετά το πέρασμα μιας διχάλας αντιγραφής. Η μετάθεση ενεργοποιείται από την παρουσία ημιμεθυλιωμένου DNA, ακριβώς μετά την αντιγραφή. Αυτό συμβαίνει διότι η τρανσποζάση προσδένεται ικανοποιητικά μόνο σε ημιμεθυλιωμένο DNA. Το αποτέλεσμα είναι ότι από ένα αντίγραφο στο μητρικό χρωμόσωμα καταλήγουμε με 4 στα δύο θυγατρικά.

Η μετάθεση του Tn10 υπόκειται σε πολλαπλούς ελέγχους Ένα τρανσποζόνιο πρέπει να διατηρεί μια ελάχιστη συχνότητα μετάθεσης για να μην εκλείψει. Όμως, μια υψηλή συχνότητα μετάθεσης θα μπορούσε να είναι καταστροφική για τον ξενιστή.

Δύο υποκινητές με αντίθετο προσανατολισμό βρίσκονται κοντά στο όριο μεταξύ του IS10R και του DNA του ξενιστή. Ο πιο ισχυρός υποκινητής POUT προωθεί τη μεταγραφή προς το παράπλευρο DNA του ξενιστή. Ο πιο αδύναμος υποκινητής ΡΙΝ προωθεί τη μεταγραφή ενός RNA που εκτείνεται κατά μήκος του IS10R και μεταφράζεται σε τρανσποζάση. Συνήθως υπάρχουν ~5 αντίγραφα RNA του POUT ανά αντίγραφο του ΡΙΝ.

Πολλοί μηχανισμοί περιορίζουν τη συχνότητα μετάθεσης του Tn10, επηρεάζοντας είτε τη σύνθεση είτε τη λειτουργία της τρανσποζάσης. Η μετάθεση ενός μεμονωμένου τρανσποζονίου περιορίζεται από μεθυλίωση, έτσι ώστε να συμβαίνει μόνο μετά από αντιγραφή. Σε περιπτώσεις πολλαπλών αντιγράφων, η προτίμηση της τρανσποζάσης για cis-δραστικότητα περιορίζει τη δυνατότητα επιλογής του στόχου, ενώ το ζευγάρωμα των μορίων RNA που μεταγράφονται από τους υποκινητές POUT και PIN αναστέλλει τη σύνθεση της τρανσποζάσης.

Η μεθυλίωση αποτελεί τον πιο σημαντικό παράγοντα ελέγχου Η ικανότητα του IS10 να μετατίθεται σχετίζεται με τον κύκλο της αντιγραφής μέσω της απόκρισης στο πρότυπο μεθυλίωσης δύο θέσεων. Η συχνότητα μετάθεσης αυξάνεται >1000x σε dam- στα οποία οι δυο θέσεις δεν είναι μεθυλιωμένες. Πώς: αντιγραφή → ημιμεθυλίωση αύξηση PIN μεταγραφής Ενίσχυση πρόσδεσης τρανσποζάσης στο άκρο IS10R

Η μετάθεση του TnA με αντιγραφικό μηχανισμό Η οικογένεια TnA περιλαμβάνει μεγάλα (~5kb) τρανσποζόνια. Δεν είναι σύνθετα τρανσποζόνια αλλά ανεξάρτητες μονάδες που μεταφέρουν γονίδια υπεύθυνα για τη μετάθεση αλλά και ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά. Τα μέλη της οικογένειας TnA μετατίθενται μέσω αντιγραφικού μηχανισμού.

Η μετάθεση του Τn3 επιτυγχάνεται μέσω αντιγραφής και ανασυνδυασμού.

Τα τρανσποζόνια της οικογένειας TnA φέρουν ανάστροφες επάκριες επαναλήψεις (IR), μία εσωτερική θέση res και τρία γνωστά γονίδια (tnpA, tnpR και ampR). Η tnpA είναι η μεταθετάση H tnpR έχει ρόλο ρεζολβάσης αλλά δρα και ως καταστολέας της γονιδιακής έκφρασης → απενεργοποίηση TnpR αυξάνει την TnpA και κατά συνέπεια αυξάνει η μετάθεση Τι επίδραση έχουν οι μεταλλάξεις στο γονίδιο tnpA και τι εκείνες στο tnpR? Τι επίδραση έχουν οι μεταλλάξεις στην περιοχή res? Σε μεταλλάγματα tnpR θα προχωρήσει η μετάθεση αν παρέχουμε εξωτερική πηγή ρεσολβάσης; Σε μεταλλάγματα res θα προχωρήσει η μετάθεση αν παρέχουμε εξωτερική πηγή ρεσολβάσης;

Πώς γίνεται η επιλογή της θέσης-στόχου; Τρανσποζάση: Ειδικότητα ως προς πρότυπη ακολουθία Ειδικότητα ως προς ιδιαίτερη δομή DNA Κάμψη Σύμπλοκο DNA-πρωτεΐνης: εισαγωγή σε υποκινητές (Ty1, Ty3 σε υποκινητές της pol III) Τυχαία επιλογή

Τα τρανσποζόνια είναι χρήσιμα εργαλεία

Γονίδια αναφοράς Παρακολούθηση αποικιών κάτω από διαφορετικές συνθήκες αύξησης (πχ στρες, βλάβες DNA, ακραίες θερμοκρασίες, τοξικές ενώσεις, έλλειψη θρεπτικών ουσιών) προς εντοπισμό γονιδίων που επάγονται από συγκεκριμένο σύνολο συνθηκών

Εργαλεία για γενικευμένη μεταλλαξιγένεση και κλωνοποίηση Τα τρανσποζόνια είναι χρήσιμα ως μεταλλαξιγόνοι παράγοντες διότι μετά την ένθεσή τους σε ένα γονίδιο του οποίου διαταράσσουν τη λειτουργία είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν για την κλωνοποίησή του.

Οι άγνωστες αλληλουχίες που περιβάλλουν μία γνωστή αλληλουχία ένθεσης πολλαπλασιάζονται μέσω ανάστροφης PCR.

Εργαλεία για τη δημιουργία διαγονιδιακών οργανισμών

Μετασχηματισμός μέσω Ρ στη Drosophila

Enhancer trap ΕΙΚΟΝΑ 7.13: Ένα τροπο-ποιημένο στοιχείο Ρ που φέρει γονίδια-δείκτες χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό ενισχυτών σε ολόκληρο το γονιδίωμα.

Η υβριδική δυσγένεση στη Drosophila

Η υβριδική δυσγένεση είναι ασύμμετρη· επάγεται από διασταυρώσεις «Μ θηλυκό  Ρ αρσενικό», αλλά όχι από διασταυρώσεις «Ρ θηλυκό  Μ αρσενικό».

Με κατασκευή ανασυνδυασμένων χρωμοσωμάτων έχει βρεθεί ότι πολλές περιοχές πάνω σε κάθε χρωμόσωμα Ρ είναι σε θέση να προκαλέσουν δυσγένεση Η φύση αυτών των αλληλουχιών ανακαλύφθηκε με χαρτογράφηση του DNA των μεταλλαγμάτων w που απαντώνται στα δυσγενικά υβρίδια. Όλες οι μεταλλάξεις φάνηκε ότι προκαλούνταν από την ένθεση τμημάτων DNA στο γενετικό τόπο w. Η ένθεση απενεργοποιεί το γονίδιο, προκαλώντας το φαινότυπο "λευκά μάτια", από τον οποίο πήρε το όνομά της η μετάλλαξη. Η ένθετη αλληλουχία είναι το στοιχείο Ρ.

Η μετάθεση συμβαίνει με "μη αντιγραφικό" μηχανισμό (όπως του Tn10) Η υβριδική δυσγένεση είναι αποτέλεσμα μεταλλάξεων οι οποίες προκύπτουν στη θέση-στόχο από την ένθεση του στοιχείου που μετατίθεται και ρήξεων, οι οποίες δημιουργούνται στη θέση δότη μετά την απομάκρυνση του στοιχείου και δεν επιδιορθώνονται

Στελέχη της D. melanogaster που αιχμαλωτίστηκαν στη φύση >30 χρόνια πριν είναι πάντα τύπου Μ. Επειδή η υβριδική δυσγένεση μειώνει την επιμειξία αποτελεί ένα βήμα προς την ειδογένεση.

Tropp, Κεφάλαιο 11 Genes VIII: Watson, Κεφάλαιο 7 16.2 και 16.3 16.9, 16.10 και 16.11 16.14 και 16.15 Watson, Κεφάλαιο 7