Άσκηση 1 Ανασκόπηση ανοσολογικών τεχνικών Ράνια Τσιτσιλώνη

I.Αντιγόνα-Ανοσογόνα-Ανοχογόνα II.Δυναμική αλληλεπιδράσεων αντιγόνου-αντισώματος III.Αντιδράσεις κατακρήμνισης  σε υγρό μέσο  σε πήκτωμα IV.Αντιδράσεις συγκόλλησης  άμεση  έμμεση ή παθητική  ανασταλτική V.Αντιδράσεις με τη χρησιμοποίηση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος  RIA  ELISA  Western blotting  Ανοσοφθορισμός-κυτταρομετρία ροής VI.Αντιδράσεις του συμπληρώματος VII.Μέθοδοι προσδιορισμού των HLA αντιγόνων VIII.Πειραματικά μοντέλα (in vivo) σε ζώα ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ

Ι. Bασικές έννοιες - Ορισμοί Αντιγόνο (Antigen): ουσία που συνδέεται ειδικά με ένα μόριο αντισώματος ή με τον επιφανειακό υποδοχέα των δραστικών Τ λεμφοκυττάρων και μπορεί να αποτελέσει στόχο της ανοσολογικής απάντησης Ανοσογόνο (Immunogen): ουσία που μπορεί να προκαλέσει την παραγωγή αντισωμάτων ή/και δραστικών Τ λεμφοκυττάρων, δηλ. επάγει ανοσολογική απάντηση Ανοχογόνο (Tolerogen): ουσία που δεν μπορεί να ενεργοποιήσει ικανό αριθμό λεμφοκυττάρων και επάγει ανοχή (μη αντιδραστικότητα). Αποτυγχάνει να προκαλέσει ειδική ανοσολογική απάντηση αλλά και αναστέλλει την λεμφοκυτταρική ενεργοποίηση σε μεταγενέστερες χορηγήσεις της ανοσογονικής μορφής της ίδιας ουσίας.

Ανοσολογική απάντηση – ανοχή - άγνοια

Ανοσογονικότητα των αντιγόνων

Τι επηρεάζει την ανοσογονικότητα ενός μορίου Ι. Παράγοντες που αφορούν το αντιγόνο  ιδιότητα διάκρισης του μορίου ως ξένου  μοριακό μέγεθος  χημική δομή και ετερογένεια  δυνατότητα διάσπασης του μορίου από τα ένζυμα των APC ΙΙ. Παράγοντες που αφορούν τον οργανισμό  γενετικοί παράγοντες  δόση του αντιγόνου  οδός χορήγησης του αντιγόνου  χρήση ανοσολογικών προσθετικών (ανοσοενισχυτικών)

Μοριακά βάρη γνωστών αντιγόνων ΑντιγόνοΜοριακό βάρος (σε Da)  Γάμμα σφαιρίνη βοός (ΒGG)  Αλβουμίνη ορού βοός  Φλαγγελίνη (μονομερές)  Λυσοζύμη αυγού όρνιθας (HEL)  Αιμοκυανίνη (KLH) >  Οβαλβουμίνη (OVA)  Mυοσφαιρίνη σπέρματος φάλαινας (SWM)  Τοξοειδές τετάνου (TT) ΜΒ > 100 kDa: συνήθως ανοσογονικές ουσίες

Σημασία δομής και ετερογένειας πρωτεΐνες και πολυσακχαρίτες λιπίδια και νουκλεϊκά οξέα συνθετικά πολυπεπτίδια από >2-3 αα ανοσογονικά μόρια μη ανοσογονικά μόρια συνθετικά πολυπεπτίδια από 1 αα πεπτίδια με αρωματικά κατάλοιπα (Tyr) μη ανοσογονικά μόρια ανοσογονικά μόρια

Η σημασία δόσης και οδού χορήγησης του Ag (ανοχογόνο)

Τρόπος δράσης γνωστών ανοσοενισχυτικών

Η Θεωρία των Πλευρικών Αλυσίδων (παραγωγή και δράση των αντισωμάτων) P. Ehrlich, Proc. R. Soc. London, 66:424, 1900

Η Θεωρία της Κλωνικής Επιλογής

Η συμπληρωματική σχέση αντιγόνου-αντισώματος  σχέση «κλειδιού-κλειδαριάς»  αμινοξέα του Ag συνδέονται με το Ab  σύνδεση με δεσμούς Η +, ιονικές και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις

Είδη επιτόπων των Β κυττάρων ΓραμμικόςΔιαμορφωτικός

Δημιουργία Τ επιτόπων ενδοκυττάρωση Ag επεξεργασία Αg σύνδεση με MHC μόρια παρουσίαση επιτόπου αναγνώριση από TCR σύνδεση MHC-πεπτίδιο + TCR ενεργοποίηση Τ κυττάρου

Παρουσίαση Τ επιτόπων MHC-περιορισμός (MHC restriction)

Ιδιότητες Β και Τ επιτόπων Χαρακτηριστικό Β κύτταραΤ κύτταρα Αλληλεπίδραση με το αντιγόνο Εμπλέκει το διμερές σύμπλεγμα μεμβρανικής Ig και Ag Εμπλέκει το τριμερές σύμπλεγμα υποδοχέα των Τ κυττάρων, Ag και MHC μορίου Δέσμευση διαλυτού αντιγόνου ΝαιΟχι Εμπλοκή των MHC μορίων Δεν απαιτείταιΑπαιτείται για να εκθέσουν το επεξεργασμένο αντιγόνο Χημική φύση των αντιγόνων Πρωτεΐνη, πολυσακχαρίτης, λιπίδιο Κυρίως πρωτεΐνες, αλλά και μερικά λιπίδια και γλυκολιπίδια που παρουσιάζονται από MHC- προσομοιάζοντα μόρια Ιδιότητες των επιτόπων Προσιτός, υδρόφιλος, ευκίνητα πεπτίδια που περιέχουν συνεχή ή ασυνεχή αμινοξέα Εσωτερικά γραμμικά πεπτίδια που δημιουργούνται μετά από επεξεργασία του αντιγόνου και προσδένονται στα MHC μόρια

ΙΙ. Δυναμική αλληλεπιδράσεων Αg - Ab Ag + Ab Ag-Ab k1k1 k2k2 Συγγένεια (affinity): ένα μόριο Ab με έναν επίτοπο του Ag Δυναμικότητα (avidity): πολλαπλές θέσεις δέσμευσης Ab-Ag

Αλληλεπιδράσεις που συμμετέχουν στην αντίδραση Ag-Ab (75-120)

Αντιδράσεις κατακρήμνισης (ιζηματινοαντιδράσεις)  σε υγρό μέσο  σε πήκτωμα Αντιδράσεις συγκόλλησης (σχηματισμός κροκίδων)  άμεση  έμμεση ή παθητική  ανασταλτική Αντιδράσεις με τη χρησιμοποίηση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος  RIA  ELISA-ELISPOT  Western blotting  Ανοσοφθορισμός-Κυτταρομετρία ροής Αντιδράσεις του συμπληρώματος Μέθοδοι προσδιορισμού των HLA αντιγόνων Τύποι ανοσοαντιδράσεων

Ευαισθησία διαφόρων ανοσοδοκιμασιών ΔοκιμασίαΕυαισθησία (μg Ab/ml) Κατακρήμνιση σε διάλυμα Κατακρήμνιση σε πήκτωμα Μancini Ouchterlony Ανοσοηλεκτροφόρηση Rocket ηλεκτροφόρηση Αντιδράσεις συγκόλλησης Αμεση Παθητική Ανασταλτική RIA ELISA< Ανοσοφθορισμός1 Κυτταρομετρία ροής

III. Αντιδράσεις κατακρήμνισης (ιζηματινοαντιδράσεις) Προϋποθέσεις:  το Ab να είναι δισθενές (Fab τμήματα δεν σχηματίζουν ίζημα)  το Ag να είναι τουλάχιστον δισθενές (δύο αντίγραφα του ίδιου επιτόπου ή πολλαπλούς επιτόπους που αντιδρούν με πολυκλωνικά Ab) Τύποι αντιδράσεων κατακρήμνισης: σε υγρό μέσο σε πήκτωμα  απλή ανοσοδιάχυση προς μια κατεύθυνση  διπλή ανοσοδιάχυση προς μια κατεύθυνση  διπλή ανοσοδιάχυση προς δύο κατευθύνσεις (Ouchterlony)  κυκλοτερής ή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (Mancini)  ανοσοηλεκτροφόρηση – rocket ηλεκτροφόρηση  ανοσοκαθήλωση

Σχηματισμός ιζήματος - Ζώνη ισοδυναμίας

Mancini Ouchterlony Ανοσοδιάχυση σε πήκτωμα Ανοσοδιάχυση σε πήκτωμα

Ανοσοδιάχυση Mancini

Ανοσοδιάχυση Mancini Ανοσοδιάχυση Mancini

Αντίδραση ταυτότητας Αντίδραση μη ταυτότητας Αντίδραση μερικής ταυτότητας Καθορισμός της ταυτότητας δύο Ag με τη μέθοδο Ouchterlony

Ανοσοδιάχυση Ouchterlony Ανοσοδιάχυση Ouchterlony Παράδειγμα: Ανίχνευση Ab έναντι μικροβίων, αντι-ΕΝΑ Ab σε νοσήματα κολλαγόνου

Ανοσοηλεκτροφόρηση Ανοσοηλεκτροφόρηση

Παράδειγμα: Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης

Ανοσοκαθήλωση Ανοσοκαθήλωση ορού ασθενούς με μυέλωμα τύπου IgM λ

Παραδείγματα ανοσοκαθήλωσης Μακροσφαιριναιμία Waldenstrom Νόσος ελαφριών λ αλυσίδων Μυέλωμα ΙgM κ

IV. Αντιδράσεις συγκόλλησης (σχηματισμός κροκίδων) Προϋποθέσεις:  το Ab να έχει μεγαλύτερη ισχύ σύνδεσης από τις απωθητικές δυνάμεις μεταξύ των σωματιδίων του Ag  να υπάρχει κατάλληλη αναλογία Ag-Ab  η παρουσία ηλεκτρολύτη Τύποι αντιδράσεων συγκόλλησης:  άμεση συγκόλληση (πχ. ομάδες αίματος)  έμμεση ή παθητική συγκόλληση (για διαλυτά Αg, με σωματίδια latex, πχ. μέθοδος Coombs)  ανασταλτική συγκόλληση (πχ. test εγκυμοσύνης, ένδειξη/ανίχνευση χρήσης απαγορευμένων ουσιών [κοκαΐνης, ηρωίνης]) Παράδειγμα: Ανίχνευση ρευματοειδούς παράγοντα, CRP, ASTO (στρεπτόκοκκο), Widal (σαλμονέλλα), Wright (βρουκέλλα), VDRL (σύφιλη),

Αμεση μέθοδος Coombs Η παρουσία Ab έναντι των ερυθρών αιμοσφαιρίων του ασθενούς προκαλεί τη συγκόλλησή τους παρουσία αντιδραστηρίου Coombs (αντι-IgG, αντι-IgM, αντι-C)

Αναστολή της συγκόλλησης

V. Αντιδράσεις με χρήση επισημασμένου Ag ή Ab Προϋποθέσεις:  η επισήμανση να γίνεται με ουσίες ή μόρια που επιτρέπουν την εύκολη ανίχνευση και τη μέτρησή τους Τύποι αντιδράσεων:  RIA  ELISA – ELISPOT  Western blotting  ανoσοφθορισμός – κυτταρομετρία ροής)

Μέθοδος RIA

Παραλλαγές μεθόδου ELISA ανταγωνιστική ELISA ELISA τύπου σάντουιτς έμμεση ELISA

Μέθοδος ELISPOT (κυρίως για κυτταροκίνες)

/well /well Καλλιέργεια με 50 μg/mL πεπτίδιο RestimulationRestimulation Elispot 2 ώρες προσκόλληση προ- σκόλληση Μη προ- σκόλληση Καλλιέργεια με IL-4, GM-CSF Καλλιέργεια με 5 μg/mL PHA + TNFα HLA- typing ΜΟΝΟΠΥΡΗΝΑ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ (PBMC) Εφαρμογή μεθόδου ELISPOT

Μέθοδος Western blot Παράδειγμα: ανίχνευση Ab έναντι έρπητα τύπου Ι και ΙΙ, AIDS

Ανοσοφθορισμός άμεσος έμμεσος Παράδειγμα: in situ εντοπισμός πρωτεΐνης σε κύτταρα ή ιστούς

Κυτταρομετρία ροής Παράδειγμα: προσδιορισμός υποπληθυσμών κυττάρων σε ανοσολογικά, αιματολογικά και κακοήθη νοσήματα

VI. Αντιδράσεις του συμπληρώματος Προϋποθέσεις:  ανιχνεύει Ab στον ορό  το σύμπλεγμα Ag-Ab που καταναλώνει το συμπλήρωμα δεν είναι ορατό  χρειάζεται δείκτης = αιμολυτικό σύστημα ΠΡΟΣΟΧΗ: θετική είναι η αντίδραση που δεν δίνει αιμόλυση Αιμολυτικό σύστημα = ερυθρά αιμοσφαίρια προβάτου (Ag) και ορός ζώου που περιέχει Ab έναντι των ερυθρών αιμοσφαιρίων του προβάτου Παράδειγμα: Wasserman για σύφιλη

Αιμολυτικό συμπλήρωμα πχ. Wasserman για σύφιλη

VII. Μέθοδοι προσδιορισμού HLA αντιγόνων Προϋποθέσεις:  Τ λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης Ι) και Β λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης ΙΙ)  πολυκλωνικοί ή μονοκλωνικοί αντι-HLA αντιοροί Μέθοδοι που χρησιμοποιούνται:  μικρολεμφοκυτταρική δοκιμασία (ορολογική τυποποίηση)  μοριακές μέθοδοι (PCR)  μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση (MLR)

Mικρολεμφοκυτταρική δοκιμασία

Mοριακή τυποποίηση με χρήση PCR PCR-SSP PCR-SSO

Μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση

VIII. Πειραματικά μοντέλα σε ζώα-Ποντίκια SCID γυμνό ή αθυμικό ποντίκι (nu/nu)

Διαγονιδιακά ποντίκια-έκφραση συγκεκριμένου γονιδίου διαγονίδιο έλεγχος με PCR

Κnockout ποντίκια: in vitro προετοιμασία

Κnockout ποντίκια (ομόζυγα)-διαγραφή γονιδίου

Ιστοειδική έκφραση γονιδίου (σύστημα Cre/loxP) το γονίδιο Cre εκφράζεται μόνο στο θύμο Η ρεκομπινάση Cre αναγνωρίζει τη θέση loxP και καταλύει τον ανασυνδυασμό

Σύγκριση διαγονιδιακών και knockout ποντικών Χαρακτηριστικό Διαγονιδιακό ζώο Knockout ζώο Κύτταρα που εισάγεται το DNA Ζυγωτό Εμβρυϊκά αρχέγονα κύτταρα (stem cells) Κατασκευές DNA Φυσιολογικό γονίδιο ή cDNAΜεταλλαγμένο γονίδιο Τρόπος μεταφοράς Μικροένεση στο ζυγωτό και εμφύτευση στη θετή μητέρα Μεταφορά των αρχέγονων κυττάρων σε βλαστοκύστη και εμφύτευση στη θετή μητέρα Τελικό αποτέλεσμα Εισαγωγή ενός επιπλέον γονιδίου Απώλεια ενός γονιδίου