Ασκηση 1: Εισαγωγή στην Γενετική Ανάλυση ΤΕΙ Αθήνας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Χειμερινό εξάμηνο 2017-18

Γενετική Η μελέτη των γενετικών νοσημάτων Διάγνωση Πρόγνωση Θεραπεία Υπάρχουν πάνω από 6.000 γενετικά νοσήματα

Οι δύο βασικές ερωτήσεις που πρέπει να απαντηθούν στο μάθημα Γενετικής: 1η ερώτηση: Τι είδους γενετικά νοσήματα υπάρχουν; 2η ερώτηση: Πως ανιχνεύουμε τα γενετικά νοσήματα;

1η ερώτηση: Τι είδους γενετικά νοσήματα υπάρχουν; Πως μπορούν να προκληθούν γενετικά νοσήματα; Από μόνιμες και κληρονομήσιμες αλλαγές στο γενετικό υλικό του οργανισμού (μεταλλάξεις)

Ως γενετικό υλικό εννοούμε το DNA στο: γονιδίωμα: το σύνολο της αλληλουχίας του DNA χρωμόσωμα: Νηματοειδής μορφή που αποτελείται από χρωματίνη και DNA γονίδιο: Μία αλληλουχία DNA που ελέγχει την παραγωγή ενός πολυπεπτιδίου ή ενός μορίου RNA

Μεταλλάξεις μπορεί να συμβούν: 1)στο γονιδίωμα 2) στα χρωμοσώματα του πυρήνα 2) Σε κάποιο γονίδιο

Τύποι μεταλλάξεων Χρωμοσωματική μετάλλαξη Γονιδιακή μετάλλαξη Γονιδιωματική μετάλλαξη Λανθασμένος διαχωρισμός χρωμοσωμάτων Χρωμοσωματική μετάλλαξη Χρωμοσωματική αναδιάταξη Γονιδιακή μετάλλαξη Μετάλλαξη ζεύγους βάσεων

Γονιδωματική μετάλλαξη: προκαλεί ανωμαλίες στον αριθμό χρωμοσωμάτων: Όταν ο αριθμός των χρωμοσωμάτων διαφέρει από τον φυσιολογικό (46 ή 2n, όπου n=απλοειδής αριθμός, στον άνθρωπο n=23) Ανευπλοειδίες (τρισωμίες, μονοσωμίες) Πολυπλοειδίες (τριπλοειδίες 3n, τετραπλοειδίες 4n) Κυτταρική διαίρεση (μείωση): Μη διαχωρισμός χρωμοσωμάτων μονοσωμία τρισωμία

Οι Χρωμοσωματικές μεταλλάξεις προκαλούν δομικές ανωμαλίες στα χρωμοσώματα: Έλλειμματα Διπλασιασμοί Αναστροφές Μεταθέσεις Ενθέσεις Παράδειγμα ελλείμματος Θραύσεις στο χρωμόσωμα Απώλεια ενός χρωμο-σωματικού τμήματος

Οι γονιδιακές μεταλλάξεις προκαλούν αλλαγές στα ζεύγη βάσεων (σημειακές μεταλλάξεις) Παράδειγμα: δρεπανοκυτταρική αναιμία

…εκτός από το πυρηνικό DNA υπάρχει και το μιτοχονδριακό DNA

Επομένως τα γενετικά νοσήματα κατατάσσονται σε 4 βασικές κατηγορίες: χρωμοσωματικές διαταραχές Από γονιδιωματικές και χρωμοσωμικές μεταλλάξεις Μονογονιδιακά νοσήματα (μενδελικά) Από γονιδιακές μεταλλάξεις Πολυπαραγοντικές διαταραχές Από συνδυασμό γονιδιακών μεταλλάξεων και επίδρασης περιβάλλοντος μεταλλάξεις στο μιτοχονδριακό DNA

Παραδείγματα γενετικών νοσημάτων Χρωμοσωματικές διαταραχές Μονογονιδιακά νοσήματα Σύνδρομο Cri- du-Chat Μυική δυστροφία Duchenne Τρισωμία 21 Κυστική Ινωση Πολυπαραγοντικές διαταραχές Μεταλλάξεις μιτοχονδριακού DNA καρκίνος Alzheimer’s

2η ερώτηση: Πως ανιχνεύουμε τα γενετικά νοσήματα; Με ανάλυση χρωμοσωμάτων για να διαπιστώσουμε τις γενετικές ανωμαλίες Ονομάζεται κλινική κυτταρογενετική ανάλυση

Κλινική κυτταρογενετική ανάλυση Υπάρχουν πολλές τεχνικές που εφαρμόζονται στην κλινική κυτταρογενετική: Καρυότυπος Τεχνικές υβριδισμού με σημασμένους ανιχνευτές Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Αλληλούχιση γονιδιώματος Κλασσική κυτταρογενετική Μοριακή κυτταρο-γενετική

Με ποιες τεχνικές ανιχνεύουμε τα γενετικά νοσήματα; 1) καρυότυπος 3) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 2) Τεχνικές υβριδισμού με σημασμένους ανιχνευτές 4) Αλληλούχιση DNA NGS (next generation sequencing) Τεχνική FISH Αποτύπωση κατά Southern Συστοιχία CGH

1. καρυότυπος Κλασσική τεχνική Χρώση των χρωμοσωμάτων με ειδικές χρωστικές Παρατήρηση στο μικροσκόπιο των χαρακτηριστικών προτύπων ζώνωσης κάθε χρωμοσώματος Διάταξη των χρωμοσωμάτων σε ζεύγη ανάλογα με το μέγεθος τους Προσδιορισμός ανωμαλιών

2. Τεχνικές υβριδισμού με σημασμένους ανιχνευτές: a) μέθοδος FISH (φθορίζουσα υβριδοποίηση in situ) Ειδικοί ανιχνευτές σημασμένοι με φθορίζουσες ουσίες υβριδοποιούνται σε συγκεκριμένες χρωμοσωμικές περιοχές ή γονίδια Ανιχνεύονται χρωμοσωμικές ανωμαλίες με μεγαλύτερη ευκρίνεια σε σχέση με το κλασσικό καρυότυπο

Εντοπισμός συγκεκριμένης αλληλουχίας μέσω υβριδοποίησης με ανιχνευτή νουκλεικού οξέως

Β) Συστοιχία CGH (comparative genome hybridization) Συστοιχία συγκριτικής γονιδιωματικής υβριδοποίησης Παρέχει την δυνατότητα πιο ευαίσθητου και υψηλής ευκρίνειας ελέγχου του γονιδίωματος

3. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Εξαιρετικά ευαίσθητη τεχνική Εντοπισμός σημειακών μεταλλάξεων Real-time PCR

4. DNA αλληλούχιση (sequencing)

Εκτός από την μελέτη του DNA για την διάγνωση γενετικών ανωμαλιών μελετώνται επίσης και το RNA και οι πρωτείνες: ανάλυση mRNA RT-PCR (PCR αντίστροφης μεταγραφάσης) Συστοιχίες γονιδιακής έκφρασης Αποτύπωμα Northern ανάλυση πρωτεινών Αποτύπωμα Western

Ανάλυση δειγμάτων RNA Ανάλυση των μεταγράφων (των μορίων mRNA) ενός κυττάρου δίνει πληροφορίες για το πρότυπο έκφρασης των γονιδίων στο υπό μελέτη δείγμα Γίνεται πάντα σύγκριση με ένα δείγμα αναφοράς, πχ σύγκριση φυσιολογικού ιστού με καρκινικό ιστό.

Ανάλυση πρωτεινών Σε πολλές περιπτώσεις η ανάλυση των φυσιολογικών και μεταλλαγμένων γονιδίων απαιτεί την μελέτη της πρωτείνης που κωδικοποιείται από το αντίστοιχο γονίδιο Μελετάται δηλ ο τρόπος που η μετάλλαξη του DNA τροποποιεί την πρωτείνη