ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Δρ. Αγγελική Γεροβασίλη

In vitro καλλιέργεια κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες (διατήρηση ή πολλαπλασιασμός) κυττάρων, ιστών ή οργάνων. Τύποι κυτταροκαλλιεργειών: Καλλιέργειες οργάνων Καλλιέργειες ιστών Καλλιέργειες κυττάρων Τι είναι οι κυτταροκαλλιέργειες;

Έρευνα 1.Για να μελετήσουμε την συμπεριφορά των κυττάρων 2. Για να περιορίσουμε την χρήση πειραματόζωων 3.Μελέτη μεταλλαγμένων πρωτεϊνών (απουσία) σε σύγκριση με φυσιολογικές για κατανόηση της λειτουργίας τους Παραγωγή φαρμακευτικών ουσιών. Παραγωγή ορμονών, ενζύμων, εμβολίων και άλλων ουσιών με θεραπευτική δράση. Γιατί χρειαζόμαστε τις κυτταροκαλλιέργειες;

Ιστοκαλλιέργειες: Ιn Vitro διατήρηση ή ανάπτυξη κυττάρων ιστών ή οργάνων για περισσότερες από 24 ώρες Οργανοκαλλιέργειες: Διατήρηση διαφοροποίησης ή δομής ή λειτουργίας Κύτταροκαλλιέργειες: Τα κύτταρα δεν διατηρούν την χαρακτηριστική οργάνωση του ιστού από όπου προέρχονται Κυτταροκαλλιέργειες

ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Τα θρεπτικά υλικά διακρίνονται σε –Υγρά Περιέχουν θρεπτικές ουσίες για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών (κυρίως πηγές άνθρακα όπως είναι η γλυκόζη ή λακτόζη), αμινοξέα, ΑΤΡ. Το pH των θρεπτικών υλικών σταθεροποιείται σε συγκεκριμένη τιμή και αντιβιοτικά (για την αποφυγή επώασης ανεπιθύμητων μικροοργανισμών) –Στερεά Ακριβώς όπως τα υγρά με τη διαφορά ότι στο θρεπτικό υλικό προστίθεται ο πολυσαγχαρίτης άγαρ που στερεοποιείται σε θερμοκρασίες κάτω από 45 ο C.

ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Η κυτταροκαλλιέργεια ξεκινάει με τη διαδικασία του εμβολιασμού, κατά την οποία με ένα αποστειρωμένο στυλεό «βαπτίζουμε» την υγρή ή την στερεή καλλιέργειά μας. Ο στυλεός περιέχει ένα μικρό αριθμό μικροοργανισμών τα οποία θέλουμε να καλλιεργήσουμε (να πολλαπλασιάσουμε).

Κυτταροκαλλιέργειες

ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Η αποδιοργάνωση του ιστού γίνεται με πρωτεάσες, όπως η θρυψίνη (ένζυμο του παγκρέατος) που έχει καθιερωθεί και αποτελεί κλασσικό μέσο αποδιοργάνωσης των ιστών (καταστρέφει την εξωκυττάρια ύλη των κυττάρων). Τα κύτταρα αναπτύσσονται καλύτερα όταν προσκολλώνται σε επιφάνεια δοχείου καλλιέργειας (petri dish). Με την προσκόλληση (λόγω διάφορων κολλωδών πρωτεϊνών, όπως το κολλαγόνο) αρχίζει συνήθως και η επέκτασή τους. Τα επιθηλιακά κύτταρα σχηματίζουν ένα μονόστοιβο κυτταρικό στρώμα, οι ινοβλάστες (συνδετικός ιστός) σχηματίζουν δίστοιβο ή τρίστοιβο κυτταρικό στρώμα, ενώ τα καρκινικά σχηματίζουν ανώμαλες μάζες κυττάρων.

Αποδιοργάνωση του ιστού Ενζυμικός: Λύση μεσοκυττάριας ουσίας με πρωτεάσες Θρυψίνη (παγκρεατικό ένζυμο, κλασικό μέσο αποδιοργάνωσης των ιστών) Προνάση (αλκαλικές ουδέτερες πρωτεάσες) Κολλαγενάση (ήπια δράση, ευαίσθητα κύτταρα) Φυσικός Σε έντονα διαφοροποιημένους ιστούς μέσω υποδοχέων με χρήση αντιγόνων ή αντισωμάτων Διαχωρισμός λεμφοκυττάρων μέσω υποδοχέων μεμβράνης. Κυτταροκαλλιέργειες

Πρωτογενείς καλλιέργειες Δευτερογενείς καλλιέργειες Αθάνατες Καλλιέργειες Κυτταρικές σειρές Η καλλιέργεια που προέρχεται από ένα ιστό ή όργανο μετά από επεξεργασία με θρυψίνη Προέρχονται από καρκινικά κύτταρα που έχουν ληφθεί είτε από πάσχον οργανισμό είτε από καλλιεργούμενα κύτταρα που έχουν υποστεί κάποια αλλαγή και συμπεριφέρονται σαν καρκινικά (μετασχηματισμένα) Κυτταροκαλλιέργειες Όταν τα κύτταρα της πρωτογενούς καλλιέργειας μεταφερθούν και καλλιεργηθούν. Κύτταρα που είναι αθάνατα, δηλαδή είναι δυνατή η ανακαλλιέργειά τους για απεριόριστο αριθμό γενεών.

Μειονεκτήματα πρωτογενούς καλλιέργειας: Μόλυνση των κυττάρων από βακτήρια, ιούς (χρήση αντιβιοτικών) Τα κύτταρα αλλάζουν μορφολογία, μεταβολικές λειτουργίες, χάνουν τα αντιγόνα που χαρακτηρίζουν τον ιστό ή το όργανο Φαινόμενο μιξοπλοειδίας: Συνύπαρξη μέσα στον πληθυσμό κυττάρων με διαφορετικό αριθμό χρωμοσωμάτων Κυτταροκαλλιέργειες

Θρεπτικά υλικά καλλιεργειών Θρεπτικά συστατικά είναι τα Earle’s, Hank’s. Ισότονο διάλυμα ανόργανων αλάτων εξασφαλίζει ένα φυσιολογικό περιβάλλον στα κύτταρα διατηρώντας τις βασικές μεταβολικές λειτουργίες τους Υδατάνθρακες (πηγή άνθρακα) Κυτταροκαλλιέργειες

Δείκτης (ερυθρό της φαινόλης) Κυτταροκαλλιέργειες

Τα πιο γνωστά συνθετικά θρεπτικά υλικά είναι το ΒΜΕ, ΜΕΜ και το Μ199. Είναι τα Earle’s και Hank’s εμπλουτισμένα σε αμινοξέα, βιταμίνες και άλλα προϊόντα (αυξητικοί παράγοντες) Κυτταροκαλλιέργειες

Μονοκλωνικά Αντισώματα Β κύτταρο: παράγει 1 αντίσωμα, Αλλά δεν πολλαπλασιάζεται σε καλλιέργεια Σύντηξη Υβρίδωμα Πολλαπλασιάζεται απεριόριστα και παράγει μεγάλα ποσά ενός αντισώματος Καρκινικό κύτταρο από μυέλωμα : πολλαπλασιάζεται απεριόριστα, δεν παράγει αντισώματα

Μονοκλωνικά Αντισώματα

Εφαρμογές : Διαγνωστικά test για την ανίχνευση μικρών ποσοτήτων φαρμάκων, τοξινών ή ορμονών Test εγκυμοσύνης (γοναδοτροπίνη) Test AIDS με την χρήση Elisa Μονοκλωνικά αντισώματα για αντικαρκινική θεραπεία Μονοκλωνικά αντισώματα για την ταξινόμηση αντιγόνων ιστοσυμβατότητας Απομόνωση διαφόρων πρωτεϊνών Μονοκλωνικά Αντισώματα

Bακτηρίδιο που συμβιώνει στον εντερικό σωλήνα Αναπτύσσεται εύκολα σε απλά θρεπτικά μέσα Ταχύτατος ρυθμός πολλαπλασιασμού Απομόνωση γενετικά καθαρών πληθυσμών Escherichia Coli

Καλλιεργείται σε στερεά και υγρά θρεπτικά υλικά E.coli

Για να αναπτυχθεί η Ε.Coli θα πρέπει να υπάρχει: Πηγή ενέργειας, άνθρακας από οργανικές ενώσεις (γλυκόζη) Κατάλληλη συγκέντρωση οξυγόνου Θερμοκρασία pH E.coli

Θρεπτικό υλικό για τη καλλιέργεια Ε. Coli ένα διάλυμα φωσφορικών αλάτων γλυκόζη και λακτόζη, αμινοξέα, βάσεις πουρίνης πυριμιδίνης, ΑΤΡ. Ο χρόνος διπλασιασμού στους 37 o C είναι 20 min E.coli

ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Οι φάσεις μιας καλλιέργειας διακρίνονται σε –Λανθάνουσα φάση: Μια περίοδος όπου τα βακτήρια δε διαιρούνται και φαίνεται σαν να προσαρμόζονται στο νέο περιβάλλον τους. –Εκθετική ή λογαριθμική φάση: Πολλαπλασιασμός των κυττάρων. Σε αυτή τη φάση τα κύτταρα διαιρούνται σε κανονικά χρονικά διαστήματα, οι διαιρέσεις όμως δεν είναι όλες συγχρονισμένες. Έτσι σε κάθε στιγμή υπάρχουν μερικά κύτταρα που διαιρούνται γι’ αυτό και ο αριθμός και η μάζα τους αυξάνεται βαθμιαία και όχι σταδιακά. Η αύξηση δεν είναι απεριόριστη. –Φάση στασιμότητας: Όταν ο αριθμός των κυττάρων φθάσει στα 5Χ10 9 κύτταρα/ml και παρατηρείται μείωση του ρυθμού αύξησης. –Φάση θανάτου: Τα κύτταρα δεν μπορούν να αυξηθούν και αυτό συμβαίνει γιατί τα κύτταρα εξαντλούν τα ουσιώδη θρεπτικά συστατικά ή συσσωρεύονται τοξικά προϊόντα του μεταβολισμού.

Θρεπτικά Υλικά ανάλογα με τη σύνθεση Διαχωριστικά ή διαφοροποιητικά Θρεπτικά Υλικά –MacConkey –Εκλεκτικό και διαχωριστικό –Επιτρέπει ανάπτυξη Gram - βακτηρίων και αναστέλλει τα Gram + βακτήρια επειδή περιέχει χολικά άλατα. –Περιέχει το σάκχαρο λακτόζη που διασπάται από ορισμένα Gram - βακτήρια και ένα δείκτη του pH (ουδέτερο ερυθρό) –Έτσι θα αναπτύσσονται μόνο τα Gram - βακτήρια (εκλεκτικό) και αυτά που διασπούν (ζυμώνουν) τη λακτόζη θα έχουν χρώμα κόκκινο ή ροζ ενώ τα άλλα άχρωμο (διαχωρισμός). –E.coli

MacConkey MacConkey άγαρ (Gram – ve), εντεροβακτηριακά και εντερόκοκκοι Lactose +ve: escherichia, kliebsiella, enterobacter- κόκκινες αποικίες Lactose –ve: salmonella, shigella, citrobacter, proteus- providencia, edwardsiella, serratia-άχρωμες διαφανεις αποικίες