Πρωτεϊνική σύνθεση: Μετάφραση και Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις Μιχάλης Β. Καραμούζης MD, PhD Παθολόγος Ογκολόγος Επίκουρος Καθηγητής Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών Devlin – Κεφάλαιο 6 Lehninger – Κεφάλαιο 27 Παραδόσεις Αμφιθεάτρου Μάρτιος 2016

Μετάφραση Ευκαρυωτικό mRNA Προκαρυωτικό mRNA Μονοκιστρονικό (κωδικοποιεί μονήρες πολυπεπτίδιο) Το 5’ άκρο έχει καλύπτρα Εναρκτήριο σήμα: AUG Προκαρυωτικό mRNA Πολυκιστρονικό Το 5’ άκρο δεν έχει καλύπτρα Περισσότερα από ένα κωδικόνια έναρξης AUG

Όλες οι τριπλέτες-κωδικόνια έχουν νόημα 61 αντιστοιχούν σε αμινοξέα και 3 προκαλούν τερματισμό (STOP)

Τα πιο πολλά αα αντιπροσωπεύονται από περισσότερα από ένα κωδικόνια Όταν πολλαπλά κωδικόνια κωδικοποιούν το ίδιο αα είναι συνήθως παρόμοια Συχνά, αα με παρόμοιες δομές κωδικοποιούνται από κωδικόνια με παρόμοιες τριπλέτες Αυτό ελαχιστοποιεί τις επιπτώσεις των μεταλλάξεων (πχ CUC σε CUG: καμία συνέπεια, CUU σε AUU: leu σε ile)

Το πλήθος των κωδικονίων για κάθε αμινοξύ δεν αντιστοιχεί στη συχνότητα εμφάνισης του αμινοξέος στις πρωτεΐνες Ο γενετικός κώδικας είναι ίδιος τόσο για τα βακτήρια όσο και τους ευκαρυώτες Ένα mRNA ενός είδους μεταφράζεται σωστά (in vivo ή in vitro) από τη συσκευή πρωτεϊνοσύνθεσης ενός άλλου είδους Ο γενετικός κώδικας πρέπει να καθιερώθηκε νωρίς στην εξέλιξη

Αποκλίσεις είναι σπάνιες Στο μυκόπλασμα το UGA κωδικοποιεί Trp Στα βλεφαριδοφόρα Tetrahymena και Paramecium τα UAA και UAG κωδικοποιούν Glu Συστηματικές αλλαγές υπάρχουν μόνο στο mtDNA

Η ταλάντευση στην αναγνώριση της τρίτης βάσης Οι βάσεις στην τρίτη θέση έχουν τη μικρότερη επίδραση στο νόημα των κωδικονίων Τα πλαίσια επισημαίνουν τις ομάδες κωδικονίων στις οποίες ο εκφυλισμός της τρίτης βάσης διασφαλίζει ότι όλα τα κωδικόνια έχουν το ίδιο νόημα

Η ταλάντευση στην αναγνώριση της τρίτης βάσης Υπάρχουν περισσότερα από 20 αλλά λιγότερα από 61 tRNA Ένα tRNA συχνά αναγνωρίζει περισσότερα από ένα κωδικόνια Η βάση στην πρώτη θέση του αντικωδικονίου θα πρέπει να είναι σε θέση να ζευγαρώνει με εναλλακτικές βάσεις στην αντίστοιχη τρίτη θέση του κωδικονίου Υπόθεση ταλάντευσης (wobble hypothesis)

Η αλληλεπίδραση κωδικονίου και αντικωδικονίου

Wobble in bacteria G-U base-pairing

Μετάφραση Μεταλλαγές Σιωπηλές π.χ. στη 3η θέση ενός κωδικόνιου – όχι αλλαγή αμινοξέος Μεταλλαγές με λάθος νόημα ενσωμάτωση διαφορετικού αμινοξέος Μεταλλαγές χωρίς νόημα σχηματισμός κωδικόνιου λήξης Πλαισιο-τροποποιητική μεταλλαγή προσθήκη ή απαλοιφή ενός νουκλεοτιδίου

Μετάφραση Αμικοακυλο-tRNA συνθετάσες

Αμικοακυλο-tRNA συνθετάσες Μετάφραση Αμικοακυλο-tRNA συνθετάσες Πολλές διαφορετικές συνθετάσες Ανομοιογενής ομάδα πρωτεϊνών

Μετάφραση - Ριβοσώματα Τα ριβοσώματα είναι μεγάλα ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωμάτια που περιέχουν περισσότερο RNA από πρωτεΐνη και αποσυνδέονται σε μεγάλες και μικρές υπομονάδες

Μετάφραση - Ριβοσώματα Πηγή ριβοσώματος Μέγεθος μονομερούς Υπομονάδες Μικρή Μεγάλη Ευκαρυώτες Κυτταροδιάλυμα 80S 40S: 60S: 34 πρωτεϊνες 50 πρωτεϊνες 18S RNA 28S, 5.8S, 5S RNA Μιτοχόνδρια Ζωϊκοί οργανισμοί 55S-60S 30S-35S: 40S-45S: 12S RNA 16S RNA 70-100 πρωτεϊνες Ανώτερα φυτά 77S-80S 19S RNA 25S, 5S RNA 70-75 πρωτεϊνες Χλωροπλάστες 70S 30S: 50S: 16S RNA 23S, 5S, 4.5S RNA 20-24 πρωτεϊνες 34-38 πρωτεϊνες Προκαρυώτες E. Coli 21 πρωτεϊνες 34 πρωτεϊνες 16S RNA 23S, 5S RNA

Μετάφραση - Ριβοσώματα Η σύγκριση των μεγεθών δείχνει ότι το ριβόσωμα είναι αρκετά μεγάλο ώστε να δεσμεύει τα tRNA και το mRNA

Μετάφραση - Ριβοσώματα Το ριβόσωμα έχει αρκετά ενεργά κέντρα, κάθε ένα από τα οποία απαρτίζεται από μια ομάδα πρωτεϊνών που είναι συνδεμένη με μια περιοχή rRNA Για κάποιες καταλυτικές λειτουργίες χρειάζονται συγκεκριμένες πρωτεΐνες, όμως καμιά από τις ενεργότητες δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί από απομονωμένες πρωτεΐνες ή ομάδες πρωτεϊνών - η λειτουργία τους περιορίζεται στο πλαίσιο του ριβοσώματος

Μετάφραση - Ριβοσώματα

Μετάφραση - Ριβοσώματα Πολυσώματα - μεταφράζουν ένα μονήρες μόριο mRNA ταυτόχρονα Ελεύθερα ριβοσώματα Ριβοσώματα δεσμευμένα σε μεμβράνες

Μετάφραση Η πρωτεϊνοσύνθεση περιλαμβάνει τα στάδια της έναρξης, της επιμήκυνσης και του τερματισμού

Μετάφραση σε προκαρυωτικά κύτταρα

Μετάφραση - Έναρξη Η έναρξη απαιτεί ελεύθερες ριβοσωμικές υπομονάδες Όταν τα ριβοσώματα αποδεσμεύονται από το mRNA στο τερματισμό, αποσυνδέονται και οι δύο υπομονάδες του ριβοσώματος Οι υπομονάδες 30S δεσμεύουν παράγοντες έναρξης

Μετάφραση - Έναρξη Οι παράγοντες έναρξης σταθεροποιούν τις ελεύθερες υπομονάδες 30S και προσδένουν το εναρκτήριο tRNA στο σύμπλοκο 30S-mRNA

Μετάφραση - Έναρξη Η έναρξη απαιτεί υπομονάδες 30S που φέρουν τον IF-3 Οι βάσεις του 16S rRNA που προστατεύονται από τον IF-3 επικαλύπτονται με εκείνες που προστατεύονται από την πρόσδεση της υπομονάδας 50S Η παρουσία του IF-3 αποτρέπει τη σύνδεση των δύο υπομονάδων του ριβοσώματος

Μετάφραση - Έναρξη Το N-φορμυλο-μεθειονυλο-tRNA (fMet-tRNAf) έναρξης δημιουργείται με φορμυλίωση του μεθειονυλο-tRNA, χρησιμοποιώντας ως συν-παράγοντα το φορμυλο-τετραϋδροφολικό οξύ

Μετάφραση - Έναρξη Το fMet-tRNAf έχει μοναδικά χαρακτηριστικά, τα οποία το διακρίνουν ως το εναρκτήριο tRNA Η φορμυλίωση, αν και όχι απολύτως απαραίτητη, βελτιώνει την αποτελεσματικότητα αναγνώρισης του fMet-tRNAf από τον παράγοντα IF-2 Οι αζευγάρωτες βάσεις CA είναι προϋπόθεση για τη φορμυλίωση Μεταλλάξεις που δημιουργούν ζεύγος βάσεων στη θέση αυτή του tRNAfMet του επιτρέπουν να χρησιμοποιηθεί κατά την επιμήκυνση

Μετάφραση - Έναρξη Στα βακτήρια και τα μιτοχόνδρια η φορμυλομάδα της ΜΕΤ έναρξης αφαιρείται από ειδικό ένζυμο (αποφορμυλάση), ώστε να δημιουργηθεί ένα κανονικό Ν-τελικό άκρο Στις μισές περίπου πρωτεΐνες, η Ν-τελική ΜΕΤ αφαιρείται από μια αμινοπεπτιδάση, δημιουργώντας ένα νέο Ν-τελικό άκρο

Η χρήση του fMet-tRNAf ελέγχεται από τον IF-2 και το ριβόσωμα Μετάφραση - Έναρξη Η χρήση του fMet-tRNAf ελέγχεται από τον IF-2 και το ριβόσωμα

Μετάφραση - Έναρξη Το fMet-tRNAf μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά για την έναρξη από τις υπομονάδες 30S Τα άλλα αμινοακυλo-tRNA (αα-tRNA) μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατά την επιμήκυνση από τα ριβοσώματα 70S

Η έναρξη της μετάφρασης στην E. coli

Μετάφραση - Έναρξη Οι θέσεις πρόσδεσης του ριβοσώματος στο mRNA μπορούν να απομονωθούν από σύμπλοκα έναρξης Οι θέσεις πρόσδεσης περιλαμβάνουν μια ανοδική αλληλουχία Shine-Dalgarno και ένα κωδικόνιο έναρξης

Η θέση πρόσδεσης του ριβοσώματος στη βακτηριακή μετάφραση

Μετάφραση - Έναρξη Η έναρξη πραγματοποιείται ανεξάρτητα σε κάθε κιστρόνιο ενός πολυκιστρονικού mRNA Όταν η διακιστρονική περιοχή είναι μακρύτερη από το εύρος του ριβοσώματος, η αποσύνδεση κατά τον τερματισμό ακολουθείται από ανεξάρτητη επανέναρξη στο επόμενο κιστρόνιο

Μετάφραση Κλινικές Προεκτάσεις Μετάφραση Κλινικές Προεκτάσεις

Κλινικό Παράδειγμα Ι Αντιβιοτικά Κλινικό Παράδειγμα Ι Αντιβιοτικά

Η πουρομυκίνη μιμείται το αμινοακυλο-tRNA, επειδή μοιάζει με ένα αρωματικό αμινοξύ συνδεδεμένο σε μια ένωση σακχάρου-βάσης

Η πουρομυκίνη αναστέλλει την πρωτεϊνοσύνθεση Όταν ο EF-Tu είναι προσδεδεμένος στην πουρομυκίνη, παραμένει ικανός να προσδέσει αμινοακυλο-tRNA στη θέση Α Το σύμπλοκο EF-Tu•GDP δεν μπορεί να αποδεσμευτεί από το ριβόσωμα Ακινητοποίηση ριβοσώματος συνεπάγεται διακοπή πρωτεϊνοσύνθεσης

Κλινικό Παράδειγμα Ι Αντιβιοτικά Αντιβιοτικά που στοχεύουν το ριβόσωμα Κλινικό Παράδειγμα Ι Αντιβιοτικά Αντιβιοτικά που στοχεύουν το ριβόσωμα

Πρωτεϊνική σύνθεση: Μετάφραση και Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις Μιχάλης Β. Καραμούζης MD, PhD Παθολόγος Ογκολόγος Επίκουρος Καθηγητής Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών Devlin – Κεφάλαιο 6 Lehninger – Κεφάλαιο 27 Παραδόσεις Αμφιθεάτρου Μάρτιος 2016

Μετάφραση σε ευκαρυωτικά κύτταρα

Μετάφραση Ευκαρυωτικό mRNA Προκαρυωτικό mRNA Μονοκιστρονικό (κωδικοποιεί μονήρες πολυπεπτίδιο) Το 5’ άκρο έχει καλύπτρα Εναρκτήριο σήμα: AUG Προκαρυωτικό mRNA Πολυκιστρονικό Το 5’ άκρο δεν έχει καλύπτρα Περισσότερα από ένα κωδικόνια έναρξης AUG

Μετάφραση - Ριβοσώματα Τα ριβοσώματα είναι μεγάλα ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωμάτια που περιέχουν περισσότερο RNA από πρωτεΐνη και αποσυνδέονται σε μεγάλες και μικρές υπομονάδες

Διαφορές στην έναρξη ανάμεσα σε προ- και ευ-καρυώτες Εναρκτήριο σύμπλοκο Ευκαρυώτες: αναγνώριση καλύπτρας Προκαρυώτες: απευθείας πρόσδεση στη θέση έναρξης Πολλοί παράγοντες έναρξης στους ευκαρυώτες Προκαρυώτες – χρησιμοποιούν ζευγάρωμα βάσεων RNA-RNA για την τοποθέτηση του mRNA

Η μικρή υπομονάδα των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων μεταναστεύει από το 5΄ άκρο του mRNA στη θέση πρόσδεσης του ριβοσώματος, η οποία περιλαμβάνει ένα κωδικόνιο έναρξης AUG

Έναρξη στους προκαρυώτες Μετάφραση Έναρξη στους προκαρυώτες Οι παράγοντες έναρξης σταθεροποιούν τις ελεύθερες υπομονάδες 30S και προσδένουν το εναρκτήριο tRNA στο σύμπλοκο 30S-mRNA

Έναρξη της μετάφρασης στους ευκαρυώτες Το Met-tRNAi είναι διαφορετικό από το Met-tRNAm, αλλά η Μet δεν είναι φορμυλιωμένη Είναι φωσφορυλιωμένο στη 2' θέση της ριβόζης στη βάση 64 Αν εμποδιστεί η τροποποίηση το Met-tRNAi μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην επιμήκυνση

Έναρξη της μετάφρασης στους ευκαρυώτες

Επιμήκυνση στους προκαρυώτες

Επιμήκυνση στους προκαρυώτες Ο EF-Tu-GTP τοποθετεί το αμινοακυλο-tRNA στο ριβόσωμα και στη συνέχεια αποδεσμεύεται ως EF-Tu-GDP Ο EF-Ts απαιτείται για την αντικατάσταση του GDP από το GTP. Η αντίδραση καταναλώνει GTP και απελευθερώνει GDP Το μόνο αμινοακυλο-tRNA που δεν μπορεί να αναγνωριστεί από τον EF-Tu-GTP είναι το fMet-tRNAf και έτσι αποτρέπεται η ενσωμάτωσή του σε εσωτερικά κωδικόνια AUG ή GUG

Επιμήκυνση στους προκαρυώτες Η μετατόπιση απαιτεί GTP καθώς και ένα παράγοντα επιμήκυνσης, τον EF-G Ο EF-G προσδένεται στο ριβόσωμα για να προάγει τη μετατόπιση και αποδεσμεύεται μετά την κίνηση του ριβοσώματος Το φουσιδικό οξύ σταθεροποιεί το σύμπλοκο ριβόσωμα-EFG•GDP και έτσι ο EF-G και το GDP παραμένουν στο ριβόσωμα αντί να αποδεσμευτούν Η πρόσδεση των παραγόντων EF-Tu και EF-G γίνεται εναλλάξ, καθώς τα ριβοσώματα δέχονται καινούρια αμινοακυλο-tRNA, σχηματίζουν πεπτιδικούς δεσμούς και μετατοπίζονται

Επιμήκυνση στους προκαρυώτες Η δομή του τριμερούς συμπλόκου αμινοακυλο-tRNA•EF-Tu•GTP (αριστερά) μοιάζει με τη δομή του EF-G (δεξιά) Οι δομικά συντηρημένες επικράτειες του EF-Tu και του EF-G επισημαίνονται με κόκκινο και πράσινο, ενώ το tRNA και η επικράτεια του EF-G, που μοιάζει με αυτό, επισημαίνονται με μοβ

Επιμήκυνση στους ευκαρυώτες

Επιμήκυνση στους ευκαρυώτες

Επιμήκυνση στους ευκαρυώτες

Τρία κωδικόνια τερματίζουν την πρωτεϊνοσύνθεση Μετάφραση - Τερματισμός Τρία κωδικόνια τερματίζουν την πρωτεϊνοσύνθεση Ιστορία ανακάλυψης ανερμηνεύσιμων σημειακών μεταλλάξεων: UAG: amber (Harris Bernstein) UAA: ochre (Sydney Brenner) UGA: opal Συχνότητα χρήσης: UAA>UGA>UAG

Μετάφραση - Τερματισμός Τα κωδικόνια τερματισμού αναγνωρίζονται από πρωτεϊνικούς παράγοντες αποδέσμευσης και όχι από αμινοακυλο-tRNA Ο RF-1 αναγνωρίζει τα UAA και UAG O RF-2 αναγνωρίζει τα UGA και UAA O RF-3 θεωρείται ότι απελευθερώνει τη ριβοσωματική υπομονάδα Στους ευκαρυώτες υπάρχει μόνο ένας παράγοντας αποδέσμευσης, ο eRF

Μετάφραση - Τερματισμός Η μοριακή μίμηση καθιστά δυνατή την πρόσδεση του συμπλόκου EF-Tu•tRNA, του παράγοντα μετατόπισης EF-G και των παραγόντων αποδέσμευσης RF1/2-RF3 στην ίδια ριβοσωμική θέση

Μετάφραση - Τερματισμός Η δομή του παράγοντα τερματισμού των ευκαρυωτών eRF1 μιμείται τη δομή του tRNA. Το μοτίβο GGQ στην κορυφή της επικράτειας 2 είναι απαραίτητο για την υδρόλυση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας από το tRNA GGQ eRF1 tRNA

Μετάφραση Τερματισμός Ο εστερικός δεσμός μεταξύ πεπτιδίου και tRNA διασπάται από την πεπτιδυλομεταφοράση που πλέον δρα σαν υδρολάση

Μετάφραση - Ριβοσώματα Πηγή ριβοσώματος Μέγεθος μονομερούς Υπομονάδες Μικρή Μεγάλη Ευκαρυώτες Κυτταροδιάλυμα 80S 40S: 60S: 34 πρωτεϊνες 50 πρωτεϊνες 18S RNA 28S, 5.8S, 5S RNA Μιτοχόνδρια Ζωϊκοί οργανισμοί 55S-60S 30S-35S: 40S-45S: 12S RNA 16S RNA 70-100 πρωτεϊνες Ανώτερα φυτά 77S-80S 19S RNA 25S, 5S RNA 70-75 πρωτεϊνες Χλωροπλάστες 70S 30S: 50S: 16S RNA 23S, 5S, 4.5S RNA 20-24 πρωτεϊνες 34-38 πρωτεϊνες Προκαρυώτες E. Coli 21 πρωτεϊνες 34 πρωτεϊνες 16S RNA 23S, 5S RNA

Μιτοχόνδρια Εναρκτήριο tRNA παρόμοιο με αυτό των Διαφορετικά ριβοσώματα Εναρκτήριο tRNA παρόμοιο με αυτό των προκαρυωτικών κυττάρων Οι περισσότερες πρωτεϊνες κωδικοποιούνται στον πυρήνα, παράγονται στο κυτταρόπλασμα και εισέρχονται στο οργανίδιο

Μετάφραση - Σύνοψη

Κλινικό Παράδειγμα ΙΙ HIV

Κλινικό Παράδειγμα ΙΙ HIV