Βιολογία Θετικής Κατεύθυνσης Γ΄ Τάξης Ενιαίου Λυκείου Κεφάλαιο 8ο : Εφαρμογές της Βιοτεχνολογίας στην Ιατρική Θοδωρής Καλαϊτζής

3 βασικοί στόχοι Ιατρικής ΕΓΚΑΙΡΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΣΘΕΝΕΙΑΣ Ανάπτυξη ευαίσθητων τεχνικών για: 1. Εντοπισμό ασθένειας σε αρχικά στάδια, 2. Ανίχνευση μόλυνσης από Μ/Ο & 3. Διαπίστωση ύπαρξης κληρον. ασθένειας ΠΡΟΛΗΨΗ ΣΟΒΑΡΩΝ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ (ηπατ. Β, πολιομυελίτιδα, φυματίωση, καρκίνος)  Ανάπτυξη εμβολίων ή πιο εξελιγμένων, ασφαλών και φτηνών εμβολίων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ  Κατανόηση βιοχημ. μηχανισμών & γενετ. υποβάθρου ασθένειας  Φαρμακ. αγωγή ή «γενετική διόρθωση» Θοδωρής Καλαϊτζής

Συνεισφορά Βιοτεχνολογίας με… Ανάπτυξη τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA, χρήση της PCR & χρήση ανιχνευτών μορίων DNA  Βελτίωση & παραγωγή διαγνωστικών ουσιών (μονοκλωνικά αντισώματα), αποτελεσματικών εμβολίων και φαρμακευτικών προϊόντων ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ: Στηρίζεται στη ν εφαρμογή της τεχνολογίας του ανασυνδ. DNA στη θεραπεία πολλών γεν. ασθενειών (κυστική ίνωση, AIDS, καρκίνοι κτλ.) Θοδωρής Καλαϊτζής

Φαρμακευτικές πρωτεΐνες Παλιότερα: Μικρές ποσότητες – Ακριβές – Όχι πλήρως κατανοητή δράση Σήμερα: Κλωνοποίηση γονιδίων ανθρώπου για πάνω από 300 τέτοιες πρωτεΐνες (ινσουλίνη, ιντερφερόνες, αυξητική ορμόνη) Ινσουλίνη (πριν το 1982): Από πάγκρεας χοίρων και βοοειδών (εκχύλιση της δαπανηρή και πολύπλοκη) – αλλεργικές αντιδράσεις λόγω μικρών διαφορών από ανθρώπινη Θοδωρής Καλαϊτζής

Ινσουλίνη (1) 51 αμινοξέα Παραγωγή από ειδικά κύτταρα παγκρέατος Ρύθμιση μεταβολισμού Η2Ο/C και ειδικά της γλυκόζης στο αίμα Διαβήτης: Μείωση ή έλλειψη ινσουλίνης Δεκάδες εκατομμύρια άτομα στον κόσμο πάσχουν από 2 κυρίως είδη διαβήτη http://www.healthinsite.gov.au/topics/Types_of_Diabetes Θοδωρής Καλαϊτζής

Ινσουλίνη (2) Δύο μικρά πεπτίδια Α και Β – Συγκράτηση με δισουλφιδικούς δεσμούς Προϊνσουλίνη από γονίδιο ινσουλίνης Μετά μετατροπή του σε (ώριμη) ινσουλίνη με κόψιμο ενδιάμεσων αμινοξέων Παραγωγή σε εργαστήριο: 1. Παραγωγή πρόδρομου μορίου σε βακτ. Καλλιέργεια 2. Μετατροπή σε ινσουλίνη με ένζυμικό κόψιμο ( κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης & επιλογή κατάλληλου κλώνου) Θοδωρής Καλαϊτζής

Στάδια κλωνοποίησης και απομόνωσης γονιδίου ινσουλίνης Απομόνωση συνολικού mRNA από κύτταρα ανθρώπινου παγκρέατος Κατασκευή δίκλωνων μορίων DNA & ενσωμάτωσή τους σε πλασμίδια Μετασχηματισμός βακτηρίων με ανασυνδυασμένα πλασμίδια & πολ / σμός τους σε υγρό θρεπτικό Επιλογή βακτηρίων με γονίδιο προϊνσουλίνης Ανάπτυξη σε βιοαντιδραστήρα, παραγωγή προϊνσουλίνης και κόψιμο της με κατάλληλο ένζυμο Θοδωρής Καλαϊτζής

Ιντερφερόνες Αντιικές πρωτεΐνες (βλέπε Βιολογία Γενικής) Οικογένεια συγγενών πρωτεΐνών  α, β και γ [ανάλογα με χημική και βιολογική ενεργότητα] Αντικαρκινικοί παράγοντες (γιατί;) Παραγωγή σε ελάχιστες ποσότητες στο σώμα  όχι ευρεία χρήση στη θεραπεία ασθενειών Σήμερα: Κλωνοποίηση κάποιων γονιδίων τους  Παραγωγή τους σε μεγάλες ποσότητες, όπως η ινσουλίνη (π.χ. για σκλήρυνση κατά πλάκας) Θοδωρής Καλαϊτζής

Αντισώματα «Το ιδανικό φάρμακο πρέπει να μπορεί να εξουδετερώνει τις μολύνσεις, χωρίς να προκαλεί παρενέργειες στον οργανισμό». [Ehrlich] Αντισώματα ή ανοσοσφαιρίνες: πρωτεΐνες που παράγονται από Β-λεμφοκύτταρα του οργανισμού μας, ως αντίδραση σε αντιγόνο (παθογόνος Μ/Ο, ιός, ξένη ουσία) + αντίδραση με αυτό  Εξουδετέρωση 1 Αντίσωμα: αναγνώριση 1 μόνο περιοχής του αντιγόνου (αντιγονικός καθοριστής) Μεγάλο αντιγόνο (Μ/Ο): πολλοί αντιγονικοί καθοριστές  παραγωγή πολλών αντισωμάτων Θοδωρής Καλαϊτζής

Μονοκλωνικά αντισώματα (1) Κάθε είδος αντισώματος που αναγνωρίζει έναν αντιγονικό καθοριστή, παράγεται από έναν κλώνο (όμοιων) Β-λεμφοκυττάρων & Όλα τα αντισώματα που παράγονται απ’ αυτόν τον κλώνο ονομάζονται μονοκλωνικά. Χρησιμοποίηση ως: Διαγνωστικά για ανίχνευση ασθενειών Εξειδικ. φάρμακα κατά παθογόνων Μ/Ο Εξειδικ. φάρμακα κατά καρκινικών κυττάρων. ΌΜΩΣ… Θοδωρής Καλαϊτζής

Μονοκλωνικά αντισώματα (2) …αδυναμία επιβίωσης Β-λεμφοκυτ. για μεγάλο χρονικό διάστημα εκτός οργανισμού  Αυτό κατέστη δυνατό μετά από σύντηξη με καρκινικά κύτταρα (!?!)  ΥΒΡΙΔΩΜΑΤΑ: παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων ενός (τύπου) ΜονΑντ Τεχνική παραγωγής ΜονΑντ: 1975 για πρώτη φορά – 4 διακριτά στάδια Απαραίτητα: ποντικοί – καρκινικά κύτταρα – κατάψυξη – λοιπός εργαστηριακός εξοπλισμός Ανοσοδιαγνωστικά – Θεραπευτικά ΜονΑντ – Για επιλογή συμβατών μοσχευμάτων Θοδωρής Καλαϊτζής

Παραγωγή Μονοκλωνικών Αντισωμάτων Χορήγηση επιλεγμένου αντιγόνου σε ποντικό – Ανοσολογική αντίδραση – Παραγωγή αντισ. από εξειδικ. Β-λεμφοκύτ. (2 εβδομάδες μετά) Αφαίρεση σπλήνα ποντικού – απομόνωση Β-λεμφοκυτ. Σύντηξη Β-λεμφοκυτ. με καρκινικά – Παραγωγή υβριδωμάτων (που παράγουν ΜονΑντ) Φύλαξη υβριδωμάτων στους -80 ˚ C & παραγωγή συγκεκριμένου ΜονΑντ οποτεδήποτε Θοδωρής Καλαϊτζής

Ανοσοδιαγνωστικά ΜονΑντ Ανίχνευση (σε υγρά σώματος): Ουσιών υπεύθυνων για διάφορες ασθένειες Παθογόνων Μ/Ο Διακύμανσης συγκέντρωσης προϊόντων μεταβολισμού  πιθανότητα εμφάνισης κάποιας ασθένειας Τεχνική ανίχνευσης: γρήγορη, απλή, ευαίσθητη, ακριβής & επιτρέπει την ανίχνευση σε αρχικό στάδιο Άλλες χρήσεις: τυποποίηση ομάδων αίματος – εξακρίβωση πιθανής κύησης (ειδικά ονοσοδιαγνωστικά τεστ με ΜονΑντ για ειδικές ορμόνες κύησης) Θοδωρής Καλαϊτζής

Θεραπευτικά ΜονΑντ Πιο ενδιαφέρον: Θεραπεία καρκίνου, γιατί… Παρουσία (στην εξωτερική επιφάνεια καρκ. κυτ.) μεγάλης ποικιλίας αντιγόνων  Καρκινικά αντιγόνα (μη παρόντα σε φυσιολ.) Έτσι, κατασκευή ΜονΑντ έναντι αυτών – «μεταφορείς/μεσάζοντες» ισχυρών αντικαρκινικών φαρμάκων Δράση φαρμάκων απευθείας σε καρκινικά κυτ. & Καταστροφή τους Αποφυγή επέμβασης & επιπτώσεων χημειοθεραπείας Θοδωρής Καλαϊτζής

Επιλογή συμβατών μοσχευμάτων Παρουσία ειδικών αντιγόνων επιφανείας (αντιγόνα ιστοσυμβατότητας) σε κύτταρα των οργάνων  Αναγνώριση από ειδικά ΜονΑντ Έλεγχος δωρητών οργάνων – Διαπίστωση αν ταιριάζουν με αντίστοιχα ασθενών Αποφυγή απόρριψης  Επιτυχείς μεταμοσχεύσεις Θοδωρής Καλαϊτζής

Γενετικές ασθένειες 4.000 ασθένειες & άνω οφείλονται σε γονιδιακές μεταλλάξεις – εμφάνιση πολλών σε μεγάλη ηλικία 1 γονίδιο ή αλληλεπίδραση 2 ή περισσοτέρων ή/και επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων (ακτινοβολία / χημικές ουσίες) Όλες σχεδόν  δυσμορφίες, 80%  διανοητική καθυστέρηση, 20%  θάνατος σε παιδική ηλικία Παραδείγματα: Κυστική ίνωση, ασθένεια του Huntington(http://b4tea.blogspot.com/2012/02/know-symptoms-of-huntingtons-disease.html), μυϊκή δυστροφία Duchenne. Θοδωρής Καλαϊτζής

Χαρτογράφηση Εντοπισμός στα χρωμοσώματα της θέσης πολλών μεταλλαγμένων γονιδίων, που προκαλούν τις αντίστοιχες ασθένειες Επίσης: Κλωνοποίηση ορισμένων μεταλλαγμένων γονιδίων & Σύγκριση με τα φυσιολογικά αλληλόμορφα Κύριος στόχος του προγράμματος του ανθρώπινου γονιδιώματος (Human Genome Project) Οι γνώσεις αυτές οδήγησαν στη… Θοδωρής Καλαϊτζής

Γονιδιακή Θεραπεία Δυνατότητα ανάπτυξης θεραπείας, στηριγμένη στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA Στόχος της: Διόρθωση της γενετικής βλάβης, με εισαγωγή στους ασθενείς φυσιολογικά αλληλόμορφα του μεταλλαγμένου γονιδίου (Εκτός από κλωνοποίηση) Προϋπόθεση: Προσδιορισμός κυττάρων που εμφανίζουν τη βλάβη από την ασθένεια Πρώτη εφαρμογή της: 1990 σε 4χρονο κορίτσι με … Θοδωρής Καλαϊτζής

…ανεπάρκεια του ανοσοποιητικού συστήματος Οφείλεται στην έλλειψη του ενζύμου ADA (απαμινάση της αδενοσίνης) – Έλλειψη που οφείλεται σε μετάλλαξη του αντίστοιχου γονιδίου ADA: παίρνει μέρος στο μεταβολισμό των πουρινών [:Αδενίνη – Γουανίνη / πυριμιδίνες: Κυτοσίνη – Θυμίνη – Ουρακίλη] στα κύτταρα του μυελού των ιστών Αυτοσωμικός υπολειπόμενος τύπος κληρονομικότητας Χρόνιες μολύνσεις – Προδιάθεση για ανάπτυξη καρκίνου σε πολύ μικρή ηλικία – Θάνατος πολλών ύστερα από λίγους μήνες ζωής Θοδωρής Καλαϊτζής

Ex vivo γονιδιακή θεραπεία Πολ/σμός λεμφοκυττάρων παιδιού σε κυτταροκαλλιέργειες Ενσωμάτωση φυσιολ. γονιδίου σε ιό – φορέα (έχει καταστεί αβλαβής) με τεχνικές ανασυνδ. DNA Εισαγωγή τροποποιημένου ιού σε λεμφοκύτταρα Εισαγωγή γενετ. τροπ. λεμφοκυτ.  παιδί με ενδοφλέβια ένεση & παραγωγή ενζύμου ADA. Θοδωρής Καλαϊτζής

In vivo γονιδιακή θεραπεία Αντίθετα με κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος, τροποποίηση άλλων κυτταρικών μορφών, όπως των πνευμόνων απαιτεί… Την προσέγγιση των Anderson (& συνεργ.)  In vivo θεραπεία: Ενσωμάτωση φυσιολογικών γονιδίων σε μόρια – φορείς Εισαγωγή αυτών κατευθείαν στον οργανισμό Πρώτη φορά εφαρμόστηκε το 1993 (κυστική ίνωση) Θοδωρής Καλαϊτζής

Κυστική ίνωση Οφείλεται σε μεταλλάξεις ενός γονιδίου που είναι υπεύθυνο για την κωδικοποίηση μιας πρωτεΐνης… …απαραίτητης για τη σωστή λειτουργία των επιθηλιακών κυττάρων των πνευμόνων Υπολειπόμενος αυτοσωμικός τύπος κληρονομικότητας Επηρεάζει κυρίως τη λειτουργία των πνευμόνων (υπερβολική παραγωγή βλέννας σε πνεύμονες και γαστρεντερικό σωλήνα  Προβλήματα αναπν. & παρεμπόδιση έκκρισης παγκρεατικού υγρού  Μη σωστή πέψη τροφών) Θοδωρής Καλαϊτζής

In vivo θεραπεία κυστ. ίνωσης Ενσωμάτωση φυσιολογικού σε αδενοϊό Εισαγωγή ανασυνδυασμένου ιού στον οργανισμό με ψεκασμό (με τη βοήθεια βρογχοσκοπίου) Μόλυνση κυττάρων αναπνευστικού συστήματος Εισαγωγή του στα κύτταρα του αναπν. συσ. Ενσωμάτωση φυσιολογικού γονίδιου στο γονιδίωμα των κυττάρων και Παραγωγή φυσιολογικού προϊόντος Θοδωρής Καλαϊτζής

Όμως… Η γονιδιακή θεραπεία δεν είναι πανάκεια Πρέπει να ξεπεραστούν θέματα σχετικά με χρήση φορέων (ιοί κτλ.) Αν και γενικά αβλαβείς, οι ιοί ενδέχεται να προκαλέσουν παρενέργειες, ίσως και καρκίνο Απαιτείται η ανάπτυξη πιο κατάλληλων φορέων Ενσωμάτωση του φυσιολογικού αντιγράφου του γονιδίου στο γονιδίωμα συγκεκριμένων σωματικών κυττάρων και ΟΧΙ αντικατάσταση του μεταλλαγμένου γονιδίου στα κύτταρα του οργανισμού Θοδωρής Καλαϊτζής

Human Genome Project Διεθνής συνεργασία (από το 1986 – ξεκίνημα του το 1990) με σκοπό τη χαρτογράφηση, δηλ. τον εντοπισμό της θέσης των γονιδίων στα χρωμοσώματα & τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των βάσεων του DNA στο ανθρώπινο γονιδίωμα Υπό την αιγίδα του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας και Τμήματος Ατομικής Ενέργειας (!?) των ΗΠΑ Ολοκληρώθηκε το 2001 Θοδωρής Καλαϊτζής

Η ανάλυση του ανθρώπινου γονιδιώματος συμβάλλει: Στη μελέτη της οργάνωσης και της λειτουργίας του ανθρώπινου γονιδιώματος (προσδιορισμός συνόλου γονιδίων, των ρυθμιστικών περιοχών τους και περιοχών με άγνωστη λειτουργία) Στην ανάπτυξη μεθοδολογίας για τη διάγνωση και τη θεραπεία των ασθενειών Στη μελέτη της εξέλιξης του ανθρώπινου γονιδιώματος (παράλληλα προγράμματα άλλων οργανισμών εν εξελίξει) Στη μαζική παραγωγή προϊόντων με βιοτεχνολογικές μεθόδους (φάρμακα, βιομηχανία, γεωργία, κτηνοτροφία) Θοδωρής Καλαϊτζής

Φφφ Φφφ Θοδωρής Καλαϊτζής