Boala von Willebrand Robert Gosselin MT (ASCP), CLS

Boala von Willebrand (BVW): diagnoză bazată pe simptome şi principii directoare privind tratarea, Institutul Naţional pentru Inimă, Plămâni şi Sânge (NHLBI) Raport Specializat (SUA) (Hemofilia 2008; 14:171-232) Analiza Factorului von Willebrand: Ghid – Ediţia a II-a (H51-2) (în curs de desfăşurare)

În 1924 Erik von Willebrand a evaluat o fetiţă de 5 ani cu diateză hemoragică şi ca rezultat cei 66 membri ai familiei de pe coasta Finlandei şi a constatat: Hemoragii mucocutanate Patologie moştenită autosomal Sângerări prelungite Timp normal de coagulare Nu este corectat cu transfuzii de sânge

În 1950 deficienţa proteinei în plasmă a cauzat hemoragii prelungite A fost considerată “Factorul von Willebrand” O dată cu producerea crioprecipitatului şi a concentraţiilor Factorului 8, s-a constatat că acestea s-au complicat împreună

FVW este produs în celulele endoteliale – sintetizat şi păstrat în corpusculii Weibel-Palade megacariocite – stocate în granulele alpha Se constituie din subunităţi identice pentru a forma şiruri lineare multimeri formaţi în complexul Golgi

În timpul circulaţiei, FVW este conjugat cu F8 Pe leziune, FVW este supus unei modificări corespunzătoare şi aderă la ţesutul subendotelial sub influenţa unor condiţii limitate Plachetele aderă via GPIb-IX Timpul de înjumătăţire este de ~12 ore

Multimerii FVW – Degradare datorită ADAMTS13 [Disintegrin şi Metaloproteinază cu TromboSpondin de tipul 1, membrul 13] Deficienţa ADAMTS13 a fost asociată cu TTP

Funcţiile FVW Hemophilia 2008; 14:177

Boala von Willebrand Deficienţa proteinei în plasmă a factorului von Willebrand (FvW) Deficienţă cantitativă Deficienţă parţială de tip I Deficienţă totală de tip III Deficienţă calitativă (de tip II) Anomalie funcţională Braţ scurt al cromozomului 12

Tipurile de Boală Von Willebrand Tipul 1-autosomal dominant Tipul 2-autosomal dominant 2A (autosomal recesiv) 2B 2M 2N (autosomal recesiv) Tipul 3 (autosomal recesiv) Pseudo-BVW-autosomal dominant BVW dobândită

Proteina FvW-Genă/mRNA/Domenii funcţionale

Boala von Willebrand 1% din populaţie cu  FvW 125/1,000,000 suferă de hemoragii semnificative În Marea Britanie, 6294 au înregistrat pacienţi diagnosticaţi cu BvW, doar 10% au beneficiat de tratament în decursul anului 2001 Tipul I numără ~75% din toate BvW Dx De la stare uşoară la gravă Hx Tendinţă de a face vânătăi foarte uşor Hemoragii nazale Hemoragii gingivale Menoragii Variabilitatea Hemoragiei De la uşoară la gravă

Terminologie BVW – boala von Willebrand FVW – proteină von Willebrand matură FVW:RCo – activitatea cofactorului ristocetină, ce măsoară activitatea proteinei FvW** FVW:Ag – antigenul FVW FVW:CB – analiza legăturii de colagen, o altă componentă a funcţiei FvW FVIII:C – activitatea factorului VIII FVW:FVIIIB - FvW- analiza legăturii factorului VIII RIPA – agregarea plachetară indusă a ristocetinei FVWpp – propeptida FvW Hemophilia 2008; 14:177

Testele de Laborator privind BvW şi deficienţa PLT

Testul de bază (recomandat pentru primul strat) Testele Screening PT şi aPTT PFA (Siemens)* sau Testarea trombocitelor (Laboratoarele Helena)* Timpul FĂRĂ sângerare FVW:RCo – măsoară activitatea Ristocetinei induse Ristocetinei independente FVW:Ag – măsoară proteina Proporţia FVW:RCo/FVW:Ag F8 – la r/o tipul 2N * Pot lipsi anumite subtipuri de BVW

Stratul al doilea (următor) Analiza multimerilor – în cadrul tipului 2 suspectat Agregarea ristocetinei Doză mică (0.6mg/ml) FVW:CBA – în cadrul tipului 2 suspectat FVWpp – în variantele tipului 1 suspectat Altele DDAVP (desmopresin) IV sau nazal Analiză moleculară Anticorpi Dobândit

Factorii ce afectează nivelele FVW Practicarea sportului Stresul Psihologic Fiziologic Timpul prelungit de aplicare a bandajului de compresie Dietă?? Altele Graviditate, contraceptive orale, HRT Traume Procese inflamatorii

Alţi factori ce influenţează nivelele FVW Tipul mostrei Este preferat citrat de sodiu de 3.2% Media FVW:Ag în grupa de sânge** Grupa O: 75 (36-157) Grupa A: 106 (48-234) Grupa B: 117 (57-241) Grupa AB: 123 (64-238) Utilizarea filtrelor pentru a obţine PPP ** Hemophilia 2008; 14:177

Micro rezervor ce conţine anti-FVW Anticorpul anti-uman conjugat al FVW ¤ FVW (+) Test Chromogenic Spălare Spălare Micro rezervor ce conţine anti-FVW ¤ + ¤ + ¤ Colorare +    ¤ ¤ ¤ + + + + + + Cantitatea de culoare trebuie să fie proporţională cantităţii de anticorpi prezenţi Incubare Incubare Testele ELISA şi LIA Reagenţi acoperiţi cu anti-FvW FvW al pacientului                 Citirea instrumentului —modificări în densitatea optică secundare agregatelor   Incubare Rezervorul de testare

Testele de aglutinare şi agregare a trombocitelor Rezultatele în comparaţie cu curba Std Testele de aglutinare şi agregare a trombocitelor Plasma pacientului + Ristocetină Ristocetină1.2 mg/mL (l) & 0.6 mg/mL (r) Trombocitele şi plasma pacientului + Ristocetină Rezultatele în comparaţie cu restul populaţiei Zhou and Schmaier Am J Clin Pathol 2005;123:172-183

FVW:RCo Plasmă săracă în trombocite Trombocite consolidate Ristocetină Pregătite pentru a fi utilizate Pot fi combinate cu ristocetină Ristocetină Iniţial utilizată în calitate de antibiotic Peptide din Amycolatopsis lurida Considerată că contribuie la apariţia efectelor mimice ca rezultat al unui stres puternic

Probleme legate de FVW:RCo Variabilitate Dintre multitudinea de ristocetine Dintre metodele reagenţilor Gradul de imprecizie nu este absolut (de la 15%) Nivel scăzut de sensibilitate Utilizarea metodelor automatizate la nivel redus 15-20%

Activitatea FVW Ristocetina independentă Plasmă săracă în trombocite Particule polimerice Latex acoperite cu anticorp monoclonal (anti-GPIb) Determină domeniul funcţional al FVW Metodele LIA şi ELISA Poate reduce variabilitatea asociată cu FVW:RCo

IL FVW:Act versus Siemens FVW:RCO

IL FVW:Act versus Siemens FVW:RCo

FVW:RCo versus RIPA FVW:RCo RIPA Măsoară activitatea FvW PLT exogene Ristocetină exogenă Aglutinarea trombocitelor Metodele ELISA (FVW:Act) Metodele LIA (FVW:Act) RIPA Măsoară interacţiunea dintre FvW şi trombocitele GP Plasma pacienţilor Trombocitele pacienţilor Ristocetină exogenă Agregarea trombocitelor FvW:RCo măsoară doar plasma FvW, în timp ce RIPA măsoară atât plasma FvW, cât şi interacţiunea dintre FvW şi trombocite

FVW:Ag Majoritatea laboratoarelor utilizează sau testul ELISA, sau testul LIA Testul ELISA … ore Testul LIA … minute Metoda tradiţională este electroforeza pe gel Mai puţină variabilitate decât la FVW:RCo Posibile efecte în “pre-zonă” sub influenţa metodelor automatizate (LIA) Testul poate fi aplicat şi la alte indicaţii Vasculita Rx

FVW:CB Metoda ELISA Trombocite acoperite cu colagen de tip I sau tip III Sursa ecvino-bovină Corelare mai bună cu greutate moleculară mare (HMW) a FvW Capacitate de re-producere mai bună decât la FvW:Rco Detectare îmbunătăţită la nivele inferioare Neaprobat de către Administraţia Alimentelor şi Medicamentelor din SUA Păcat!!!

Analiza legăturii de colagen Raport : FvW:Ag la FvW:CB Favaloro, Am J Clin Pathol 2000;608-618 Type 1 VWD Type 2 VWD

Analiza multimerică a FvW de tip II Favaloro, Thromb Haemost 2007; 98:346-358

Propeptida FvW (FvW:pp) Stocat în granule α sau corpusculi Weibel-Palade În urma secreţiei în plasmă, t½: 2-3 ore versus FvW matur t½: ~10 ore Concentraţiile plasmei ~1μg/mL versus FvW matur: 10 μg/mL Studiile efectuate indică: Raportul FvW:pp mărite la FvW:Ag cu deficienţă genetică redusă a FvW:Ag cu supravieţuire  FvW Supravieţuirea  FvW ar sugera de asemenea strategii alternative Rx

Pseudo-BVW Similară tipului 2 Număr redus de trombocite “Are avantaje în funcţie” Agregare cu doză mică de ristocetină Trebuie să efectueze FVW:PB Mărit faţă de BVW:2B Normal cu psuedo-BVW Receptor GPIb anormal

From M Ledford-Kramer, Editor Clot-Ed

Ghidul CLSI H51-2 Recomandări referitor la Tipul mostrei, procesare Testare Calibrare şi raportare a rezultatelor Aceeaşi calibrare pentru FVW:Act şi FVW:Ag Calibrare diferenţiată pentru terapeutică Unităţi Proporţii Propuneri privind Implementarea/validarea ?? Implementarea noii metode Lot-la-lot

BvW de tip I FvW:RCo, FvW:CB, FvW:Ag sunt <50 IU/ml Hx semnificativ pentru hemoragiile mucocutanate FvW:RCo, FvW:CB, FvW:Ag sunt <50 IU/ml Raportul FvW:RCo/FvW:Ag >0.7 Numărul de PLT (trombocite) Normal Analiza multimerică normală Activitatea Factorului VIII normal/ RIPA e redusă PFA C.T. ca regulă , BT puţin mai bine decât “moneda” Supravieţuirea proptidelor??

BvW de tip 2A Variantă limitată cu funcţia  PLT-dependente în absenţa multimerilor de greutate moleculară mare Două tipuri de mutaţii Grupul 1: circulaţie deficitară intracelulară, reţinere  a multimerilor considerabili în ER Grupul 2: susceptabilitate mărită la proteoliza FvW,  multimeri largi Malinterpretare, ştergeri, inserări Anamneză clinică (personală sau familială) hemoragie (mucosal)

BvW de tip 2A Constatările de Laborator Număr de PLT Normal FvW:RCo scăzut FvW:CB redus Activitatea factorului VIII normală/ FvW:Ag ca regulă normal/  Raportul FvW:Rco sau vWF:CBA la vWF:Ag este <0.7 RIPA este redusă PFA C.T. de obicei  Absenţa multimerilor cu greutate moleculară mare

BvW de tip 2B Variantă modificată cu “avantaj în funcţie” Afinitate crescută pentru GpIb plachetară 4 mutaţii (substituiri nucleotide) în cadrul FvWA1 ce numără ~90% de tip IIb Parametri de laborator similari ca şi în cazul pseudo - BvW Anamneză clinică (personală sau familială) hemoragie (mucosal)

BvW de Tip 2B Constatările de laborator Numărul  PLT este de la normal la scăzut FvW:RCo este redus (de obicei) FvW:CBA este scăzut (de obicei) Activitatea factorului VIII este normală/ FvW:Ag este ca regulă normal/  Raportul FvW:Rco sau FvW:CBA la vWF:Ag este <0.7 RIPA este  Doză mică de ristocetină (0.75 mg/mL) PFA---normal la  Absenţa multimerilor cu greutate moleculară mare

Pseudo- BvW Mutaţii în complexul GpIb-IX la nivel plachetar Manifestări clinice variabile ale Hemoragiei Parametri de laborator similari ca şi în cazul tipului 2B: Trombocitopenie variabilă RIPA mărit Număr redus de multimeri cu greutatea moleculară mare

Constatările de laborator diferenţiate: Tipul IIb versus Pseudo-BvW Cantitatea normală de PLT în cazul mostrei tipului IIb: RIPA mărită Cantitatea normală de Crioprecipitat în cazul pseudo-BvW Agregare spontană Testarea FVW:PB se preferă definitivă

BvW de tip 2M Variantă modificată prin funcţia  PLT-dependente fără absenţa multimerilor cu greutate moleculară mare Malinterpretare, ştergeri ale structurilor mici Anamneză clinică (personală sau familială) hemoragie (mucosal)

BvW de Tip 2M Constatările de laborator Numărul de PLT este normal FvW:RCo este scăzut FvW:CBA este redus Activitatea factorului VIII este normală/ FvW:Ag de obicei este normală/  Raportul FvW:Rco sau FvW:CBA la FvW:Ag este <0.7 RIPA is redusă PFA C.T. este ca regulă  Prezenţa multimerilor cu greutate moleculară mare Pot fi observate cantităţi mărite

BvW de Tip 2N Deficienţă calitativă ce rezultă în conjugare redusă dintre FvW:FVIII Autosomal recesivă Heterozigoţi cu factor VIII normal Hemoragia Hx legată de intervenţie chirurgicală sau trauma

BvW de Tip 2N Constatările de laborator Numărul de PLT e normal cu aPTT prelungit FvW:RCo este normal FvW:CBA este normal Activitatea  factor VIII e (de obicei între 5-30 IU/ml) Conjugare redusă dintre FvW:FVIIIC FvW:Ag e normal Raportul FvW:RCo sau FvW:CBA la FvW:Ag este >0.8 RIPA este normală PFA C.T. e normal Structura multimerului este normală

BvW de Tip III Absenţă virtuală a proteinei FvW Apariţie timpurie în timpul vieţii Mutaţii multiple, inclusiv modificări de structură şi mutaţii lipsite de sens, precum şi ştergeri

BvW de Tip III Constatările de laborator aPTT prelungit Absenţa FvW:RCo Absenţa FvW:CBA Activitatea factorului VIII este considerabil Absenţa FvW:Ag RIPA este deosebit de anormală PFA C.T. e considerabil de anormal Structurile de multimeri sunt nedetectabile