Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης Γ΄ Τάξης Ενιαίου Λυκείου Κεφάλαιο 2ο : Αντιγραφή, έκφραση και ρύθμιση της γενετικής πληροφορίας Θοδωρής Καλαϊτζής

Το DNA αυτοδιπλασιάζεται Watson & Crick (1953): «…είναι φανερό ότι το ειδικό ζευγάρωμα που έχουμε υποθέσει ότι δημιουργείται μεταξύ των βάσεων του DNA προτείνει έναν απλό μηχανισμό αντιγραφής του γενετικού υλικού…»  Κανόνας συμπληρωματικότητας βάσεων. Κάθε αλυσίδα-> Καλούπι για τη σύνθεση μιας νέας συμπληρωματικής αλυσίδας-> 2 θυγ. μόρια: πανομοιότυπα με μητρικό & καθένα έχει 1 παλιά και 1 νέα αλυσίδα  Ημισυντηρητικός τρόπος διπλασιασμού. Θοδωρής Καλαϊτζής

Watson & Crick (μην τρομάξετε…) Θοδωρής Καλαϊτζής

Στην αντιγραφή του DNA συνεργάζονται πολλά ένζυμα Πολύχρονη ερευνητική μελέτη: Αντιγραφή περίπλοκη -> «Οπλοστάσιο» εξειδικευμένων ενζύμων & άλλων πρωτεϊνών για… Ταυτόχρονη λειτουργία & Κατάλυση χημικών αντιδράσεων αντιγραφής με εκπληκτική ακρίβεια. E. coli: Μελέτη αντιγραφής, λόγω μικρού DNA και απλής οργάνωσης (σε σχέση με ευκαρ.) Βασικά στάδια  Ομοιότητες σε προκ. & ευκαρ. Θοδωρής Καλαϊτζής

Αντιγραφή (1) Θοδωρής Καλαϊτζής

Θέσεις έναρξης της αντιγραφής Ξεκίνημα αντιγραφής από καθορισμένα σημεία DNA βακτηρίων  Κυκλικό  1 μόνο θ.ε.α.  Αντιγραφή σε 20 λεπτά (ευνοϊκές συνθήκες) DNA ευκαρ.  Πολυάριθμες θ.ε.α. σε κάθε χρωμόσωμα  Αντιγραφή DNA ταυτόχρονα από 100άδες σημεία σε όλο το μήκος & Επακόλουθη ένωση δημιουργούμενων τμημάτων Αντίφαση: DNA ανωτ. ευκ. 1.000 φορές μεγαλύτερο από προκ., αλλά γρήγορη αντιγραφή (και με ακρίβεια). Θοδωρής Καλαϊτζής

DNA ελικάσες Ξετύλιγμα των 2 αλυσίδων στις θ.ε.α. με σπάσιμο των δ. Η μεταξύ τους. Άνοιγμα διπλής έλικας -> Δημιουργία θηλιάς (ορατής σε Η.Μ. – εικ. 2.2α) που αυξάνεται και προς τις 2 κατευθύνσεις (Ξετύλιγμα -> Δημιουργία υπερελίκων -> Παρεμπόδιση ξετυλίγματος DNA Λύση: Αποελικάσες ή Υπερελικάσες -> Καταστροφή υπερελίκων Θοδωρής Καλαϊτζής

Αντιγραφή (2) Θοδωρής Καλαϊτζής

DNA πολυμεράσες (1) Κύρια ένζυμα αντιγραφής ΜΗ ικανότητα έναρξης αντιγραφής [ΠΡΙΜΟΣΩΜΑ: ειδικό σύμπλοκο πολλών ενζύμων -> σύνθεση μικρών τμημάτων RNA (πρωταρχικά τμήματα-RNA primers) – συμπληρωματικών προς μητρικές αλυσίδες Επιμήκυνση πρωταρχικών τμημάτων (προσοχή: συμπληρωματικά δεοξυριβονου-κλεοτίδια στη θέση των ριβο-) & δημιουργία δ. Η μεταξύ συμπληρωματικών Α.Β. Θοδωρής Καλαϊτζής

DNA πολυμεράσες (2) Επιδιορθωτικός ρόλος για λάθη κατά τη διάρκεια της αντιγραφής Απομάκρυνση πρωταρχικών τμημάτων και αντικατάσταση με δεοξυριβονουκλεοτίδια Προσανατολισμός 5΄- 3΄ Αντιπαράλληλες αλυσίδες Συνεχής και ασυνεχής σύνθεση DNA Okazaki (1968) fragments (ασυνεχής) που ενώνονται μεταξύ τους με DNA δεσμάση (ενώνει και όλα τα τμήματα από διάφορες θ.ε.α.) Θοδωρής Καλαϊτζής

Reiji – Tsuneko Okazaki Θοδωρής Καλαϊτζής

Αντιγραφή (3) Θοδωρής Καλαϊτζής

Αντιγραφή (4) Θοδωρής Καλαϊτζής

Απίστευτη ακρίβεια! Μόνο 1 στα 105 νουκλεοτίδια ενσωματώνεται λανθασμένα. Επιδιορθωτικά ένζυμα: «αναλαμβάνουν» όταν δεν τα «καταφέρνουν» οι DNA πολυμεράσες  1 λάθος στα 1010 νουκλεοτίδια!!! Θοδωρής Καλαϊτζής

Η ροή της γενετικής πληροφορίας (1) Κεντρικό δόγμα της Βιολογίας (Crick, 1958): Γενετική πληροφορία σε τμήματα DNA με συγκεκριμένη ακολουθία (γονίδια)  Καθορισμός (μέσω μεταγραφής/μετάφρασης) της σειράς των αμινοξέων στις πρωτεΐνες, δηλ. έχουμε τη ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ. Θοδωρής Καλαϊτζής

Η ροή της γενετικής πληροφορίας (2) Αλλαγή του κεντρικού δόγματος λόγω ανακαλύψεων ερευνητών, δηλαδή… RNA ιοί: Αντίστροφη μεταγραφάση (RNA καλούπι για DNA) ή αυτοδιπλασιασμός RNA Αντιγραφή: διαιώνιση γεν. πληροφορίας Μεταγραφή: καθορίζει τι (γονίδια), πού (ιστοί) και πότε (στάδια ανάπτυξης) θα εκφραστεί Μετάφραση: με βάση τα μόρια RNA  κατασκευή πολυπεπτιδίου Θοδωρής Καλαϊτζής

Γονίδια Κύτταρα πολυκυτ. οργ. ΙΔΙΟ DNA, όμως σε κάθε ομάδα κυτ. εκφράζονται διαφορετικα γονίδια Α) Γονίδια που μεταγράφονται σε mRNA και μεταφράζονται σε πρωτεΐνες Β) Γονίδια που μεταγράφονται και παράγουν tRNA, rRNA και snRNA Από τα 3Χ109 bp  2% (το πολύ) μεταγράφεται ΑΡΑ…ΓΟΝΙΔΙΟ: Τμήμα DNA που κωδικοποιεί την παραγωγή ενός ή περισσοτέρων RNAs. Θοδωρής Καλαϊτζής

mRNA Μεταφέρει (-ουν) την πληροφορία για την παραγωγή μιας πολυπεπτιδικής αλυσίδας στα ριβοσώματα. Θοδωρής Καλαϊτζής

rRNA Σύνδεση με πρωτεΐνες και σχηματισμός ριβοσωμάτων, όπου γίνεται η μετάφραση Θοδωρής Καλαϊτζής

tRNA Σύνδεση με συγκεκριμένο αμινοξύ και μεταφορά στην κατάλληλη θέση στο ριβόσωμα κατά τη μετάφραση Θοδωρής Καλαϊτζής

snRNA (small nuclear RNA) [μικρό πυρηνικό RNA] Μικρά μόρια RNA + Πρωτεΐνες = snRNPs (μικρά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωματίδια)  Καταλύουν την ωρίμανση του mRNA (μόνο σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς) (Ρυθμίζουν μεταγραφικούς παράγοντες και μια RNA πολυμεράση & Διατηρούν τα τελομερή) Θοδωρής Καλαϊτζής

Ωρίμανση mRNA Θοδωρής Καλαϊτζής

Μεταγραφή (1) «Ο μηχανισμός της μεταγραφής είναι ο ίδιος στους προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς» (μπααααα…) Κατάλυση μεταγραφής από RNA πολυμεράση (ευκαρ.  3 είδη RNA πολυμερασών) ΜΑΣ ΔΟΥΛΕΥΕΙ; Πρόσδεση RNA πολυμεράσης στους υποκινητές, ειδικές περιοχές DNA (πριν την αρχή του κάθε γονιδίου) με τη βοήθεια μεταγραφικών παραγόντων (πρωτ.) Αυτά τα 2 είναι ρυθμιστικά στοιχεία της μεταγραφής (και όχι μόνο αυτά)  σωστή έναρξη μεταγραφής Θοδωρής Καλαϊτζής

Μεταγραφή (2) – RNA πολυμεράση Έναρξη: RNA πολυμεράση  πρόσδεση σε υποκινητή + τοπικό ξετύλιγμα διπλής έλικας DNA. Επιμήκυνση: τοποθέτηση ριβον/δίων απέναντι από δεσοξ/δίων μεταγραφόμενης αλυσίδας DNA (κανόνας συμπληρωματικότητας/ A=U) + σύνδεση ριβον/δίων μεταξύ τους με 3΄- 5΄φωσφοδιεστερικό δεσμό. Λήξη: αλληλουχίες λήξης της μεταγραφής στο τέλος γονιδίου  απελευθέρωση RNA. Θοδωρής Καλαϊτζής

Βίντεο μεταγραφής Θοδωρής Καλαϊτζής

Μεταγραφή (3) Μόριο RNA: συμπληρωματικό της μίας αλυσίδας DNA (μεταγραφόμενη ή μη κωδική) Η άλλη Κωδική (ή μη μεταγραφόμενη)  Ίδια αλληλουχία με παραγόμενο RNA (εκτός T-U) RNA: Το κινητό αντίγραφο της πληροφορίας ενός γονιδίου. Προκαρυωτικοί οργανισμοί: μη ύπαρξη πυρηνικής μεμβράνης  μετάφραση mRNA σε πρωτεΐνη, ΠΡΙΝ ολοκληρωθεί η μεταγραφή, ενώ… Θοδωρής Καλαϊτζής

…στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς: Το παραγόμενο mRNA (hnRNA) υφίσταται μια πολύπλοκη διαδικασία ωρίμανσης. Τα περισσότερα γονίδια (και των ιών) -> ΑΣΥΝΕΧΗ ή ΔΙΑΚΕΚΟΜΜΕΝΑ Αλληλουχίες που μεταφράζονται σε αμινοξέα (ΕΞΩΝΙΑ) διακόπτονται από ενδιάμεσες αλληλουχίες (ΕΣΩΝΙΑ). Πρόδρομο RNA: εξώνια + εσώνια  Μετατροπή σε ώριμο mRNA με κόψιμο των εσωνίων από snRNPs (snRNA+πρωτεΐνες) και συρραφή των εξωνίων μεταξύ τους (ενζυμική δράση) [ΩΡΙΜΑΝΣΗ] Ώριμο mRNA: εξώνια και 5΄, 3΄αμετάφραστες περιοχές (εισαγωγή τους κατά τη διάρκεια και μετά το σχηματισμό του αρχικού μορίου RNA). Θοδωρής Καλαϊτζής

Βίντεο ωρίμανσης mRNA Θοδωρής Καλαϊτζής

Γενετικός κώδικας (1) Η αλληλουχία βάσεων mRNA ΚΑΘΟΡΙΖΕΙ την αλληλουχία των αμινοξέων στις πρωτεΐνες με βάση έναν κώδικα αντιστοίχισης ριβονουκλεοτιδίων με αμινοξέα ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΚΩΔΙΚΑΣ. Κώδικας τριπλέτας: 1 κωδικόνιο κωδ. 1 αμινοξύ. Συνεχής: το mRNA διαβάζεται συνεχώς ανά 3 νουκλεοτίδια, χωρίς παραλείψεις. Μη επικαλυπτόμενος: κάθε νουκλεοτίδιο ανήκει σε 1 κωδικόνιο . Καθολικός (σχεδόν): όλοι οι οργανισμοί  ίδιο γενετικό κώδικα. Εκφυλισμένος: 18 αμινοξέα κωδικοποιούνται από 2-6 διαφ. (συνώνυμα) κωδικόνια (εκτός Met-Trp). Θοδωρής Καλαϊτζής

Γενετικός κώδικας (2) Κωδικόνια λήξης: UAG, UGA, UAA. 6. Κωδικόνιο έναρξης: AUG (μεθειονίνη). Κωδικόνια λήξης: UAG, UGA, UAA. Κωδικόνιο ως όρος  Γονίδιο απ’ όπου παράγεται (π.χ. AUG αντ. στο ATG κωδικής αλυσίδας) Αλληλουχία βάσεων γονιδίου αρχίζει με κωδικόνιο έναρξης και τελειώνει με κωδικόνιο λήξης (και του mRNA του). Θοδωρής Καλαϊτζής

Γενετικός κώδικας (3) Θοδωρής Καλαϊτζής

Ριβοσώματα (1) Τόπος/Οργανίδιο μετάφρασης (με βοήθεια tRNA, mRNA, πρωτεϊνών & ενέργειας) Χρησιμοποίηση ως θέση μετάφρασης για οποιοδήποτε mRNA 2 υπομονάδες: μικρή (θέση πρόσδεσης του mRNA) & μεγάλη (δύο θέσεις εισδοχής tRNA) Κάθε tRNA  Ειδική τριπλέτα νουκλεοτιδίων (αντικωδικόνιο) – πρόσδεση με αντίστοιχο κωδικόνιο mRNA + Ειδική θέση σύνδεσης με ένα συγκεκριμένο αμινοξύ Θοδωρής Καλαϊτζής

Ριβοσώματα (2) Θοδωρής Καλαϊτζής

Έναρξη Σύνδεση mRNA με rRNA μικρής υπομ. (μέσω αλληλουχίας στην 5΄αμετάφραστη) 1ο κωδικόνιο κάθε mRNA  AUG – tRNA – Met (Σε πολλές πρωτεΐνες: αφαίρεση ορισμένων αμινοξέων από αμινικό άκρη – δηλ. Met κ.α.) Σύμπλοκο έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης: Μικρή υπομονάδα + mRNA + tRNA με Met ΜΕΤΑ: Πρόσδεση μεγάλης υπομονάδας με μικρή Θοδωρής Καλαϊτζής

Επιμήκυνση 2ο μόριο tRNA (με αντικωδικόνιο συμπληρ. του 2ου κωδικονίου του mRNA) τοποθετείται στην κατάλληλη εισδοχή (!?) με το 2ο αμινοξύ Met + 2ο αμινοξύ  Πεπτιδικός δεσμός Μετά: Αποσύνδεση 1ου tRNA από ριβόσωμα και απελευθέρωση στο κυτ/σμα (σύνδεση πάλι με Met)  Ένα tRNA με συνδεδεμένα 2 αμινοξέα. Ακόλουθη κίνηση του ριβοσώματος κατά 1 κωδικόνιο & πρόσδεση 3ου tRNA - αμινοξύ. 2ο – 3ο αμινοξύ: Πεπτ. Δεσμός κ.ο.κ. Θοδωρής Καλαϊτζής

Λήξη Σταμάτημα επιμήκυνσης σε κωδικόνιο λήξης (ένα από τα 3) – μη ύπαρξη μορίων tRNA που αντιστοιχούν σε αυτά  Απομάκρυνση τελευταίου tRNA από ριβόσωμα και απελευθέρωση πολυπ. αλυσίδας Δυνατή μεταγραφή πολλών μορίων mRNA από ΈΝΑ γονίδιο + μετάφραση ΕΝΟΣ mRNA από πολλά ριβοσώματα (το καθένα σε διαφ. σημείο) Μόλις μεταφραστούν τα πρώτα κωδικόνια  θέση έναρξης στο mRNA ελεύθερη για πρόσδεση άλλου ριβοσώματος  ΠΟΛΥΣΩΜΑ Μετάφραση: Οικονομική διαδικασία (παραγωγή μεγάλων ποσών μιας πρωτεΐνης από 1 ή 2 αντίγραφα ενός γονιδίου) Θοδωρής Καλαϊτζής

Μετάφραση (για να τα κάνουμε λιανά…) Θοδωρής Καλαϊτζής

Ανακεφαλαίωση Θοδωρής Καλαϊτζής

Ανακεφαλαίωση (2) Θοδωρής Καλαϊτζής

Γονιδιακή Ρύθμιση (1) Γονιδιακή έκφραση: Διαδικασία ενεργοποίησης ενός γονιδίου για παραγωγή μιας πρωτεΐνης Όμως, ΟΧΙ παραγωγή όλων των πρωτεϊνών συνέχεια & ΌΧΙ σε ίσες ποσότητες… Έτσι  Απαραίτητη ύπαρξη προγράμματος ρύθμισης της γον. έκφρασης  Παροχή «οδηγιών» για είδος και ποσότητα πρωτ. σε κάθε χρονική στιγμή Βακτήρια (προκαρυώτες): ρύθμιση – προσαρμογή οργανισμού σε εναλλαγές περιβάλλοντος  Καλύτερες συνθήκες για αύξηση και διαίρεση. Θοδωρής Καλαϊτζής

Γονιδιακή Ρύθμιση (2) Κύτταρα πολυκυτ. οργ.  Διαφορές σε δομή και λειτουργία λόγω κυτταρική διαφοροποίησης (από αρχικά στάδια εμβρυογένεσης) ΌΜΩΣ …όλα με ίδιο γεν. υλικό  γονίδια ΑΡΑ: Μηχανισμοί για επιλεκτική έκφραση της γενετικής πληροφορίας (οδηγίες για κάθε χρον. στιγμή)  Εξειδικευμένη λειτουργία κάθε κυτ. τύπου & Συντονισμός λειτουργιών όλων των κυτ. Ανάγκη τελειοποίησης συστημάτων ελέγχου ΛΟΓΩ: 1. Μεγαλύτερης πολυπλοκότητας ευκαρ. κυτ. 2. Προσεκτικού ελέγχου ανάπτυξης πολυκυτ. οργ. Θοδωρής Καλαϊτζής

Η γονιδιακή ρύθμιση στους προκαρυωτικούς οργανισμούς Ε.coli: >4.000 γονίδια, κάποια συνεχώς μεταγραφόμενα για βασικές ανάγκες και κάποια μεταγρ. σε ειδικές περιβ. συνθήκες (απαραίτητα για επιβίωση στις συνθήκες αυτές) Π.χ. Γλυκόζη – Λακτόζη (γλυκόζη&γαλακτόζη) ΟΠΕΡΟΝΙΑ: Ομάδες γονιδίων που υπόκεινται σε κοινό έλεγχο της έκφρασής τους. Jacob – Monod (1961): Ικανότητα του βακτηρίου για παραγωγή 3 ενζύμων για μεταβολισμό λακτόζης  Οπερόνιο λακτόζης: ένζυμα το ένα δίπλα στο άλλο στο γονιδίωμα  ΕΝΙΑΙΑ ΜΟΝΑΔΑ (Οπερόνιο λακτόζης) Θοδωρής Καλαϊτζής

Οπερόνιο λακτόζης (καταστολή) Δομικά γονίδια (για β-γαλακτοζιδάση, περμεάση και τρανσακετυλάση) και αλληλουχίες DNA ρύθμισης (ρυθμιστικό γονίδιο – υποκινητής – χειριστής) Μη μεταγραφή-μετάφραση δομικών γονιδίων σε απουσία λακτόζης  Υπό ΚΑΤΑΣΤΟΛΗ Ρυθμιστικά μόρια: Χειριστής (μεταξύ υποκινητή και γονιδίου β-γαλακτοζ.) και ρυθμιστική πρωτεΐνη-καταστολέας [και φυσικά η ΙΔΙΑ η λακτόζη]. Ρυθμιστικό γονίδιο μεταγράφεται συνεχώς  Παραγωγή λίγων μορίων (& πρόσδεση σε χειριστή) Θοδωρής Καλαϊτζής

Οπερόνιο λακτόζης (επαγωγή) Αν στο θρεπτικό υλικό ΜΟΝΟ λακτόζη  Λειτουργία δισακχαρίτη ως επαγωγέας της μεταγραφής δομικών γονιδίων Μεταγραφή 3 γονιδίων και (μετά) ταυτόχρονη μετάφραση 3 ενζύμων από το ίδιο μόριο mRNA (κωδικόνια έναρξης και λήξης για κάθε ένζυμο) Δηλαδή: Η ίδια η λακτόζη ενεργοποιεί τη διαδικασία αποικοδόμησής της. Πλήρης διάσπαση λακτόζης  Πρωτεΐνη - καταστολέας προσδένεται σε χειριστή και καταστέλλει τη λειτουργία 3 γονιδίων Θοδωρής Καλαϊτζής

Η γονιδιακή ρύθμιση στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (1) Ρύθμιση με πολύπλοκους μηχανισμούς σε 4 επίπεδα: 1. Μεταγραφικά: Αριθμός μηχανισμών ελέγχου ποιών γονιδίων και με ποια ταχύτητα / ΌΧΙ οργάνωση σε οπερόνια – κάθε γονίδιο με δικό του υποκινητή  αυτόνομη μεταγραφή Μεταγραφικοί παράγοντες: Κάθε κυτ. τύπος με διαφορετικά είδη μεταγρ. παραγόντων. / Σωστός συνδυασμός παραγόντων (πρόσδεση σε υποκινητή)  Έναρξη μεταγραφής από RNA πολυμεράση. Θοδωρής Καλαϊτζής

Η γονιδιακή ρύθμιση στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (2) 2. Μετα-μεταγραφικά: Μηχανισμοί ωρίμανσης πρόδρομου mRNA & Καθορισμός ταχύτητας mRNA (πυρήναςκυτ/σμα) 3. Μεταφραστικά: Ποικιλία χρόνων ζωής διαφόρων mRNA (αποικοδόμηση) & Ποικιλία ικανότητας πρόσδεσης τους σε ριβοσώματα 4. Μετα-μεταφραστικά: Τροποποιήσεις αρχικής πρωτεΐνης  Βιολογικά λειτουργική. Θοδωρής Καλαϊτζής

Θοδωρής Καλαϊτζής