Δημοσθένης Τζήμας Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας Επιβλέπων καθηγητής: Εμμανουήλ Φλεμετάκης

Εισαγωγή  Στην πρακτική άσκηση πραγματοποιήθηκε PCR σε μια σειρά από φυτά του είδους Medicago truncatula, με σκοπό την εύρεση φυτών τα οποία είναι μεταλλαγμένα για ένα συγκεκριμένο γονίδιο το οποίο έχει καταστεί ανενεργό λόγω μιας ένθεσης (tnt) που παρεμβάλεται στην αλληλουχία του.

Πορεία πειράματος Η πορεία του πειράματος αποτελείται από τα παρακάτω βήματα: * Η παραπάνω διαδικασία ακολουθήτε για ένα διαφορετικό αριθμό δειγμάτων έτσι ώστε να αυξηθούν οι πιθανότητες απομόνωσης φυτών με τα επιθυμητά χαρακτηριστικά. Ανάπτυξη φυτώνΑπομόνωση DNAΑντίδραση PCRΕμφάνιση αποτελεσμάτωνΓονιδιακός χαρακτηρισμός του δείγματος

Medicago truncatula Ρίζα του φυτού Medicago truncatula, στην οποία διακρίνονται τα φυμάτια. Το Medicago truncatula είναι ένα ψυχανθές της οικογένειας fabaceae το οποίο είναι ενδημικό στη περιοχή της μεσογείου και αποτελεί οργανισμό πρότυπο για γονιδιωματική έρευνα αφού έχει μικρό γονιδίωμα, μικρό χρόνο γενιάς, παράγει πολλούς καρπούς και μεταλλάσσεται εύκολα.

Απομόνωση DNA από φυτικό ιστό Αρχικά απομονώνεται το DNA από τον ιστό του φυτού. Αυτό γίνεται ακολουθώντας τα εξής βήματα:  Σε δοχείο eppendorf τοποθετούνται τμήμα φύλλου μαζί με διάλυμα 2*CTAB και ομογενοποιείται το δείγμα  Προσθέτεται ίσος όγκος 2*CTAB και αναδεύεται για καλύτερη ομογενοποίηση  Επώαση των δειγμάτων στους 60*C για λεπτά  Προσθέτεται χλωροφόρμιο ίσου όγκου και πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις 8000 rpm. (για περεταίρω καθαρότητα του DNA επαναλαμβάνεται το τελευταίο βήμα)  Μεταφορά του υπερκείμενου σε νέο eppendorf και για κατακρήμνιση του DNA προστήθεται 1/10 του όγκου οξικό νάτριο 3Μ, Ph 5,2 και ίσος όγκος ισοπροπανόλης.  Πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 20 λεπτά στις rpm και ξεπλένεται το ίζημα με 1 ml 70% αιθυλική αλκοόλη

Απομόνωση DNA  Πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στις rpm και το ίζημα αφήνεται να στεγνώσει  Επαναδιαλύεται το ίζημα με 50 ml απεσταγμένο και αποστειρωμένο νέρο και προστήθεται 1 μL RNAse Με αυτό τον τρόπο η διαδικασία απομόνωσης έχει τελειώσει. Πραγματοποιείται μέτρηση της απορρόφησης του υδατικού δείγματος σε φωτόμετρο στα 260nm, έτσι ώστε να ελεγχθεί αν απομονώθηκε ικανή ποσότητα. Στη συνέχεια το δείγμα DNA αποθηκεύεται στους -20.

PCR  Η PCR είναι μια διαδικασία με την οποία μπορούμε να εντοπίσουμε και να ενισχύσουμε μια αλληλουχία DNA της επιλογής μας.

Πρωτόκολλο της PCR παρατήρηση: όλα τα παραπάνω πραγματοποιούνται δουλεύοντας με όλα τα διαλύματα σε πάγο για να μην επηρεαστούν από τη θερμοκρασία Ξεκινώντας στο PCR tube προστήθονται αρχικά οι εκκινητές, dNTP’s και ένα διάλυμα (buffer) που κρατά σταθερές τις συνθήκες κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. Στη συνέχεια προστήθεται ddH2O λαμβάνοντας υπόψη ότι ο τελικός όγκος πρέπει να είναι 25μl. Έπειτα προστήθεται 1 μl από το δείγμα DNA και στο τέλος προστήθεται η πολυμεράση και αυτό γιατί το συγκεκριμένο ένζυμο είναι πολύ ευαίσθητο και χάνει γρήγορα μέρος της δραστικότητας της σε θερμοκρασίες δωματίου. Πάντα σε μια PCR υπάρχουν και 2 δείγματα μάρτυρες, ένας αγρίου τύπου (σίγουρα δε φέρει μετάλλαξη) και ένας χωρίς καθόλου DNA.

Στάδια PCR Στο δίπλα μηχάνημα τοποθετούνται τα PCR tubes και λαμβάνει χώρα η όλη διαδικασία της οποίας τα στάδια είναι: I. 94 C για 2 min II. 94 C για 30 sec (αποδιάταξη) III. 55 C για 45 sec (υβριδοποίηση) IV. 68 C για 2 min (πολυμερισμός) V. 68 C για 5 min II-IV επανάληψη για 34 κύκλους (οι θερμοκρασίες και οι χρόνοι είναι ενδεικτικοί)

Ηλεκτροφόρηση DNA  Με την ολοκλήρωση της PCR για την εμφάνιση των αποτελσμάτων πραγματοποιείται ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης, ηοποία γίνεται στο δίπλα μηχάνημα.  Ηλεκτροφορούνται τα δείγματα σε τάση V για περίπου 30 με 45 λεπτά (μέχρι να φανεί ότι το DNA και ο ladder έχει απλωθεί ικανοποιητικά)

Σύσταση και λειτουργία πηκτής  Με την ηλεκτροφόρηση τα δείγματα του DNA διαχωρίζονται με βάση το μέγεθος τους με τα μικρά τμήματα να κινούνται προς την άνοδο πιο εύκολα και γρήγορα από τα μεγαλύτερα.  Η πηκτή αγαρόζης είναι διάλυμα 1*TAE στο οποίο προστήθεται 1% αγαρόζη και θερμαίνεται μέχρι να διαλυθεί.  Στην πηκτή αγαρόζης προστήθεται και Βρωμιούχο αιθίδιο το οποίο προσδένεται στο DNA και το καθιστά ορατό κάτω από UV light

Εμφάνιση αποτελεσμάτων Για την οπτικοποίηση των αποτελέσμάτων της ηλεκτροφόρησης το gel τοποθετήται στο δίπλα θάλαμο, όπου κάτω από UV light και με τη βοήθεια του EtBr τα τμήματα του DNA γίνονται ορατά. Με την κάμερα που είναι ενσωματωμένη στο θάλαμο υπάρχει δυνατότητα για λήψη φωτογραφιών. Όλοι οι χειρισμοί γίνονται με έναν ηλεκτρονικό υπολογιστή με τον οποίο ο θάλαμος είναι συνδεδεμένος.

Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης όπως φαίνονται κάτω από UV light Στο πρώτο ‘πηγάδι’ της πήκτης πάντα προστίθεται ένα DNA ladder το οποίο είναι διάλυμα που περιέχει τμήματα DNA γνωστού μήκους έτσι ώστε,να υπάρχει δυνατότητα επαλήθευσης των αποτελεσμάτων. Αν βρεθεί κάτι μη αναμενόμενο στα αποτελέσματα γίνεται επανάληψη της PCR.

Δημιουργία χάρτη  Με τη χρήση του προγράμματος SeqBuilder δημιουργήθηκε ο χάρτης του γονιδίου στον οποίο διακρίνονται οι εκκινητές, τα εσώνια και εξώνια, και οι θέσεις ένθεσης του tnt. Επίσης υπάρχει δυνατότητα μέτρησης των μεταξύ τους αποστάσεων για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων των PCR.

Σύνοψη PCR στην οποία βλέπουμε πως 2 δείγματα (199.1,199.5) έχουν το γονίδιο που εξετάζουμε απενεργοποιημένο Στη δίμηνη πρακτική άσκηση με το φυτό Medicago truncatula πραγματοποιήθηκαν οι παρα κάτω διαδικασίες  Απομόνωση DNA από ιστούς του  PCR σε έναν αριθμό δειγμάτων  Εμφάνιση των αποτελεσμάτων σε πηκτή αγαρόζης  Δημιουργία του χάρτη του επιθυμητού γονιδίου με το πρόγραμμα SeqBuilder Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 6 PCR σε 12 δείγματα DNA ( ) με σκοπό την εύρεση φυτών στα οποία το εξεταζόμενο γονίδιο είναι απενεργοποιημένο. Τελικά 2 από τα 12 δείγματα είχαν τα επιθυμητά χαρακτηριστικά.

Άλλες εργασίες Πέρα από το πείραμα πραγματοποιήθηκαν και διάφορες βοηθητικές εργασίες όπως:  Παρασκευή ρυθμιστικών και θρεπτικών διαλυμάτων  Αποστείρωση σκευών, διαλυμάτων και άλλων αντικειμένων (π.χ. Tips)  πλύσιμο φιαλών και σκευών  Παροχή βοήθειας σε άλλους φοιτητές με χρονοβόρα πρωτόκολλα.