Mikroorganismide kasvu termodünaamika (Rakkude kasvu stöhhiomeetriline võrrand ja selle analüüs) NB! Võrdle keemiliste reaktsioonide stöhhiomeetrilise võrrandiga ja Gibbs’i võrrandiga!

kineetika – massi toime seadus vs. eksponentsiaalse kasvu seadus Keemilised reaktsioonid (A<->B) vs. mikrobioloogilise sünteesi protsessid ained vs. biomass kineetika – massi toime seadus vs. eksponentsiaalse kasvu seadus stöhhiomeetria – C-molaarne esitus (biomass pole molekul), elementide jäävuse seadus on ühine termodünaamika – Gibbsi valem vs. “taandatuse astme valem”

Rakud koosnevad 99,5% ulatuses 6 elemendist CHNOPS, bakterite keskmine elementkoostis on antud valemiga CH1,8O0,5N0,2P0,09S0,005 Selleks et kasvada, peavad rakud keskkonnast saama kõiki neid elemente (ning tähtsamaid mikroelemente ja vitamiine) kasvusubstraatide molekulidena. Näiteks üks populaarsemaid kasvukeskkondi on bakterite kasvatamiseks (E. coli jt) M9, mis sisaldab järgmisi komponente: C-allikas, energia allikas – glükoos (C6H12O6)), tüüpiliselt 3-20 g/l sõltuvalt vajalikust rakkude lõpptihedusest, P-allikad – Na2HPO4*7H2O – 6 g/l, KH2PO4 – 3 g/l, N-allikas – NH4Cl – 1 g/l, S-allikas – MgSO4 – 0,246 g/l H ja O saavad rakud veest ja õhust ning juba kirjeldatud komponentidest, lisaks sisaldab sööde mikroelemente ning vajadusel ka vitamiine Nimetatud ainetest peavad rakud sünteesima kõik monomeerid ja polümeerid – rakud on isepaljunevad mullreaktorid

Funktsioon ainevahetuses 12 põhilist bioelementi, nende allikad ja funktsioonid mikroorganismides Element % kuivainest Allikas Funktsioon ainevahetuses C 50 Orgaanilised ühendid, CO2 Rakumaterjali põhilised komponendid O 20 O2, H2O, orgaanilised ühendid, CO2 H 8 H2, H2O, orgaanilised ühendid N 14 NH4+, NO3-, N2, orgaanilised ühendid S 1 SO42-, HS-, S0, S2O32-, orgaanilised väävliühendid Tsüsteiini, metioniini, tiamiini, pürofosfaadi, koensüüm-A, biotiini ja α-rasvhapete koostises P 3 HPO42- Nukleiinhapete, fosfolipiidide ja nukleotiidide koostises K K+ Oluline anorgaaniline katioon rakukoostises, mitme ensüümi, sh. püruvaatkinaasi kofaktor Mg 0,5 Mg2+ Paljude ensüümide (sh. kinaaside) kofaktor; esineb rakukestas, membraanides, ribosoomides ja fosfoestrites Ca Ca2+ Esineb eksoensüümides (amülaasid, proteaasid) ja rakukestas; Ca-dipikolinaat on endospooride tähtis komponent Fe 0,2 Fe2+, Fe3+ Esineb tsütokroomides, ferredoksiinides jt. rauda ja väävlit sisaldavates valkudes; ensüümide (dehüdrogenaaside) kofaktor Na Na+ Osaleb transpordiprotsessides Cl Cl- Tähtis anorgaaniline anioon rakus

Erinevate organismide elementkoostis g/100 g kuivmassi Bakterid Seened Pärmid Fosfor 2,0-3,0 0,4-4,5 0,8-2,6 Väävel 0,2-1,0 0,1-0,5 0,01-0,24 Kaalium 1,0-4,5 0,2-2,5 1,0-4,0 Magneesium 0,1-0,3 Naatrium 0,5-1,0 0,02-0,5 0,01-0,1 Kaltsium 0,01-1,1 0,1-1,4 Raud 0,02-0,2 0,1-0,2 0,01-0,5 Vask 0,01-0,02 - 0,002-0,01 Mangaan 0,001-0,01 0,0005-0,007 Molübdeen 0,0001-0,0002

Rakud, nii eukarüootsed kui prokarüootsed, koosnevad 70% veest ja 30% kuivainest. Kuivainest on 95% biopolümeerid. Miks polümeeridest?

Keemiline koostis C-molaarses esituses C-molaarne esitus – biokeemilise ühendi keemilise valemi esitamine ümberarvutatuna ühe süsiniku aatomi peale. Biomass koosneb neljast (kuuest) peamisest elemendist. Biomass koosneb viiest makromolekulide fraktsioonist. CHNOPS >99% elementidest CH1,8O0,5N0,2P0,09S0,005 – biomass Komponent Keemiline koostis C-molaarses esituses Taandatuse aste Valk (30-70% biomassist) CH1,6O0,3N0,26S0,007 4,2 RNA (10-30%) CH1,25O0,75N0,4P0,1 3,09 DNA (2-5%) CH1,26O0,62N0,38P0,1 3,38 Polüsahhariidid (1-20%) CH1,67O0,83 4,01 Lipiidmembraan (1-20%) CH1,93O0,11 5,71 Biomass CH1,8O0,5N0,2

Biomass koosneb biopolümeeride koostisesse kuuluvatest monomeeridest: DNA – dA, dT, dG, dC RNA – A, U, G, C Valgud – 20 aminohapet Polüsahhariidid – lihtsuhkrud Lipiidmembraan – lipiidid Kokku umbes 30-50 monomeeri Metabolismi vaheproduktid moodustavad vähem kui 5% kuivmassist

Monomeeride sisaldus E. coli rakus - µmooli/g dwgt Ainekogus (μmol/g kuivkaalu) Valkude aminohapped Lipiidide komponendid Alaniin 488 Glütserool 161 Arginiin 281 Etanoolamiin 97 Asparagiin 229 C16:0 rasvhapped (43%)   Aspartaat C16:1 rasvhapped (33%) Tsüsteiin 87 C18:1 rasvhapped (24%) Glutamaat 250 Keskmine rasvhappe 258 Glutamiin LPS komponendid Glütsiin 582 Glükoos 16,8 Histidiin 90 Glükoosamiin Isoleutsiin 276 25,2 Leutsiin 428 Ramnoos 8,4 Lüsiin 326 Heptoos Metioniin 146 KDO Fenüülalaniin 176 Hüdroksümuriinhape 33,6 Proliin 210 Rasvhape (C14:0) Seriin 205 Peptidoglükaani komponendid Treoniin 241 N-atsetüülglükoosamiin 27,6 Trüptofaan 54 N-atsetüülmuraamhape Türosiin 131 55,2 Valiin 402 Diaminopimelaat RNA nukleotiidid AMP 165 Glükogeeni komponendid (glükoos) 154 GMP 203 Polüamiinid CMP 126 Putrestseiin 34,1 UMP 136 Spermidiin 7 DNA nukleotiidid dAMP 24,6 dCMP 25,4 dGMP dTMP Monomeeride sisaldus E. coli rakus - µmooli/g dwgt

Tegelikult tuleb veel peale rakkude elementkoostise teada ka nende makromolekulaarset ja monomeerset koostist

Keskmise E. coli raku koostis – proteoom, metaboloom, transkriptoom,… Komponendid % kuiv-kaalust Mass (g*1015)/rakk Ainekoogus kuivkaalus Molekulide arv rakus Erinevate molekulide arv rakus Valgud 55 156 4,0*104 2350000 1850 RNA 20,5 58   23S rRNA 31 1,0*106 18700 1 16SrRNA 15,5 5,0*105 5S rRNA 1,2 3,9*104 tRNA 8,2 2,5*104 198000 60 mRNA 2,3 1380 600 DNA 3,1 8,8 2,5*109 2,1 Lipiidid 9,1 25,9 705 22000000 Lipopolü-sahhariidid 3,4 9,7 4070 1430000 Peptidoglükaan 2,5 7,1 (904)n Glükogeen 4300 Polüamiinid 0,4 1,1 Putrestsiin 0,83 88 5600000 Spermidiin 0,27 145 1100000 Metaboliidid, kofaktorid, ioonid 3,5 9,9 800+

→ X4CHαOβNγ+ X5CHα’Oβ’Nγ’ + X6CO2 + X7H2O Rakkude kasvu stöhhiomeetriline võrrand X1CHnOm + X2O2 + X3NH3 → → X4CHαOβNγ+ X5CHα’Oβ’Nγ’ + X6CO2 + X7H2O Saagisekoefitsiendid viisime sisse juba rakukultuuri kasvu kineetika kirjeldamisel – põhimõtteliselt on need samad koefitsiendid, kui stöhhiomeetriline võrrand ei muutu näitab, kui palju biomassi moodustub tarbitud limiteeriva substraadi ühiku kohta, näitab, kui palju produkti moodustub tarbitud limiteeriva substraadi ühiku kohta Süsiniku, lämmastiku, fosfori… allikas, hapnik, biomass, produktid, CO2…

Termodünaamika põhiseadus, mida edukalt kasutatakse ka keemias on termodünaamika teine seadus: Bioloogias on termodünaamika kohta kirjutatud palju artikleid, bioloogia termodünaamika probleemid on olnud tähtsad filosoofiliselt, aga praktikas on termodünaamika tähtsus olnud üllatavalt väike

kineetika – massi toime seadus vs. eksponentsiaalse kasvu seadus Keemilised reaktsioonid (A<=>B) vs. mikrobioloogilise sünteesi protsessid ained vs. biomass kineetika – massi toime seadus vs. eksponentsiaalse kasvu seadus stöhhiomeetria – C-molaarne esitus (biomass pole molekul), elementide jäävuse seadus on ühine termodünaamika – Gibbsi valem vs. “taandatuse astme valem”

ATP on väga “kaval” energiakandja

Konjugeeritud reaktsioonid – üks elu “põhisaladusi”

Konjugeeritud reaktsioonid Mehhaanikas Konjugeeritud reaktsioonid A + B C + Energia (Keemiline energia - ATP) E + F + Energia G Bioloogias

Mootorid – molekulaarsed mootorid ~1m 10-8m=100Å

Rakumootorid: DNA polümeraas RNA polümeraas ribosoomid ATP süntaasid kinesiin jt transportmootorid viburid jms mitootiline aparaat sarkomeerid (lihased) ...

Rakkude kasvu termodünaamika põhiprintsiip

Erinevad rakkude “termodünaamilised kasvustrateegiad”

Keskmised elementkoostised ja põlemisentalpiad erinevate mikroorganismide jaoks

Biomassi põlemisentroopia ja –vabaenergia väärtused

Entalpia ja vabaenergia muutused aeroobsel kasvul

Kahjuks praegu siiski ei teata, kuidas, missuguste reeglite järgi toimub katabolismi ja anabolismi ühendamine (coupling) ja seetõttu on otsitud rakkude termodünaamilise efektiivsuse hindamiseks abi kasvu stühhiomeetrilisest võrrandist ja elementide bilanssidest

→ X4CHαOβNγ+ X5CHα’Oβ’Nγ’ + X6CO2 + X7H2O I. Kasvu stöhhiomeetrilise võrrandi analüüs võimaldab hinnata mikroobsete protsesside saagiseid: X1CHnOm + X2O2 + X3NH3 → → X4CHαOβNγ+ X5CHα’Oβ’Nγ’ + X6CO2 + X7H2O C: λ1 X1 = X4 + X5 + X6 H: λ2 nX1 +3X3 = αX4 + α’X5 + 2X7 O: λ3 mX1 + 2X2 βX4 + β’X5 + 2X6 + X7 N: λ4 +X3 = γX4 + γ’X5 Korrutame iga võrrandi λi-ga ja liidame kokku

Kui λ1 = 4; λ2 = 1; λ3 = -2; λ4 = -3 siis X1es + X2e0 = X4eb + X5ep , kus es = λ1 + n λ2 + m λ3 = 4 + n – 2m e0 = 2λ3 = -4 eb = λ1 + α λ2 + β λ3 + γ λ4 = 4 + α - 2β - 3γ ep = λ1 + α’ λ2 + β’ λ3 + γ’ λ4 = 4 + α’ - 2β’ - 3γ’ es, eb, ep, eO – limiteeriva substraadi, biomassi, produktide ja hapniku taandatuse aste Taandatuse aste on statistiliselt lineaarselt seotud nende ainete moodustamise standardse vaba energiaga Valime λi väärtused nii, et lineaarses kombinatsioonis “kaoksid” X3, X6 ja X7 koefitsiendid – need võrduksid 0-ga

X1 = X4 + X5 + X6 X1es + X2e0 = X4eb + X5ep

+ es eb RQ > 1 + es eb RQ <> 1 RQ > 1 Võrrand seob biomassi, substraadi ja produktide elementkoostised, saagised ja energeetika aeroobsel kasvul

YXS = es/eb, kui es<=eb ja 1, kui es>eb Kui RQ  ∞, siis YXS = es/eb, kui es<=eb ja 1, kui es>eb See tähendab, et saagis sõltub substraadi taandatuse astmest =substraadi moodustamise standardsest vabast energiast (vt. ülesanded)

Ainete taandatuse astmed (kättesaadavate elektronide arv) on seotud ainete (substraatide) tekkimise standardse vaba energiaga

Rakkude kasvuruum on määratud substraadi taandatuse astme ja süsinikubilansiga

II. Kasvu stöhhiomeetriline võrrand võimaldab arvutada söötme koostist Kultiveerimisel on vaja teada, kui palju ja missuguse koostisega söödet valmistada, et kasvatada teatud kogus rakke, kasutades mingit kindlat kultiveerimisviisi (batch, fed-batch, kemostaat vms) Söötme koostise arvutamine on üks ülesannetest, mida peame lahendama

Mineraalsöötmed fed-batch kultiveerimiseks (µ-staat) Komponent Kontsentratsioon Algsööde A Algsööde B Sööde A Sööde B KH2PO4 (g/l) 15 4,3 - MgSO4 (g/l) 4 1 FeSO4 (mg/l) 300 150 CaCl2 (mg/l) 2000 1000 MnSO4ּ5H2O (mg/l) 100 50 CoCl2ּ6H2O (mg/l) 20 10 ZnSO4ּ7H2O (mg/l) CuCl2ּ5H2O (mg/l) Na2MoO4ּ2H2O (mg/l) Glükoos (g/l) 2 3 600 Maht (l) 2,7 2,8