ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ Α2 (PLA2) ΣΤΟ BAL ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ Α2 (PLA2) ΣΤΟ BAL ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΚΑΡΚΑΜΠΟΥΝΑΣ MSc ΧΗΜΙΚΟΣ

ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΗΣ Α2 (PLA2) ΣΤΟ BAL ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. Μέθοδοι Προσδιορισμού PLA2 2. Φθορισμομετρική μέθοδος προσδιορισμού PLA2

ΦΩΣΦΟΛΙΠΑΣΕΣ Α2 (PLA2) Υδρολύουν εστερικούς δεσμούς στη θέση sn-2 των φωσφολιπιδίων Παράγονται ελεύθερα λιπαρά οξέα λυσο φωσφολιπίδια

ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ PLA2 Μέθοδοι Όριο ανίχνευσης Ογκομετρικές 20 nmol pHμετρικές 100 pmol Ραδιομετρικές 1 fmol-1 pmol NMR 1 μmol Πολαρογραφικές 40 nmol Φασματοφωτομετρικές 200 pmol-25 nmol Φθορισμομετρικές 1 pmol ESR 1 nmol Συνδυασμοί με Χρωματογραφικές <1 pmol

ΡΑΔΙΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Απαιτούν τη χρήση υποστρωμάτων σημασμένων με ραδιενεργά ισότοπα Πλεονεκτήματα: ευαισθησία επαναληψιμότητα χαμηλό όριο ανίχνευσης Μειονεκτήματα: μεγάλος χρόνος ανάλυσης ασυνεχείς επιβλαβείς χημικές ουσίες

ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Ανάπτυξη υποστρωμάτων και λιπαρών οξέων σημασμένων με φθορίζουσες ομάδες Πλεονεκτήματα: γραμμικότητα επαναληψιμότητα χαμηλό όριο ανίχνευσης κόστος ανάλυσης Μειονεκτήματα: περιορισμοί του φαινομένου του φθορισμού ασυνεχείς

ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ PLA2 Χρήση C12-NBD-PC Απελευθέρωση C12-NBD-FA

ΑΡΧΗ ΜΕΘΟΔΟΥ NBD PLA2 PLA2 NBD NBD

ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ PLA2 ΣΤΗΝ C12-NBD-PC C12-NBD-FA C12-NBD-PC

ΟΡΓΑΝΑ Φασματοφθορισμόμετρο

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ Ρυθμιστικό διάλυμα Υπόστρωμα της C12-NBD-PC BAL, θετικό control (πρότυπη PLA2), αρνητικό control (ίδιο δείγμα BAL βρασμένο) Καταγραφή της μεταβολής της έντασης του φθορισμού συναρτήσει του χρόνου σε λex=475 nm και λem=535 nm Πρότυπο διάλυμα C12-NBD-FA

αύξηση έντασης φθορισμού ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ A Ενεργότητα PLA2 (nmol FA/h/mL BAL λ Κλίση ευθείας ΔF αύξηση έντασης φθορισμού V Όγκος BAL (μL)

ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΜΕΘΟΔΟΥ Πλεονεκτήματα Γραμμική (50 pmol-200 nmol) Χαμηλό όριο ανίχνευσης (< 1pmol) Ικανοποιητική επαναληψιμότητα Περιορισμοί Δείγματα BAL με υψηλή συγκέντρωση ολικής πρωτεΐνης

HPLC-ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ Διαχωρισμό της C12-NBD-PC από το C12-NBD-FA Σύστημα Έκλουσης tR (min) C12-NBD-PC C12-NBD-FA Rs CH3OH-H2O (80:20, v/v) 6.6 11.5 4.4

ΟΡΓΑΝΑ Υγρός Χρωματογράφος Υψηλής Πίεσης Ανιχνευτή διόδου λυχνίας Φθορισμομετρικό ανιχνευτή

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ Ρυθμιστικό διάλυμα Υπόστρωμα της C12-NBD-PC BAL, θετικό control (πρότυπη PLA2), αρνητικό control (ίδιο δείγμα BAL βρασμένο) Ένεση 20 μL στην HPLC, λex=475 nm και λem=535 nm, 0.5 mL/min Καταγράφουμε τη μεταβολή του εμβαδού κορυφής του C12-NBD-FA συναρτήσει του χρόνου Πρότυπη καμπύλη

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΜΕΘΟΔΟΥ Γραμμική για ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων (από 1 pmol έως 250 nmol FA/h/mL BAL) Επαναλήψιμη (% RSD ≤ 13% PLA2) Παρουσιάζει σημαντική στατιστική συσχέτιση με ραδιομετρική μέθοδο Εφαρμόζεται σε περιπτώσεις δειγμάτων BAL, ορού ή πλάσματος με υψηλή συγκέντρωση ολικής πρωτεΐνης