ΑΝΑΖΗΤΗΣΗ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ ΑΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ (ΧΡΩΣΗ Gram) ΕΜΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ (ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ) Γ. Καπαρός Επίκουρος Καθ. Μικροβιολογίας Υπεύθυνος Εργαστηρίου Μοριακής Διάγνωσης Αρεταίειο Νοσοκομείο

Η διάγνωση μιας λοίμωξης επιτυγχάνεται μόνον με τους εξής 3 τρόπους: Με την απομόνωση του παθογόνου μικροβίου από τον οργανισμό του ασθενούς: άμεση ανίχνευση των μικροβιακών κυττάρων σε κλινικό υλικό ανίχνευση αντιγόνων ή γενετικού υλικού του μικροβίου καλλιέργεια (επαγωγή) του μικροβιακού παράγοντα σε τεχνητά θρεπτικά υλικά ή πειραματόζωα

Με την απομόνωση σε κλινικό υλικό από τον οργανισμό του ασθενούς ειδικών μεταβολικών προϊόντων του μικροβίου που παράγονται, μόνον εφόσον ο μικροοργανισμός είναι παρών στον οργανισμό του ασθενούς και πολλαπλασιάζεται

κυρίως ενδιαφέρουν και προσδιορίζονται τα ΕΙΔΙΚΑ Αbs IgM και IgG Με την ανίχνευση στον ορό του αίματος του ασθενούς προϊόντων ειδικής ανοσολογικής ανταπόκρισης έναντι του παθογόνου μικροβίου (ΕΜΜΕΣΗ ή ΟΡΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ) για πρακτικούς λόγος ενδιαφέρουν κυρίως τα προϊόντα της χυμικής ανοσίας, δηλ. τα Αbs σε ξενιστή με φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα, σχεδόν κάθε λοίμωξη οδηγεί σε παραγωγή ΕΙΔΙΚΩΝ Abs έναντι συγκεκριμένων Ags του μικροβιακού αιτίου κυρίως ενδιαφέρουν και προσδιορίζονται τα ΕΙΔΙΚΑ Αbs IgM και IgG η ορολογική διάγνωση προσφέρει τα μέγιστα: στη διάγνωση μιας πρόσφατης λοίμωξης στη διάγνωση λοιμώξεων στις οποίες η απομόνωση του αιτιολογικού παράγοντα είναι δύσκολη ή πρακτικά αδύνατη (π.χ. ιοί, παράσιτα) στην παρακολούθηση της ανοσολογικής απόκρισης σε περίπτωση εμβολιασμού στην παρακολούθηση του θεραπευτικού αποτελέσματος

ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ανοσοδοκιμασία (Immunoassay) ονομάζεται κάθε δοκιμασία (test) που χρησιμοποιεί την σύνδεση αντιγόνου – αντισώματος ως μέσο για την παραγωγή μετρήσιμου αποτελέσματος. Οι ανοσοδοκιμασίες διαφέρουν από άλλα tests που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο (π.χ. Χρωματομετρικά tests όπως αυτό για τη μέτρηση του σακχάρου) καθώς βασίζονται στη δημιουργία συμπλόκων αντιγόνου – αντισώματος και όχι στην χημική μετατροπή των προς μέτρηση ουσιών

Ανοσογόνα - Αντιγόνα - Αντισώματα - Αναλύτες Ανοσογόνα: ουσίες που μπορούν να προκαλέσουν παραγωγή αντισωμάτων. Επαγωγή δηλαδή ανοσολογικής απάντησης. Αντιγόνα: ουσίες που συνδέονται ειδικά με ένα μόριο αντισώματος Κάθε ανοσογόνο είναι αντιγόνο αλλά κάθε αντιγόνο δεν είναι ανοσογόνο Για λόγους απλότητος ανοσογόνα και αντιγόνα αναφέρονται συχνά ως αντιγόνα

Φύση αντιγόνων και ανοσογόνων Αντιγόνα μπορούν να είναι όλα τα βιολογικά μίκρο ή μάκρο μόρια Πρωτεΐνες Γλυκοπρωτεΐνες Λιπίδια Νουκλεϊκά οξέα Υδατάνθρακες Πολυσακχαρίτες Μέταλλα Οργανικές ενώσεις Μόνο τα μακρομόρια μπορούν να επάγουν ανοσολογική απάντηση (ανοσογόνα)

Φύση αντιγόνων και ανοσογόνων Αντίσωμα: Πρωτείνη η οποία παράγεται από τον οργανισμό ως απάντηση σε μια «εισβάλουσα» ξένη ουσία με σκοπό την αυτοπροστασία του και αποτελεί προϊόν της ανοσολογικής του απάντησης. Αναλύτης: Κάθε ουσία που μπορεί να μετρηθεί με ένα εργαστηριακό test. Στις ανοσοδοκιμασίες μπορεί να είναι αντιγόνο ή αντίσωμα. Αντιγονικός επίτοπος: Μικρή περιοχή του αντιγόνου που αναγνωρίζεται από αντίσωμα. Ένα αντιγόνο μπορεί να έχει πολλούς διαφορετικού ή επαναλαμβανόμενους επιτόπους.

Αλληλεπίδραση αντιγόνου - αντισώματος Εξαρτάται από 4 τύπους μη ομοιοπολικών δεσμών δεσμούς υδρογόνου ιοντικούς δεσμούς υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις αλληλεπιδράσεις van der Waals Σε υδατικό περιβάλλον οι μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις είναι εξαιρετικά ασθενείς και η ισχύς τους (affinity) εξαρτάται από τη συμπληρωματικότητα των σχημάτων του αντισώματος και του αντιγόνου. Ag + Ab Ag - Ab k1 k2

Affinity (Συγγένεια) Ενός αντισώματος ονομάζεται η συνδυασμένη ένταση μεταξύ ενός επιτόπου του αντιγόνου και μιας θέσης δέσμευσης του αντισώματος

Παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων Η διαδικασία παραγωγής αντισωμάτων ξεκινά όταν σε ένα ποντίκι ενίεται συγκεκριμένο αντιγόνο για την επαγωγή ειδικών αντισωμάτων. Στην περίπτωση που το αντιγόνο χαρακτηρίζεται από πολλούς διαφορετικούς επιτόπους και έχουμε επιτυχή ανοσοποίηση ο ορός από το αίμα του ποντικιού που ονομάζεται αντιορός θα περιέχει ένα μίγμα αντισωμάτων τα οποία αναγνωρίζουν και συνδέονται με το αντιγόνο αλλά το κάθε ένα σε διαφορετικό επίτοπο: πολυκλωνικά αντισώματα

Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων Τα μονοκλωνικά αντισώματα διαφέρουν από τα πολυκλωνικά στο γεγονός ότι είναι παντελώς ειδικά για συγκεκριμένο επίτοπο του πολυδύναμου αντιγόνου καθώς παράγονται από μια κυτταρική σειρά με τεχνολογία: hybridoma technology και “mouse myeloma cell lines”. Μεγάλο πλεονέκτημα των μονοκλωνικών αντισωμάτων είναι ότι οι τελικές κυτταροκαλλιέργειες που τα παράγουν είναι θεωρητικά «αθάνατες»

ΕΠΙΛΟΓΗ ΥΒΡΙΔΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ The “Hat Trick” Τα κύτταρα μυελώματος με γενετική τροποποίηση δεν παράγουν το ένζυμο HGPRT, το οποίο είναι απαραίτητο για την επιβίωση τους (σύνθεση DNA) όταν καλλιεργηθούν στο μέσο HAT medium (Hypoxanthine – Aminopterin – Thymidine) Μόνο τα κύτταρα που έχουν συντηχθεί με τα κύτταρα σπληνός θα επιβιώσουν και θα πολλαπλασιαστούν

Μέθοδοι ανίχνευσης συμπλέγματος Ag - Ab Αμεση βακτηριακή συγκολλητινοαντίδραση Συγκολλητινοαντίδραση Latex Αναστολή αιμοσυγκόλλησης Μέθοδος εξουδετέρωσης Ανοσοφθορισμός Elisa Κυτταρομετρία ροής Xmap Technology Incell DX

Άμεση βακτηριακή συγκολλητινοαντίδραση Ανίχνευση αντιγόνου το οποίο κατά κανόνα είναι μη διαλυτό (ολόκλητο μικροβιακό κύτταρο) με χρήση διαλυτών αντισωμάτων τα οποία τελικά συγκολλούν τα κύτταρα σε σωρούς Κυρίως για οροτύπηση μικροβίων μετά από καλλιέργεια (salmonella spp)

Συγκολλητινοαντίδραση Latex Συγκολλητινοαντίδραση Latex. Σύνδεση Abs – Ags ένα εκ των οποίων έχει συνδεθεί τεχνητά στην επιφάνεια σωματιδίων latex: συγκόλληση σε μικροσκοπικά ορατές σώρούς π.χ. ανίχνευση β-αιμολυτικού στρεπτοκόκκου ομάδος Α σε 10 min π.χ. αντισωμάτων έναντι CMV, RUB, T gondii, Μυκοπλασμάτων, ASTO κ.λ.π. Π

Αναστολή της αιμοσυγκόλλησης *Αναστολή αιμοσυγκόλλησης για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι ιού. Αυτοί οι ιοί φυσιολογικά προκαλούν αιμοσυγκόλληση, όταν αναμιχθούν με ερυθρά αιμοσφαίρια. Αν υπάρχουν αντισώματα έναντι του ιού, όπως φαίνεται εδώ, τον εξουδετερώνουν και αναστέλλουν την αιμοσυγκόλληση. Παρατήρηση: οι διάφοροι ιοί συγκολλούν ερυθρά διαφορετικών ειδών, π.χ. ο ιός της ερυθράς συγκολλά ανθρώπινα ερυθρά ομάδας Ο, ερυθρά χήνας και ερυθρά κότας.

Tests Εξουδετέρωσης Neutralization assays Αρχή: Αντισώματα στον ορό εξουδετερώνουν αντιγόνα στην επιφάνεια των ιών (neutralization antibdies) Συνεπώς ο ιός αδυνατεί να μολύνει κυτταρικές σειρές Οι δοκιμασίες αυτές θεωρούνται ως gold standard είναι εξαιρετικά απαιτητικές – χρονοβόρες (1 εβδομάδα) – κοστοβόρες και αφορούν μελέτη ιών που μπορεί να καλλιεργηθούν στο εργαστήριο Χρησιμοποιούνται για τον σχεδιασμό εμβολίων (επιλογή αντιγόνου  παραγωγή αντισωμάτων  έλεγχος των αντισωμάτων ως πρός την ικανότητα τους να εξουδετερώνουν τον ιό)

Μέθοδος Ανοσοφθορισμού Οι τεχνικές ανοσοφθορισμού χρησιμοποιούνται για την: Ανίχνευση μικροοργανισμών σε κλινικά δείγματα (άμεσος ανοσοφθορισμός ) Ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων στον υπό εξέταση ορό (έμμεσος ανοσοφθορισμός). Στις τεχνικές αυτές γίνεται σύζευξη φθοριζουσών χρωστικών όπως η ισοθειοκυανική φθοριοσεϊνη με αντισώματα που φθορίζουν όταν εκτεθούν στο υπεριώδες φως. Μέθοδοι με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα

Άμεσος ανοσοφθορισμός ανίχνευση αντιγόνου Το δείγμα που έχει το προς ταυτοποίηση αντιγόνο μονιμοποιείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Στη συνέχεια προστίθενται αντισώματα σημασμένα με φθοριοσεΐνη – επώαση – απομάκρυνση περίσσειας αντισώματος Μέλέτη στο μικροσκόπιο. (Ανίχνευση χλαμυδίων σε ενδοτραχηλικό υγρό)

ΕΜΜΕΣΟΣ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ – ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ: * Γνωστό αντιγόνο μονιμοποιείται σε πλάκα * Προσθήκη του υπό εξέταση ορού *Εάν υπάρχει ειδικό αντίσωμα έναντι του μικροβίου σχηματίζεται σύμπλεγμα *Για να γίνει ορατό το σύμπλεγμα αντιγόνου – αντισώματος προστίθεται στην πλάκα αντιανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη σημασμένη με φθοριοσεΐνη. * ΕΛΕΓΧΟΣ ΣΤΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Η αντιανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη είναι αντίσωμα που αντιδρά με κάθε ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη

Μέθοδος Elisa Elisa: Enzyme – Linked Immunosorbent assay Η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη ανοσοενζυμική δοκιμασία Αμεση Elisa: Προσδιορισμός αντιγόνων (φάρμακα, βhCG, HbsAg) Εμμεση Elisa: Προσδιορισμός αντισωμάτων (anti-HIV, anti HbS, anti-HCV, Rub IgG, Toxo IgG) Η Elisa με τη μεγαλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα είναι η τύπου Sandwich Το αντίσωμα που χρησιμοποιείται έναντι του αντιγόνου (στην άμμεση elisa) ή έναντι του αντισώματος στην έμμεση elisa (αντιανθρώπειος ανοσοσφαιρίνη) είναι σημασμένο με ένζυμο (συνήθως βιοτίνη) το οποίο κατά την ένωση του με μόριο streptavidin HRP και παρουσία TMBH2O2 δίδει έγχρωμο προϊόν που μετράται σε φωτόμετρο. Με χρήση πρότυπης καμπύλης υπάρχει δυνατότητα όχι μόνο ποιοτικής μέτρησης αλλά και ποσοτικής.

Βιοτίνη + Στρεπταβιδίνη HRP TMB + H2O2

This standard curve is used to determine the unknown concentration of each sample by finding the opposite concentration to the absorbance Absorption nm Concentration ng/ml

ELISA Kit Results Clear Determination Of Positive And Negative Results