02-Μεταλλάξεις και επιδιόρθωση του DNA

Τύποι μεταλλάξεων Σημειακές μεταλλάξεις: Ένθεση Απαλοιφή Μεταπτώσεις (transitions): πουρίνη σε πουρίνη ή πυριμιδίνη σε πυριμιδίνη Μεταστροφές (transversion): πουρίνη σε πυριμιδίνη ή πυριμιδίνη σε πουρίνη Ένθεση Απαλοιφή

Ανεπαρκής επιδιόρθωση του DNA Τι είναι μετάλλαξη; Ανεπαρκής επιδιόρθωση του DNA

Αίτια Επιπτώσεις Επιδιόρθωση

1. Τα αίτια των μεταλλάξεων Λάθη κατά την αντιγραφή του DNA Επιδράσεις μεταλλαξιγόνων

Μηχανισμοί που εξασφαλίζουν την ακρίβεια της αντιγραφής του DNA

Στην E. coli, η συχνότητα λάθους κατά την αντιγραφή είναι 10-7 Αν δεν υπήρχε ενζυμικός έλεγχος των λαθών (αν δηλαδή τα νέα νουκλεοτίδια έμπαιναν με καθαρά «χημικό» τρόπο), τότε η συχνότητα των λαθών θα ήταν ~5-10%! Στην E. coli, η συχνότητα λάθους κατά την αντιγραφή είναι 10-7 Τα λάθη δεν κατανέμονται ομοιόμορφα: Ο καθυστερημένος κλώνος (Pol I) έχει 20 φορές περισσότερα λάθη από τον προπορευόμενο (Pol III) Συνολικά, η συχνότητα λάθους είναι 10-10 έως 10-11 λόγω άλλων συστημάτων επιδιόρθωσης

Αταίριαστα ζευγάρια βάσεων των σπάνιων ταυτομερών μορφών των βάσεων του DNA

Ολίσθηση της DNA πολυμεράσης

Μεταλλάξεις που δημιουργούνται από φυσικά ή χημικά μεταλλαξιγόνα Μεταλλάξεις που δημιουργούνται από φυσικά ή χημικά μεταλλαξιγόνα

Βλάβες από υπεριώδη ακτινοβολία UV-C: 100-295 nm (ozon ??) UV-B: 296-320 nm (10%) UV-A: 321-400 nm (90%)

Φωτοπροϊόντα που επάγονται από την υπεριώδη ακτινοβολία Υπεριώδης ακτινοβολία προκαλεί το σχηματισμό διμερών ανάμεσα σε γειτονικές θυμίνες του ίδιου κλώνου. Τα διμερή παρεμποδίζουν την αντιγραφή και τη μεταγραφή.

Μελάνωμα. Η κύρια αιτία του μελανώματος είναι η έκθεση στο UV. Xeroderma pigmentosum, μια σπάνια ασθένεια, αποτέλεσμα της αδυναμίας επιδιόρθωσης των διμερών της θυμίνης. Τα διμερή παραμένουν και παρεμποδίζουν την αντιγραφή του DNA. Επτά γονίδια εμπλέκονται στην ασθένεια.

Βλάβες από ιονίζουσα ακτινοβολία (ακτίνες Χ και γ) Άμεσες βλάβες: απορρόφηση από το DNA Έμμεση βλάβη: απορρόφηση από νερό που περιβάλλει το DNA δημιουργία δραστικών μορφών (Η2Ο•+, •ΟΗ, Ο2-) Μεμονωμένες Πολλαπλές: δίκλωνη ρήξη (ελλείμματα, διπλασιασμοί, αναστροφές, μετατοπίσεις)

Η αστάθεια του DNA στο νερό Φωσφοδιεστερικός δεσμός: σπάνια ρήξη Ν-γλυκοσιδικός δεσμός: ρήξη 10.000 ΑΡ θέσεις την ημέρα Δεσμοί με εξωκυκλικές αμινομάδες: απαμινώσεις

Υδρολυτική διάσπαση του Ν-γλυκοσιδικού δεσμού

Υδρολυτικές απαμινώσεις ΗΝΟ2: σχηματίζεται από τα νιτρώδη που χρησιμοποιούνται ως συντηρητικά των αλλαντικών HSO3- : όξινο θειώδες ιόν, χρησιμοποιείται ως πρόσθετο στο κρασί, τη μπύρα και τους χυμούς των φρούτων

Οξειδωτική βλάβη Συχνή αιτία η ρίζα του υδροξυλίου (•ΟΗ) Οι ρίζες αυτές παράγονται από ιονίζουσα ακτινοβολία ή Η2Ο2 και ιόντος μετάλλου (πχ Fe2+)

Αν δεν επιδιορθωθεί προκαλείται μεταλλαγή μεταστροφής με αντικατάσταση ζεύγους G≡C σε T=A H γλυκόλη της θυμίνης είναι κυτταροτοξική, επειδή αναστέλλει την αντιγραφή του DNA

Αλκυλιωτικοί παράγοντες Mεταφέρουν μεθύλια (ή άλλα αλκύλια) στο DNA

Αλκυλιωτικοί παράγοντες Ethyl Methane Sulfonate (EMS) Dimethylnitrosamine Επιπτώσεις εξαρτώνται από τη θέση και τον τύπο της αλκυλομάδας: Τροποποιημένα νουκλεοτίδια με αλλοιωμένες ιδιότητες ζευγαρώματος → σημειακές μεταλλάξεις Μεγάλες αλκυλομάδες → αναστολή αντιγραφής

Πολυκυλικοί υδρογονάνθρακες Ατελής καύση ξύλου ή ορυκτού άνθρακα: καπνός τσιγάρου, κρέατα στα κάρβουνα κλπ

Πολλοί πολυκυκλικοί υδρογονάνθρακες θα πρέπει πρώτα να ενεργοποιηθούν από τον μεταβολισμό του κυττάρου (πχ Ρ450 και εποξειδική υδρολάση) Οι μονοοξυγενάσες του Ρ450 συμβάλλουν στην αποτοξίνωση βλαβερών ουσιών. Όμως, δεν εμφανίζουν μεγάλη εξειδίκευση με αποτελέσματα όπως το διπλανό παράδειγμα

Αφλατοξίνες: παράγονται από μύκητες (Aspergilus flavus και A Αφλατοξίνες: παράγονται από μύκητες (Aspergilus flavus και A. parasiticus) που αναπτύσσονται σε φιστίκια και δημητριακά

Χημικοί παράγοντες διασύνδεσης Το αζωτούχο αέριο της μουστάρδας. Αν δεν διορθωθεί η διασύνδεση στο DNA προκαλεί θάνατο του κυττάρου Αρχικά αναπτύχθηκε για στρατιωτική χρήση (χημικό όπλο που προσβάλει το ΚΝΣ) Σήμερα χρησιμοποιείται ως χημειοθεραπευτικός παράγοντας σε ορισμένα λεμφώματα και λευχαιμίες

Παράγοντες παρεμβολής

2. Οι επιπτώσεις των μεταλλάξεων

Οι επιπτώσεις των μεταλλάξεων Επιπτώσεις στο γονιδίωμα Σιωπηλές μεταλλάξεις: το ~98.5% Συνώνυμες, μη-συνώνυμες, α-νοηματικές, παρα-νοηματικές Επιπτώσεις σε πολυκύτταρους οργανισμούς απώλεια λειτουργίας κέρδος λειτουργίας Επιπτώσεις σε μικροοργανισμούς αυξότροφοι θανατογόνοι υπό όρους

(missense)

Μεταλλάξεις απαλοιφής

Επιπτώσεις μεταλλάξεων απαλοιφής ανοδικά ενός γονιδίου

Οι επιπτώσεις των μεταλλάξεων στους πολυκύτταρους οργανισμούς Απώλεια λειτουργίας Οι περισσότερες μεταλλάξεις στους διπλοειδείς οργανισμούς είναι υπολειπόμενες (επειδή υπάρχει δεύτερο αντίγραφο) Κέρδος λειτουργίας Πιο σπάνιες Συνήθως σε ρυθμιστικές περιοχές

Οι επιπτώσεις των μεταλλάξεων στους πολυκύτταρους οργανισμούς Απώλεια λειτουργίας Οι περισσότερες μεταλλάξεις στους διπλοειδείς οργανισμούς είναι υπολειπόμενες (επειδή υπάρχει δεύτερο αντίγραφο) Κέρδος λειτουργίας Πιο σπάνιες Συνήθως σε ρυθμιστικές περιοχές

Οι επιπτώσεις των μεταλλάξεων σε μικροοργανισμούς Αυξότροφα vs πρωτότροφα «Υπό όρους θανατογόνες» μεταλλάξεις Θερμοευαίσθητα μεταλλαγμένα στελέχη Μεταλλάξεις ανθεκτικότητας Ρυθμιστικές μεταλλάξεις Ιδιοσύστατες μεταλλάξεις

3. Επιδιόρθωση του DNA Συστήματα άμεσης επιδιόρθωσης Επιδιόρθωση εκτομής Επιδιόρθωση αταίριαστου ζεύγους βάσεων Ένωση μη ομόλογων άκρων Απόκριση SOS

Τέσσερις κατηγορίες συστημάτων επιδιόρθωσης του DNA

Σύστημα άμεσης επιδιόρθωσης Ι: Φωτολυάση κυκλοβουτανικών διμερών πυριμιδίνης και φωτολυάση (6-4) Βακτήρια, αρχαία, φυτά και ζώα, όχι στον άνθρωπο Χρησιμοποίηση ενέργειας από το μπλε φως (350-450nm) για τη διάσπαση κυκλοβουτανικών διμερών Φυτά και ζώα (πχ δροσόφιλα), όχι σε βακτήρια ή θηλαστικά (ούτε στον άνθρωπο) Εκτός από τη διάσπαση του κόκκινου δεσμού, η φωτολυάση πρέπει να αντιστρέψει και άλλες μεταβολές

Σύστημα άμεσης επιδιόρθωσης ΙΙ: απαλκυλίωση με DNA αλκυλοτρανσφεράσες Κάθε επικράτεια έχει ένα ενεργό κέντρο και μεταφέρει μια αλκυλομάδα σε μια από τις δικές της κυστεΐνες. Οι αντιδράσεις αυτές δεν είναι αντιστρεπτές: ένζυμα-καμικάζι (suicide enzymes) Μία ακόμη αξιοσημείωτη λειτουργία: η μεθυλιωμένη αλκυλοτρανσφεράση μετατρέπεται σε μεταγραφικό ενεργοποιητή του δικού της γονιδίου αλλά και άλλων γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA

H DNA αλκυλοτρανσφεράση του ανθρώπου παρουσιάζει τεράστιο κλινικό ενδιαφέρον: πολλοί χημειοθεραπευτικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται για την καταστροφή των καρκινικών κυττάρων είναι αλκυλιωτικοί παράγοντες Όταν η ενεργότητα της αλκυλοτρανσφεράσης στα καρκινικά κύτταρα είναι πολύ υψηλή, οι παράγοντες αυτοί δε δρουν αποτελεσματικά Όταν η ενεργότητα της αλκυλοτρανσφεράσης στα περιβάλλοντα υγιή κύτταρα είναι υπερβολικά χαμηλή, οι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες προκαλούν το θάνατο των υγιών κυττάρων Η ανθρώπινη αλκυλοτρανσφεράση προστατεύει, επίσης, τα κύτταρα από καρκινογόνους αλκυλιωτικούς παράγοντες.

Συστήματα άμεσης επιδιόρθωσης Εγκοπές (ή εντομές) συχνά προκαλούνται από ιονίζουσα ακτινοβολία

Επιδιόρθωση εκτομής βάσεων

Επιδιόρθωση εκτομής βάσεων

Επιδιόρθωση με εκτομή βάσεων στους ευκαρυώτες (με μονολειτουργική γλυκοζυλάση) Επιδιόρθωση βραχέος τμήματος (short patch repair) Επιδιόρθωση μακρού τμήματος (long patch repair)

Συστήματα επιδιόρθωσης εκτομής στην E Συστήματα επιδιόρθωσης εκτομής στην E. coli: «βραχύ μπάλωμα» (short patch nucleotide excision repair: ~12 nt)

Επιδιόρθωση αταίριαστου ζεύγους: διορθώνοντας τα λάθη της αντιγραφής

Η μεθυλίωση του αρτιγενούς DNA της E Η μεθυλίωση του αρτιγενούς DNA της E. coli προσφέρει ένα παράθυρο ευκαιρίας για την επιδιόρθωση αταίριαστων βάσεων

Τα προηγούμενα συστήματα αναγνωρίζουν και επιδρούν σε βλάβες του DNA από μεταλλαξιγόνα. Τα συστήματα επιδιόρθωσης λαθών αντιγραφής (αταίριαστων ζευγών) είναι σαν τα προηγούμενα (μακρύ μπάλωμα, βραχύ μπάλωμα και πολύ βραχύ μπάλωμα) με την προσθήκη αναγνώρισης των δύο κλώνων (βάσει του προτύπου μεθυλίωσης)

Επιδιόρθωση αταίριαστου ζευγαριού στην E. coli. Μακρύ μπάλωμα: (Long patch mismatch repair, ~ 2kb)

Η απόκριση SOS στην E. coli Βλάβη στο DNA ενεργοποιεί την ικανότητα της RecA να κινητοποιεί την απόκριση SOS: επαγωγή της έκφρασης γονιδίων που κωδικοποιούν πολλά από τα ένζυμα επιδιόρθωσης Η SOS επάγεται από: UV Chemical cross-linking (ομοιοπολική χημική διασύνδεση) Παράγοντες αλκυλίωσης Αναστολή της αντιγραφής (με οποιοδήποτε τρόπο, πχ στέρηση θυμίνης ή προσθήκη φαρμάκων) Η SOS: Οδηγεί σε αύξηση της δυνατότητας επιδιόρθωσης βλαβών Αναστέλλει την κυτταρική διαίρεση

To μοντέλο συναρμογής του διμερούς LexA σε μια θέση χειριστή recA Η αμινοτελική επικράτεια έχει συγγένεια με τους χειριστές μεγάλου αριθμού γονιδιών, την έκφραση των οποίων καταστέλλει Η καρβοξυτελική επικράτεια έχει λανθάνουσα ενεργότητα πρωτεάσης

Συναρμολόγηση και αποσυναρμολόγηση των νουκλεοϊνιδίων της RecA ATP Υψηλή συγγένεια προς DNA ADP RecA Χαμηλή συγγένεια προς DNA

H ρύθμιση της απόκρισης SOS H pol II έχει ρόλο στην επανέναρξη της αντιγραφής μετά την ολοκλήρωση της διαβλαβικής σύνθεσης του DNA. Επίσης, μπορεί να συνθέσει DNA σε ΑΡ περιοχές ή να παρακάμψει ογκώδη προσθέματα (αύξηση ~7×). Η pol IV μπορεί να πραγματοποιήσει διαβλαβική σύνθεση DNA με χαμηλή αξιοπιστία (αύξηση ~10×). Η pol V είναι ετεροτριμερές (μουτάσωμα). Τα επίπεδά της αυξάνονται δραματικά κατά την SOS. Καταλύει διαβλαβική σύνθεση DNA χαμηλής πιστότητας σε πολλών ειδών βλάβες (αύξηση >1000×).

Η απόκριση SOS στην E. coli

Ο σώζων εαυτόν σωθήτω ή Επιδίωξη της απάντησης SOS

Περισσότερες από 14 διαφορετικές DNA πολυμεράσες εξαρτώμενες από τη μήτρα έχουν ανακαλυφθεί στο ανθρώπινο γονιδίωμα

Ελαττωματική επιδιόρθωση και ασθένειες Μελαγχρωματική ξηροδερμία: αποτέλεσμα μετάλλαξης σε γονίδιο που εμπλέκεται στην εκτομή βάσης Υπερευαισθησία σε UV Τριχοθειοδυστροφία: επίσης αποτέλεσμα μετάλλαξης σε γονίδιο εκτομής βάσης. Πιο περίπλοκη διαταραχή (δέρμα + νευρικό) Επιδιόρθωση εκτομής νουκλεοτιδίων συζευγμένη με μεταγραφή: Μεταλλάξεις σε BRCA1 αυξάνουν την προδιάθεση σε καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών Παρόμοια νοσήματα: Σύνδρομο Cockayne (αναπτυξιακές και νευρολογικές διαταραχές) Κληρονομικός καρκίνος παχέος εντέρου

Τι να μελετήσετε: Tropp, Chapter 9