Απόδιακου Αναστασία Τμήμα Βιοτεχνολογίας Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών Φορέας πρακτικής άσκησης : Εργαστήριο Φυσιολογίας και Μορφολογίας φυτών ΓΠΑ Επιβλέπουσα : Στυλιανή Χωριανοπούλου Λέκτορας ΓΠΑ Πρακτική Άσκηση : Υπολογισμός της σχετικής έκφρασης γονιδίων με την μέθοδο της Real Time PCR 1

Εισαγωγή 2

Οι 11 χρυσοί κανόνες για την Real Time PCR 1. Συλλέγεται φυτικό υλικό από τουλάχιστον τρεις βιολογικές επαναλήψεις, λειοτριβείται αμέσως με υγρό άζωτο και αποθηκεύεται στους -80 ο C. 2. Απομονώνεται υψηλής καθαρότητας RNA από όλα τα δείγματα και υπολογίζεται η ποσότητα του ανά δείγμα. 3. Γίνεται χειρισμός με DNase I το καθαρό RNA ώστε να απομακρυνθεί τυχόν επιμολύνσεις με γενωμικό DNA. Η απουσία γενωμικού DNA επιβεβαιώνεται μέσω μίας PCR με κατάλληλους εκκινητές. 4. Στη συνέχεια γίνεται χειρισμός των δειγμάτων με reverse transcriptase για σύνθεση cDNA από το RNA. 5. Γίνεται έλεγχος της απόδοσης και της ποιότητας του cDNA, χρησιμοποιώντας κατάλληλους εκκινητές για γονίδια αναφοράς του εκάστοτε φυτικού είδους. 3

6. Σχεδιάζονται κατάλληλοι εκκινητές των προς μελέτη γονιδίων. 7. Λαμβάνονται όλα τα δυνατά μέτρα για ελαχιστοποίηση των σφαλμάτων. 8. Γίνεται κανονικοποίηση των δειγμάτων ως προς την έκφραση των γονιδίων αναφοράς. 9. Γίνεται η αντίδραση της Real Time PCR ταυτόχρονα για τα γονίδια αναφοράς και για τα προς μελέτη γονίδια στα δείγματά μας. 10. Καθορίζονται το / τα γονίδιο / α αναφοράς που θα χρησιμοποιηθεί / ούν. 11. Τέλος, υπολογίζεται η μεταγραφική αφθονία κάθε γονιδίου χρησιμοποιώντας κατάλληλο μαθηματικό τύπο. 4

Real Time PCR H Real Time PCR ή PCR στον πραγματικό χρόνο είναι μία ποσοτική αντίδραση PCR κατά την οποία ο πολλαπλασιασμός του DNA- στόχου και η ανίχνευση του προϊόντος γίνονται ταυτόχρονα στο ίδιο σωληνάριο, διότι το προϊόν που παράγεται συνδέεται με φθορίζουσα χρωστική (SYBR green) που ανιχνεύεται από το οπτικό σύστημα του ειδικού κυκλοποιητή που χρησιμοποιείται στη real- time PCR. Με το όργανο αυτό καταγράφεται η κινητική πολλαπλασιαμού του DNA από την ένταση του σήματος του φθορισμού που σχετίζεται με την ποσότητα του συντιθέμενου DNA- στόχου. 5

Σκοπός της εργασίας Μελέτη της έκφρασης των γονιδίων δύο ενζύμων που εμπλέκονται στο μονοπάτι βιοσύνθεσης φυτοσιδηροφόρων στον αραβόσιτο (Zea mays): της αμινοτρανσφεράσης της νικοτιαναμίνης ( Ζ mNAAT1) και της συνθάσης του δεοξυμαγινεϊκού οξέος (ZmDMAS1). Η έκφραση των γονιδίων αυτών μελετήθηκε σε δείγματα φύλλων από τα οποία έχει εκχυλιστεί το RNA και έχει παραχθεί το αντίστοιχο cDNA. 6

Πειραματική διαδικασία 7

Αρχικά έγινε αντίδραση PCR, για να ελεχθούν τα ζευγάρια των εκκινητών που έχουν σχεδιασθεί για τα προς μελέτη γονίδια. Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονται από νεαρά φύλλα φυτών αραβοσίτου. Για τον σκοπό αυτό ελήφθησαν έξι (6) δείγματα : τέσσερα (4) cDNA και δύο (2) genomic DNA. 8

Προετοιμασία των 6 δειγμάτων για PCR Για το κάθε δείγμα ξεχωριστά απαιτούνται οι εξής ποσότητες : 1. 1 μ L dNTPs 10mM μ L Buffer 5x 3. 8 μ L MgCl2 25mM 4. 0,2 μ L Pol μ L ddH2O Τις οποίες και πολλαπλασιάσαμε X14, για να φτιαχτεί το MasterMix των 6 δειγμάτων και για τα δύο γονίδια (=12 δείγματα ). Οπότε τελικά είχαμε : 9

Master Mix (47 μ L σε κάθε tube): μ L dNTPs μ L Buffer μ L MgCl ,8 μ L Polymerase μ L ddH 2 O Primer Mix για τα δύο γονίδια (2 μ L σε κάθε tube): 1. 7 μ L Forward + 7 μ L Reverse Primer NAAT μ L Forward + 7 μ L Reverse Primer DMAS1 Προσθέσαμε σε κάθε tube 1 μ L δείγματος 10

Η συσκευή της PCR 11

Ηλεκτροφόρηση Αφού ολοκληρώθηκε η αντίδραση της PCR, τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύθηκαν σε ηλεκτροφόρηση με gel αγαρόζης. Για την παρασκευή του gel απαιτούνται : 1. 50ml διάλυμα TAE 2. 1gr αγαρόζη 3. 2,5 μ l βρωμιούχο αιθίδιο Το gel τοποθετήθηκε μέσα στη συσκευή ηλεκτροφόρησης για να στερεοποιηθεί, αφού έχει ήδη τοποθετηθεί η χτένα για το σχηματισμό πηγαδιών. Τέλος αφαιρείται τη χτένα και προστίθεται διάλυμα TAE στη συσκευή. 12

Προετοιμασία ηλεκτροφόρησης Προετοιμασία δειγμάτων με Loading buffer Φόρτωση δειγμάτων Στο πρώτο ή / και στο τελευταίο πηγαδάκι τοποθετείται κάθε φορά ο δείκτης μοριακών βαρών (DNA ladder). 13

Ολοκληρωμένη ηλεκτροφόρηση Παρατηρήσαμε πως τα δείγματα μας έχουν “ τρέξει ” στο gel. Αφαιρέσαμε το gel από την συσκευή και το φωτογραφίσαμε σε υπεριώδες φως. Αρχική θέση Τελική θέση 14

Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης Αποτελέσματα δειγμάτων cDNA: i. Στο DNA Ladder, τα δύο πρώτα ορατά σήματα ξεκινώντας από τη βάση του, αντιστοιχούν στα 100 και 200 ζευγάρια βάσεων αντίστοιχα. ii. Τα πρώτα 4 δείγματα (Zm ΝΑΑΤ 1) δεν έδωσαν σήμα, πιθανότατα δεν λειτούργησαν οι εκκινητές για το συγκεκριμένο γονίδιο, οπότε δεν ενισχύθηκε το προϊόν μας. Δεν θα εξετασθεί περαιτέρω τώρα το γονίδιο αυτό. iii. Τα επόμενα 4 δείγματα (ZmDMAS1), έδωσαν σήμα στον αναμενόμενο μέγεθος DNA (121bp). Άρα το γονίδιο ZmDMAS εκφράζεται στο υπέργειο τμήμα του φυτού. DNA Ladder Επιθυμητό σήμα 15

A ποτελέσματα γενωμικού DNA: i. Στο DNA Ladder, τα δύο πρώτα ορατά σήματα ξεκινώντας από τη βάση του, αντιστοιχούν στα 100 και 200 ζευγάρια βάσεων αντίστοιχα. ii. Τα 2 πρώτα δείγματα (Zm ΝΑΑΤ 1) δεν έδωσαν σήμα στο αναμενόμενο μέγεθος DNA, δηλαδή επίσης μπορεί να μην λειτούργησαν οι εκκινητές ή / και να ενίσχυσαν άλλο τμήμα της αλυσίδας DNA. iii. Στα επόμενα 2 δείγματα (ZmDMAS1) παρατηρείται το αναμενόμενο σήμα. Μη επιθυμητό σήμα Επιθυμητό σήμα DNA ladder 16

Στη συνέχεια έγινε Real Time PCR για το γονίδιο της ZmDMAS, ενώ ως γονίδιο αναφοράς επιλέχθηκε η Ubiquitin (ZmUBQ). Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονται από νεαρά φύλλα φυτών αραβοσίτου. Για τον σκοπό αυτό έχουν ληφθεί πέντε (5) δείγματα : τέσσερα (4) cDNA και ένα (1) γενωμικού DNA. 17

Προετοιμασία των 5 δειγμάτων για Real Time PCR h Η κάθε αντίδραση RT-PCR απαιτεί : 1. 5 μ L SYBR GREEN 2. 2 μ L Forward primer 3. 2 μ L Reverse Primer 4. 1 μ L δείγματος Σε 5 tubes, για το γονίδιο της UBQ προσθέσαμε : 1. SYBR GREEN 5 μ L 2. Forward Primer UBQ 2 μ L 3. Reverse Primer UBQ 2 μ L Σε 5 tubes, για το γονίδιο της DMAS1 προσθέσαμε : 1. SYBR GREEN 5 μ L 2. Forward Primer DMAS1 2 μ L 3. Reverse Primer DMAS1 2 μ L 1 μ L από το αντίστοιχο δείγμα σε κάθε tube 18

Φυγοκέντρηση πριν τη RT-PCR Γίνεται πρόψυξη της φυγοκέντρου στους 4 o C. Και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 2000 στροφές για 5 λεπτά. 19

τα plates με τα δείγματα για την Real Time PCR μέσα στη φυγόκεντρο 20

Real Time -PCR Για τη λειτουργία της RT-PCR προαπαιτείται ο σχεδιασμός ενός προγράμματος, που με τη βοήθεια ηλεκτρονικού υπολογιστή τρέχει στο μηχάνημα. Στο πρόγραμμα αυτό σχεδιάζουμε το χρόνο και τις μεταβολές της θερμοκρασίας καθ ’ όλη τη διάρκεια της αντίδρασης. 21

T ο πρόγραμμα της Real Time PCR (thermal profile) που χρησιμοποιήθηκε για τα δείγματα μας. 22

Τοποθέτηση δειγμάτων στη συσκευή της Real Time PCR. 23

Αποτελέσματα Real Time PCR 24

Αποτελέσματα δειγμάτων για το γονίδιο αναφοράς της UBQ Παρατηρείται πως τα δείγματα cDNA Η 2, Η 4 και Η 5 άρχισαν δίνουν σήμα πολύ πριν τον 30 ο κύκλο Το Η 1(genomic) έδωσε σήμα μετά τον 30 ο κυκλο Το Η 3 δεν έδωσε σήμα μέχρι το τέλος της αντίδρασης, γεγονός που αποδίδεται πιθανά σε σφάλμα κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας. 25

Amplification Plots _Roots.mxp Η3Η3 Η1Η1 Η2Η2 Η4Η4 Η5Η5 26

Αποτελέσματα δειγμάτων για το γονίδιο αναφοράς της UBQ Το Η 1 έδωσε δύο σημεία χαμηλού φθορισμού και συνεπώς όχι το αναμενόμενο προϊόν. Το Η 3 δεν έδωσε σήμα, συνεπώς δεν πολλαπλασιάστηκε κάτι. Τα Η 2, Η 4, Η 5 δίνουν υψηλό σημείο φθορισμού σε κοντινές τιμές θερμοκρασίας. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση για να επιβεβαιωθεί ότι το προϊόν της αντίδρασης ήταν το αναμενόμενο. 27

Dissociation Curve _Roots.mxp Η3Η3 Η5Η5 Η2Η2 Η4Η4 Η1Η1 28

Αποτελέσματα δειγμάτων για το προς μελέτη γονίδιο DMAS1 Τα δείγματα Η 7, Η 8, Η 9, Η 10 έδωσαν σήμα σε κοντινές τιμές θερμοκρασίας Το Η 6 έδωσε σήμα σε διαφορετική τιμή θερμοκρασίας Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση ώστε να επιβεβαιώσουμε ότι πολλαπλασιάστηκε το επιθυμητό προϊόν. 29

Dissociation Curve _Roots.mxp Η7Η7 Η8Η8 Η9Η9 Η 10 Η6Η6 30

Αποτελέσματα δειγμάτων για το προς μελέτη γονίδιο DMAS1 Στην επόμενη διαφάνεια παρατίθεται φωτογραφία στην οποία φαίνεται ο αριθμός των κύκλων όπου έδωσαν σήμα τα διάφορα δείγματα. Όλα τα δείγματα έδωσαν σήμα πριν από τον 28 ο κύκλο. Με εξαίρεση το δείγμα Η 6 που έδωσε σήμα μετά τον 32 ο κύκλο. 31

Amplification Plots _Roots.mxp Η6Η6 Η9Η9 Η 10 Η8Η8 Η7Η7 32

Στα δείγματα cDNA: Η 7, Η 8, Η 9, Η 10 Σχετική έκφραση γονιδίων 33

H σχέση χρησιμοποιείται για την σχετική έκφραση αναλογίας γονιδίων στη RT-PCR. Δηλαδή εκφράζεται η αναλογία του γονιδίου στόχου που έχει ως προς ένα γονίδιο αναφοράς. Ratio=E target^ Δ CP ( control - sample ) / E ref ^ Δ CP( control - sample ) Όπου : E target = απόδοση της αντίδρασης για το γονίδιο - στόχο E ref = απόδοση της αντίδρασης για το γονίδιο αναφοράς Δ CP target = η διαφορά των RT-PCR κύκλων του γονιδίου - στόχου στη μεταχείριση control και του ίδιου γονιδίου της μεταχείρησης που μελετάμε. Δ CP ref = η διαφορά των RT-PCR κύκλων του γονιδίου - αναφοράς στη μεταχείριση control και του ίδιου γονιδίου της μεταχείρησης που μελετάμε. 34

Αν ratio<1 τότε το γονίδιο στόχος έχει υποεκφραστεί σε σχέση με το γονίδιο αναφοράς Αν ratio>1 τότε το γονίδιο στόχος έχει υπερεκφραστεί σε σχέση με το γονίδιο αναφοράς 35

Παρουσίαση αποτελεσμάτων των cDNA δειγμάτων Η 7, Η 8, Η 9, Η 10 Χρησιμοποιώντας την παραπάνω σχέση και με αποτελέσματα Ε DMAS, Ε UBQ,CP που λάβαμε καταλήξαμε στα εξής : 1. Ratio Η 8 ως προς Η 7 =1,984 ^(25,880-26,350) / 1,774 ^(21, ,046 ) =0,671 <1 2. Ratio Η 10 ως προς Η 9 =2,383 ^(27,252-26,487)/1,774 ^(23, ,046) =0,600 <1 3. Ratio Η 9 ως προς Η 7 = 1,910 ^(25, ,252 )/1,797 ^(21, ,094 ) =1,265 >1 4. Ratio Η 10 ως προς Η 8 =2,383 ^(26, ,487 )/1,774 ^(21, ,046 ) =0,888 <1 36

Συμπεράσματα Από τα παραπάνω αποτελέσματα οδηγηθήκαμε στο συμπέρασμα ότι το γονίδιο DMAS: του δείγματος Η 8 σε σχέση με το Η 7 υποεκφράστηκε του δείγματος Η 10 σε σχέση με το Η 9 υποεκφράστηκε του δείγματος Η 9 σε σχέση με το Η 7 υπερεκφράστηκε του δείγματος Η 10 σε σχέση με το Η 8 υποεκφράστηκε 37

Βιβλιογραφία Udvardi MK et al.(2008) Eleven golden rules of Quantitative RT-PCR. The Plant Cell 20: Michael W.Pfaffl (2001) A new mathematical model for relative quantification in real time RT-PCR. Nucleic Acids Research 29: