Θεραπευτική των Λοιμώξεων Έλεγχος αντοχής (αντιβιόγραμμα) 3ο ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Θεραπευτική των Λοιμώξεων Έλεγχος αντοχής (αντιβιόγραμμα)

Φαρμακευτικοί Παράγοντες για την Θεραπεία των Λοιμώξεων Αντιβακτηριακά Αντιφυματικά Αντιμυκητιασικά Αντι-ιικά Αντι-παρασιτικά

Χρήση Αντιβακτηριακών Φαρμάκων (ΑΒΦ) Θεραπεία λοιμώξεων (γνωστό παθογόνο/ευαισθησία  άγνωστο παθογόνο) Πρόληψη (προ-εγχειρητική αγωγή, έκθεση σε παθογόνο) Μη ενδεικνυόμενη χορήγηση Κτηνοτροφία / ιχθυοτροφεία

Οι Κυριότερες Ομάδες Αντιβακτηριακών [1] β-λακτάμες (1) Πενικιλλίνες Πενικιλλίνη G Αντισταφυλοκοκκικές πενικιλλίνες (μεθικιλλίνη, οξακιλλίνη, κλοξακιλλίνη, φλουκλοξακιλλίνη) Αμινοπενικιλλίνες (αμπικιλλίνη, αμοξυκιλλίνη) Αναστολείς β-λακταμασών (κλαβουλανικό οξύ, σουλμπακτάμη) Αντιψευδομοναδικές πενικιλλίνες (τικερκιλλίνη και κλαβουλανικό οξύ, αζλοκιλλίνη, πιπερακιλλίνη, ταζομπακτάμη Μενικιλλινάμη (2) Μονοβακτάμες (αζτρεονάμη) (3) Καρβαπενέμες (ιμιπενέμη, μεροπενέμη, ερταπενέμη, ντοριπενέμη)

β-λακτάμες Οι Κυριότερες Ομάδες Αντιβακτηριακών [2] (4) Κεφαλοσπορίνες 1ης γενεάς (κεφαλοθίνη, κεφαπιρίνη, κεφαλεξίνη, κεφαδροξίλη) 2ης γενεάς (κεφαμανδόλη, κεφοξιτίνη, κεφακλόρη, κεφουροξίμη) 3ης γενεάς (κεφοταξίμη, κεφτριαξόνη, κεφταζιντίμη, κεφτιζοξίμη, κεφοπεραζόνη, κεφιξίμη) 4ης γενεάς (κεφπιρόμη, κεφεπίμη)

Οι Κυριότερες Ομάδες Αντιβακτηριακών [3] Αμινογλυκοσίδες (στρεπτομυκίνη, νεομυκίνη, καναμυκίνη, γενταμικίνη, τομπραμυκίνη, αμικασίνη, νετιλμικίνη) Μακρολίδες (ερυθρομυκίνη, κλαριθρομυκίνη) - Αζαλίδες (αζιθρομυκίνη) - Στρεπτογραμίνες (κινουπριστίνη-νταλφοπροστίνη) Κετολίδες(τελιθρομυκίνη, κεθρομυκίνη) - Οξαζολιδινόνες (λινεζολίδη) Λινκοζαμίδες (κλινδαμυκίνη) Τετρακυκλίνες (τετρακυκλίνη, δοξυκυκλίνη, μινοκυκλίνη) Χλωραμφενικόλη Νιτροϊμιδαζόλες (μετρονιδαζόλη) Φουσιδικό οξύ

Οι Κυριότερες Ομάδες Αντιβακτηριακών [4] Γλυκοπεπτίδια (βανκομυκίνη, τεϊκοπλανίνη) Νεώτερα συγγενή των γλυκοπεπτιδίων (δαπτομυκίνη) Σουλφοναμίδες και Τριμεθοπρίμη Νιτροφουράνια (νιτροφουραντοΐνη) Πολυπεπτίδια (κολιστίνη) Νεώτερες Κινολόνες (ναλιδιξικό οξύ, νορφλοξασίνη, σιπροφλοξασίνη, οφλοξασίνη, ενοξασίνη, πεφλοξασίνη, τροβαφλοξασίνη, λεβοφλοξασίνη, μοξιφλοξασίνη, γκατιφλοξασίνη)

Στόχοι/Δράση Αντιβακτηριακών Φαρμάκων (ΑΒΦ) Σύνθεση κυτταρικού τοιχώματος Ακεραιότητα κυτταρικής μεμβράνης Σύνθεση νουκλεϊκών οξέων Λειτουργία ριβοσωμάτων Μεταβολισμός (σύνθεση φολικού οξέος)

ΔΡΑΣΗ ΑΝΤΙ-ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ Σύνθεση Κυτταρικού Τοιχώματος Πολλαπλασιασμός DNA Εξαρτώμενη από DNA RNA πολυμεράση Αναστολή Πρωτεϊνοσύνθεσης (50S ριβοσώματα) Μεταβολισμός Φολικού Οξέος Αναστολή Πρωτεϊνοσύνθεσης (30S ριβοσώματα) Κυτταρική Μεμβράνη

Παράγοντες που επηρεάζουν την επιλογή ΑΒ Βακτήριο (ευαισθησία, ενδοκυττάρια  εξωκυττάρια ανάπτυξη) Ξενιστής (ανοσοκαταστολή) Εντόπιση λοίμωξης

Καταλληλότητα Αντιβακτηριακού Παράγοντα Δράση: βακτηριοκτόνος  βακτηριοστατική Βιοδιαθεσιμότητα (φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά): υψηλή συγκέντρωση, για μεγάλο χρονικό διάστημα στον τόπο της λοίμωξης Τοξικότητα (μεγάλο θεραπευτικό εύρος) Αποφυγή καταστροφή της φυσιολογικής χλωρίδας Ευκολία χορήγησης Κόστος

Επιλογή Αντιβακτηριακής Θεραπείας (Α) Ιδεώδης - Ορθολογική Θεραπεία Απομόνωση και ταυτοποίηση του παθογόνου βακτηρίου Προσδιορισμός της ευαισθησίας του in vitro σε διάφορα ΑΒΦ Εφαρμογή κανόνων Φαρμακοκινητικής και Φαρμακοδυναμικής Προσδιορισμός in vitro των επιπέδων των ΑΒΦ στο αίμα του ασθενούς Επιλογή του λιγότερο τοξικού φαρμάκου Επιλογή μικρότερου κόστους

Επιλογή Αντιβακτηριακής Θεραπείας (Β) Εμπειρική Θεραπεία  Το παθογόνο βακτήριο και η ευαισθησία του παραμένουν άγνωστα (για λίγες μέρες ή για πάντα) Γνώση της φυσιολογικής χλωρίδας (ενδογενής προέλευση παθογόνου) Προέλευση της λοίμωξης από την κοινότητα ή το νοσοκομείο Εφαρμογή κανόνων Φαρμακοκινητικής και Φαρμακοδυναμικής Προσδιορισμός in vitro των επιπέδων των ΑΒΦ στο αίμα του ασθενούς Επιλογή λιγότερο τοξικού φαρμάκου Επιλογή μικρότερου κόστους

Μηχανισμοί Ανάπτυξης Αντοχής Φραγή εισόδου (μεταλλαγή πρωτεϊνών που επιτρέπουν την είσοδο στο κύτταρο) Ενεργή απέκκριση Απενεργοποίηση φαρμάκου Υπερπαραγωγή του στόχου Μεταλλαγή του στόχου Πρόσληψη μηχανισμού απενεργοποίησης από άλλο μικρο-οργανισμό

Μεθοδολογία Ανίχνευσης Αντοχής

 Ανίχνευση ευαισθησίας ή αντοχής Αντιβιόγραμμα  Ανίχνευση ευαισθησίας ή αντοχής Δεν μπορούμε να θεωρήσουμε δεδομένη την ευαισθησία ενός είδους βακτηρίου Ανάπτυξη μεθοδολογίας για προσδιορισμό ευαισθησίας/αντοχής – πρακτικά θέματα Ανάπτυξη ορολογίας: «Ευαίσθητο»  «Ανθεκτικό» βακτήριο Susceptible (S)  Resistant (R)

Μέθοδοι Ελέγχου Ευαισθησίας/Αντοχής Mέθοδοι Αναφοράς Broth macro/microdilution (αραιώσεις σε ζωμό) Agar dilution (αραιώσεις σε άγαρ) Ευρέως Διαδεδομένες Μέθοδοι Μέθοδος Δίσκων Διάχυσης (Kirby-Bauer) E-test (Epsilometer) Ταχείες και Αυτοματοποιημένες Μέθοδοι Εμπορικά συστήματα (Vitek, Phoenix, Microscan)

ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑ Ελάχιστη Ανασταλτική Συγκέντρωση Minimum Inhibitory Concentration (MIC) H μικρότερη συγκέντρωση του ABΦ που αναστέλλει μακροσκοπικά την ανάπτυξη του εξεταζόμενου στελέχους βακτηρίου Προσδιορισμός τιμής MIC του στελέχους Ερμηνεία αποτελέσματος (R ή S) Σύγκριση τιμής με καθορισμένες «τιμές αναφοράς» (Breakpoints, όρια ευαισθησίας) Συνδυασμός ΑΒΦ και παθογόνου: MIC ≥ 16 μg/ml → R

ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑ Ελάχιστη Ανασταλτική Συγκέντρωση Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Ελάχιστη Βακτηριοκτόνος Συγκέντρωση Minimum Bactericidal Concentration (MBC) H μικρότερη συγκέντρωση του ABΦ που σκοτώνει το εξεταζόμενο στέλεχος βακτηρίου (κατά 99.9%)

Mέθοδοι Εκτέλεσης Αντιβιογραμμάτων Μέθοδος Αραιώσεων σε Ζωμό (Broth Dilution Assay) Πραγματοποιείται είτε σε δοκιμαστικούς σωλήνες (macrodilution), είτε σε πλάκες μικροτιτλοποίησης (microdilution) Περιέχουν αυξανόμενη συγκέντρωση του ΑΒΦ και ενοφθαλμίζονται με την ίδια ποσότητα του εξεταζόμενου στελέχους βακτηρίου Η ανάπτυξη στις διαφορετικές συγκεντρώσεις του φαρμάκου προσδιορίζεται με μέτρηση της θολερότητας

Mέθοδοι Εκτέλεσης Αντιβιογραμμάτων Μέθοδος Αραιώσεων σε Zωμό (Broth Macrodilution Assay) 8 4 2 1 Αντιβακτηριακό φάρμακο (μg/ml) Η τιμή της MIC προσδιορίζεται από την χαμηλότερη συγκέντρωση του ΑΒΦ που καταστέλλει τη βακτηριακή ανάπτυξη (στο παραπάνω παράδειγμα: MIC = 2 μg/ml)

Mέθοδοι Εκτέλεσης Αντιβιογραμμάτων Μέθοδος Kirby-Bauer (Δίσκοι Διάχυσης) Η πιο συχνή μέθοδος προσδιορισμού ευαισθησίας Απομονωμένες αποικίες του εξεταζόμενου βακτηρίου ομογενοποιούνται σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα (βακτηριακό εναιώρημα) με κατάλληλο υγρό μέσο ώστε να αποκτήσουν μία συγκεκριμένη πυκνότητα (π.χ. μετρώντας με θολωσίμετρο):

Mέθοδοι Εκτέλεσης Αντιβιογραμμάτων Μέθοδος Kirby-Bauer Ένας αποστειρωμένος βαμβακοφόρος στυλεός εμβαπτίζεται στο βακτηριακό εναιώρημα και το επιπρόσθετο υγρό απομακρύνεται με πίεση του στυλεού στα τοιχώματα του δοκιμαστικού σωλήνα:

Mέθοδοι Εκτέλεσης Αντιβιογραμμάτων Μέθοδος Kirby-Bauer: Με το στυλεό ενοφθαλμίζεται ολόκληρη η επιφάνεια του καταλλήλου στερεού θρεπτικού μέσου:

Mέθοδοι Εκτέλεσης Αντιβιογραμμάτων Μέθοδος Kirby-Bauer: Μικρά δισκία που περιέχουν καθορισμένη ποσότητα διαφόρων ΑΒΦ τοποθετούνται στην επιφάνεια του στερεού μέσου. Μετά από την κατάλληλη επώαση, εμφανίζονται ζώνες αναστολής της βακτηριακής ανάπτυξης λόγω της δράσης των ΑΒΦ που διαχέονται από τα δισκία στο άγαρ: Chl Amp Ery Str Tet

Mέθοδοι Εκτέλεσης Αντιβιογραμμάτων Μέθοδος Kirby-Bauer: Η κατηγοριοποίηση του στελέχους ως ευαίσθητου ή ανθεκτικού προσδιορίζεται από πίνακα αναφοράς με βάση την διάμετρο αναστολής για κάθε ΑΒΦ (σε mm):

Mέθοδοι Εκτέλεσης Αντιβιογραμμάτων Μέθοδος Εtest (AB Biodisk, Solna, Σουηδία) Πραγματοποιείται με ειδικές πλαστικές ταινίες που περιέχουν προσροφημένο στην επιφάνειά τους τον αντιβακτηριακό παράγοντα σε αυξανόμενη συγκέντρωση (αντικαθιστώντας τις διαδοχικές αραιώσεις)

Mέθοδοι Εκτέλεσης Αντιβιογραμμάτων Μέθοδος Εtest Οι συγκεντρώσεις του αντιβιοτικού καλύπτουν ένα μεγάλο εύρος MIC συγκεντρώσεων Όταν εφαρμόζονται οι ταινίες στην επιφάνεια ενός στερεού θρεπτικού μέσου ενοφθαλμισμένου με το εξεταζόμενο στέλεχος, το ΑΒΦ διαχέεται στο άγαρ Μετά από επώαση μίας ημέρας, αναπτύσσεται μία ελλειπτική ζώνη καταστολής της βακτηριακής ανάπτυξης γύρω από τον άξονα της κάθε ταινίας

Mέθοδοι Εκτέλεσης Αντιβιογραμμάτων Μέθοδος Εtest Η τιμή της MIC σε μg/ml προσδιορίζεται με ακρίβεια στο σημείο που η άκρη της ελλειπτικής ζώνης τέμνει την ταινία του Etest: