Ασκήσεις Ανοσολογίας Π.Παπαζαφείρη Α. Μαρμάρη Αντιδράσεις αντιγόνου αντισώματος σε ημιδιαπερατά μέσα Αντιδράσεις κατακρήμνισης Ανοσοδιάχυση ( άσκηση 5.

Παρουσίαση με θέμα: "Ασκήσεις Ανοσολογίας Π.Παπαζαφείρη Α. Μαρμάρη Αντιδράσεις αντιγόνου αντισώματος σε ημιδιαπερατά μέσα Αντιδράσεις κατακρήμνισης Ανοσοδιάχυση ( άσκηση 5."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Ασκήσεις Ανοσολογίας Π.Παπαζαφείρη Α. Μαρμάρη Αντιδράσεις αντιγόνου αντισώματος σε ημιδιαπερατά μέσα Αντιδράσεις κατακρήμνισης Ανοσοδιάχυση ( άσκηση 5 ) Μονή ακτινωτή ανοσοδιάχυση, Mancini Διπλή ανοσοδιάχυση, Ouchterloni Ανοσοηλεκτροφόρηση ( άσκηση 6 ) Ag: ορός ανθρώπου Ab: αντι-ορός (έναντι ορού ανθρώπου) Ab: (ηλεκτροφόρηση): αντι IgX

2 Ζώνη ισοδυναμίας: σχηματισμός ιζήματος In vitro

3 Ζώνη ισοδυναμίας: σχηματισμός ιζήματος

4 Τύποι αντιδράσεων κατακρήμνισης σε υγρό μέσο σε πήκτωμα – απλή ανοσοδιάχυση προς μια κατεύθυνση – διπλή ανοσοδιάχυση προς μια κατεύθυνση – διπλή ανοσοδιάχυση προς δύο κατευθύνσεις (Ouchterlony) – κυκλοτερής ή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (Mancini) – ανοσοηλεκτροφόρηση – rocket ηλεκτροφόρηση – ανοσοκαθήλωση

5 Ζώνη ισοδυναμίας: σχηματισμός ιζήματος

6 Ανοσοδιάχυση, πλεονεκτήματα Μπορεί να ανιχνευθεί ένα πολυδύναμο σύστημα αντιγόνων- αντισωμάτων πολύ εύκολα. Αν για παράδειγμα, ανοσοποιηθεί ένα κουνέλι με ορό ανθρώπου, κάθε συστατικό του ορού του ανθρώπου (όπως πχ αλβουμίνη, IgG, τρανσφερίνη, κλπ) θα οδηγήσει στο σχηματισμό αντισωμάτων ειδικών για αυτό. ΄Οταν τοποθετηθεί ο αντιορός του κουνελιού σε ένα φρεάτιο και ο ορός του ανθρώπου σε ένα άλλο φρεάτιο, θα δημιουργηθούν αρκετές ευδιάκριτες γραμμές ιζήματος ανάμεσα στα δύο φρεάτια και κάθε γραμμή θα αντιπροσωπεύει ένα διαφορετικό σύστημα συμπλόκων αντιγόνου-αντισώματος: αλβουμίνης-αντι- αλβουμίνης, IgG-αντι-IgG, τρανσφερίνης-αντι-τρανσφερίνης, κλπ. Εύκολη και οικονομική μεθοδολογία

7 Αντίδραση ταυτότητας Αντίδραση μη ταυτότητας Αντίδραση μερικής ταυτότητας Καθορισμός ταυτότητας με τη μέθοδο της διπλής ανοσοδιάχυσης

8 Διπλή ανοσοδιάχυση Ouchterloni

9 Πειραματική διαδικασία Διπλή ανοσοδιάχυση (Ouchterlony) Σε προκαλυμμένες αντικειμενοφόρους πλάκες προσθέτουμε 5 ml πυκνού άγαρ το οποίο δεν περιέχει αντιορό. θέσηΑραίωση Αb A11:1(v/v) A21:20 A31:40 Α41:80 Α51:160 A6A61:320 Ag 1 2 6 35 4 1 2 6 35 4 AB Παρατηρούμε και καταγράφουμε τα πρότυπα ανοσοκατακρήμνισης. Σημειώνουμε τη μεγαλύτερη αραίωση αντισώματος που μπορεί να σχηματίσει ίζημα με το αντιγόνο. Στο κέντρο του πηκτώματος

10 Πειραματική διαδικασία Μονή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (Μέθοδος Mancini) Σε 5ml πυκνού διαλύματος άγαρ (2% w/v), το οποίο διατηρείται σε θερμοκρασία 56°C, προσθέτονται 0,1 ml αντιορού και 0,9 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών. Μετά την στερεοποίηση του επιχρίσματος του αραιού άγαρ, προσθέτουμε το πυκνό άγαρ και το απλώνουμε προσεκτικά έτσι ώστε να δημιουργηθεί πήκτωμα σε όλη την επιφάνεια της πλάκας. Μετά την στερεοποίηση της πηκτής του άγαρ, ανοίγουμε 7 φρεάτια με τη βοήθεια πιπέττας Pasteur Η συγκέντρωση του αντιγόνου στο αρχικό διάλυμα (θέση 1) είναι 4.6 mg/ml 1 2 3 4 5 6 Θέση 7: αντιγόνο άγνωστης συγκέντρωσης Αραιώσεις ν/ν: 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Χ Δείγμα 10μl

11 Ακτινωτή ανοσοδιάχυση Mancini Η ακτινωτή ανοσοδιάχυση είναι ημι-ποσοτική μέθοδος. Κατά κανόνα το αντίσωμα διαλύεται (ομοιόμορφα) στο πήκτωμα πριν την προσθήκη του μίγματος των αντιγόνων

12 Πειραματική διαδικασία ανίχνευση των ιζημάτων ανοσοδιάχυσης Τοποθετούμε την αντικειμενοφόρο πλάκα σε δοχείο, με υγρασία, για 3-24 ώρες, μέχρις ότου εμφανιστούν οι γραμμές ιζήματος. Αφαιρούμε τις πρωτεΐνες που δεν έχουν δεσμευθεί με ανάδευση της πηκτής σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) για 12 ώρες με τρεις αλλαγές. Καλύπτουμε την πηκτή με υγρό διηθητικό χαρτί, και την τοποθετούμε σε κλίβανο, στους 100°C για 30 λεπτά, έτσι ώστε να γίνει αφυδάτωση και διαφανοποίησή της. Χρωματίζουμε με χρωστική Coomassie brilliant blue για 10 - 20 λεπτά, έως ότου γίνουν ορατοί οι δακτύλιοι ιζήματος. Αποχρωματίζουμε με ανάδευση σε διάλυμα αποχρωματισμού με τρεις αλλαγές. Με τη βοήθεια ενός χάρακα μετράμε τη διάμετρο όλων των δακτυλίων.

13 Πειραματική διαδικασία Ανοσοηλεκτροφόρηση Η ανοσοηλεκτροφόρηση έχει μεγάλη διαχωριστική ικανότητα, αφού συνδυάζει τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό διαφόρων αντιγόνων και τη δημιουργία συμπλόκων των διαφορετικών αυτών αντιγόνων με τις ανοσοσφαιρίνες που έχουν παραχθεί σε ένα αντιορό

14 Ανοσοηλεκτροφόρηση Το μίγμα αντιγόνων ηλεκτροφορείται πρώτα για να διαχωριστούν τα συστατικά του Χρησιμοποιείται σε κλινικά εργαστήρια για την διαπίστωση έλλειψης ή υπερ-παραγωγής ισοτύπων ή παρουσίας «ξένων» πρωτεϊνικών συστατικών

15 Πειραματική διαδικασία Ανοσοηλεκτροφόρηση Μετά την στερεοποίηση της πηκτής του άγαρ, ανοίγουμε δύο φρεάτια Προσθέτουμε σε κάθε φρεάτιο 10μl μίγματος αντιγόνων Τοποθετούμε τις αντικειμενοφόρους πλάκες στη συσκευή ηλεκτροφόρησης, έτσι ώστε τα δείγματα που θα ηλεκτροφορηθούν να βρίσκονται προς την κάθοδο. Σχηματίζουμε γέφυρες τοποθετώντας διηθητικά χαρτιά που έχουν διαβραχεί στο ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης Φρεάτια τοποθέτησης αντιγόνων Αυλάκι τοποθέτησης αντιορού AgAb

16 Πειραματική διαδικασία Ανοσοηλεκτροφόρηση Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης ανοίγουμε με νυστέρι ένα αυλάκι και αφαιρούμε το πήκτωμα με τη βοήθεια μιας βελόνας. Γεμίζουμε το αυλάκι με τον αντιορό και γρήγορα τοποθετούμε την πηκτή σε δοχείο με αρκετή υγρασία, στους 4°C για 24 ώρες, μέχρις ότου σχηματιστεί το πρότυπο της ανοσοκατακρήμνισης. Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Αποτυπώνουμε και ταυτοποιούμε τα πρότυπα των ιζημάτων. Επιχειρούμε μια συγκριτική αξιολόγηση των δύο μεθόδων (ανοσοδιάχυση, ανοσοηλεκτροφόρηση)

17 Ανοσοηλεκτροφόρηση Σημειώστε τη «σχετική» θέση κάθε ανοσοσφαιρίνης

18 Ανοσοκαθήλωση Πρότυπα ηλεκτροφόρησης πρωτε ϊνών ορού σε ταινίες κυτταρίνης Από Άσκηση 11 Φυσιολογία Ζώων

19 Ανοσοκαθήλωση

20 Ανοσοκαθήλωση ορού ασθενούς με μυέλωμα τύπου IgM λ

21 Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Mancini: Με βάση τις συγκεντρώσεις του προτύπου αντιγόνου και τις τιμές της διαμέτρου των αντίστοιχων δακτυλίων κατασκευάζουμε πρότυπη καμπύλη. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια της πρότυπης καμπύλης και με βάση τη διάμετρο του δακτυλίου, μπορούμε να προσδιορίσουμε τη συγκέντρωση του άγνωστου αντιγόνου. Ouchterloni: Παρατηρούμε και καταγράφουμε τα πρότυπα ανοσοκατακρήμνισης.Σημειώνουμε τη μεγαλύτερη αραίωση αντισώματος που μπορεί να σχηματίσει ίζημα με το αντιγόνο. Επιχειρούμε μια συγκριτική αξιολόγηση των δύο μεθόδων (ανοσοδιάχυση, ανοσοηλεκτροφόρηση) Ηλεκτροφόρηση: ταυτοποίηση του αντισώματος που χρησιμοποιήθηκε ανάλογα με το πρότυπο των ιζημάτων