ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Οι Ιοί ως Φυτοπαθογόνα Αίτια Γενικά Προσβάλλουν φυτικά – ζωικά κύτταρα Προσβάλλουν φυτικά – ζωικά κύτταρα Πολλαπλασιασμός σε κύτταρα – ξενιστές Πολλαπλασιασμός σε κύτταρα – ξενιστές πρωτεϊνικό καψίδιο – νουκλεϊκό οξύ DNA ή RNA πρωτεϊνικό καψίδιο – νουκλεϊκό οξύ DNA ή RNA (μονόκλωνο ή δίκλωνο) (μονόκλωνο ή δίκλωνο) μόρια πρωτεΐνης καψομερή

Χαρακτηριστικά Φυτικών Ιών Εξαιρετικά μικρό μέγεθος Εξαιρετικά μικρό μέγεθος Ποικιλία σχημάτων (Ραβδόμορφοι, βακιλόμορφοι, σφαιρικοί…) Ποικιλία σχημάτων (Ραβδόμορφοι, βακιλόμορφοι, σφαιρικοί…) Πολλαπλασιασμός σε 1 ή περισσότερους ξενιστές Πολλαπλασιασμός σε 1 ή περισσότερους ξενιστές Ύπαρξη ιού σε φυτά χωρίς εμφάνιση συμπτωμάτων Ύπαρξη ιού σε φυτά χωρίς εμφάνιση συμπτωμάτων 13 οικογένειες, 71 γένη Caulimoviridae και Geminiviridae οικ. με DNA ιούς DNA ιοί βελτίωση φυτών DNA ιοί βελτίωση φυτών

Παθογένεση  Μόλυνση από πληγές Είσοδος του ιού με λύση του κυτταρικού τοιχώματος και της κυτταρικής μεμβράνης κυτταρικής μεμβράνης Ανεπαίσθητες πληγές μπορούν πιο εύκολα να προκληθούν στα πράσινα τρυφερά όργανα στα πράσινα τρυφερά όργανα Πιο σημαντικές πληγές προκαλούνται από οργανισμούς - φορείς του συγκεκριμένου ιού φορείς του συγκεκριμένου ιού

Παθογένεση (συνέχεια) Ανατομικές και φυσιολογικές ανωμαλίες Ανατομικές και φυσιολογικές ανωμαλίες μείωση χλωροφύλλης, συσσώρευση αμύλου, αυξημένος μείωση χλωροφύλλης, συσσώρευση αμύλου, αυξημένος ρυθμός αναπνοής ρυθμός αναπνοής Εξωτερικά συμπτώματα Εξωτερικά συμπτώματα μωσαϊκά, χλωρώσεις, ποικιλοχρώσεις μωσαϊκά, χλωρώσεις, ποικιλοχρώσεις Πιο εμφανή συμπτώματα στα φύλλα Πιο εμφανή συμπτώματα στα φύλλα Διασυστηματικές μολύνσεις στον αγρό Διασυστηματικές μολύνσεις στον αγρό Εντοπισμένες σε φυτά - δείκτες Εντοπισμένες σε φυτά - δείκτες

Μετάδοση 1. Μηχανική μετάδοση στον αγρό 2. Μετάδοση με έντομα (αφίδες, αλευρώδεις, κολεόπτερα, θρίπες και άλλα έντομα…) (αφίδες, αλευρώδεις, κολεόπτερα, θρίπες και άλλα έντομα…) 3. Μετάδοση ιών με νηματώδεις 4. Μετάδοση με μύκητες 5. Μετάδοση με το σπόρο 6. Μετάδοση με τη γύρη

Μετάδοση (συνέχεια) 7. Μετάδοση με αγενές πολλαπλασιαστικό υλικό 8. Μετάδοση με εμβολιασμό 9. Μετάδοση με το φανερόγαμο παράσιτο κουσκούτα

Ανίχνευση  Βιολογική δοκιμή  Ορολογικές δοκιμές 1. Ένζυμο-ανοσο δοκιμή ELISA 2. Mονοκλωνικά Αντισώματα 3. Ανοσο-προσροφητική ηλεκτρονική μικροσκοπία  Μοριακές μέθοδοι 1. Μοριακός υβριδισμός 2. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR)

Ο Ιός της Ευλογιάς της δαμασκηνιάς στα Πυρηνόκαρπα

Plum pox virus (PPV) Ο καταστροφικότερος ιός των πυρηνοκάρπων Ιστορικό Βουλγαρία, εμφάνιση συμπτωμάτων σε δαμασκηνιά 1932 Η ίωση «σάρκα» (Atanassof, D.) Γιουγκοσλαβία, Ουγγαρία, Ρουμανία, Αλβανία, Τσεχοσλοβακία, Γερμανία, Ρωσία Ολλανδία, Ελβετία, Ελλάδα, Τουρκία, Αγγλία

Ιστορικό (συνέχεια…) 1968 Ελλάδα (Δημητριάδης και Κατσίμπας, 1968): Επισήμανση της ασθένειας στην Ελλάδα σε βερικοκιά ποικιλίας Τίρυνθος στην Αργολίδα Γαλλία, Ιταλία, Βέλγιο Ισπανία, Πορτογαλία, Αίγυπτος, Συρία, Κύπρος 1992Χιλή 1994Ινδία 1999ΗΠΑ 2000Καναδάς 2003Τυνησία

Ξενιστές Prunus spp. Καλλιεργούμενα P. domestica - δαμασκηνιά P. insititia - κορομηλιά P. armeniaca - βερικοκιά P. persica - ροδακινιά P. salicina - ιαπ. δαμασκηνιά P. avium - κερασιά P. cerasus - βυσσινιά P. amygdalus - αμυγδαλιά Άγρια P. spinosa P. americana P. bessey P. mahaleb P. mume P. pumila P. hortulana P. daridana P. tomentosa P. nigra P. Maritime P. laucerasus

Ξενιστές (συνέχεια…) Ζιζάνια Campanula rapunculoides Campanula rapunculoides Chenopodium quinoa Chenopodium quinoa C. species C. species Lamium album Lamium album L. amplxicaule L. amplxicaule L. purpureum L. purpureum Lupinus albus Lupinus albus Lycium barbarum Lycium barbarum L. halimifolium L. halimifolium Medicago lupulina Medicago lupulina Melilotus officinalis Melilotus officinalis Ranunculus spp. Silene vulgaris Solanum dulcamara Trifolium incarnatum T. pratense T. repens Zinnia elegans Z. violacea

Συμπτωματολογία Εξαρτάται από: Είδος ξενιστή και ποικιλία Είδος ξενιστή και ποικιλία Στέλεχος του ιού Στέλεχος του ιού Εποχή και τοποθεσία Εποχή και τοποθεσία

Επιπτώσεις στην παραγωγή 100 εκ. δέντρα πυρηνοκάρπων στην Ευρώπη μολυσμένα 100 εκ. δέντρα πυρηνοκάρπων στην Ευρώπη μολυσμένα Ευπαθείς ποικιλίες σε συνδυασμό με το στέλεχος του ιού Ευπαθείς ποικιλίες σε συνδυασμό με το στέλεχος του ιού μείωση παραγωγής % μείωση παραγωγής % και γενικότερα και γενικότερα μη εμπορεύσιμο προϊόν μη εμπορεύσιμο προϊόν μικρή περιεκτικότητα σε σάκχαρα μικρή περιεκτικότητα σε σάκχαρα σκουρόχρωμοι μεταχρωματισμοί κατά την σκουρόχρωμοι μεταχρωματισμοί κατά τηνκονσερβοποίηση

Μετάδοση Άνθρωπος Άνθρωπος Μολυσμένο πολλαπλασιαστικό υλικό Μολυσμένο πολλαπλασιαστικό υλικό Αφίδες Αφίδες Κυρίως άνοιξη και φθινόπωρο Κυρίως άνοιξη και φθινόπωρο Μη έμμονος τρόπος Μη έμμονος τρόπος 20 είδη φορείς 20 είδη φορείς

Μετάδοση (συνέχεια…) Ικανότητα μετάδοσης ανεξάρτητη από την ικανότητα σχηματισμού αποικιών Σπουδαιότερα είδη: Brachycaudus helichrysi Brachycaudus helichrysi Hyalopterus pruni Hyalopterus pruni Myzus persicae Myzus persicae M. varians M. varians Phorodon humuli Phorodon humuli Aphis craccivora A. spiraecola Brachycaudus cardui

Στελέχη του ιού PPV-M Ελληνική απομόνωση από ροδακινιά. Νότια, ανατολική και κεντρική Ευρώπη. Ευκολότερη μετάδοση με αφίδες. Αναφορά για μετάδοση με σπόρο. Πιο παθογόνο στη ροδακινιά. PPV-D Γαλλικής απομόνωση από βερικοκιά. Δυτική Ευρώπη, Χιλή, Η.Π.Α. Δυσκολότερη μετάδοση του με αφίδες

Στελέχη του ιού (συνέχεια…) PPV-EA Αιγυπτιακή απομόνωση από βερικοκιά. Αίγυπτος Μοιάζει περισσότερο με PPV-M PPV-CΜολδαβία Βυσσινιά, κερασιά Ανατολική, κεντρική Ευρώπη, Ιταλία

Ανίχνευση 1. Ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA 2. Ηλεκτρονική μικροσκοπία 3. Μοριακός υβριδισμός 4. Βιολογική δοκιμή 5. Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR)

Αντιμετώπιση Εκρίζωση και καταστροφή ύποπτων δέντρων Εκρίζωση και καταστροφή ύποπτων δέντρων Υγιές πολλαπλασιαστικό υλικό Υγιές πολλαπλασιαστικό υλικό Καταπολέμηση αφίδων Καταπολέμηση αφίδων Ανεκτικές ποικιλίες Ανεκτικές ποικιλίες

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Πείραμα Μετάδοσης του Plum pox virus μέσω αφίδων Myzus persicae Εισαγωγή ΡΡV-Μ επικρατέστερο στην Ελλάδα ΡΡV-Μ επικρατέστερο στην Ελλάδα προκαλεί σοβαρές επιδημίες προκαλεί σοβαρές επιδημίες PPV-D επικρατέστερο σε Δ. Ευρώπη και Αμερική PPV-D επικρατέστερο σε Δ. Ευρώπη και Αμερική μελέτη του ρυθμού εξάπλωσης του ΡΡV-Μ σε οπωρώνες βερικοκιάς στο Νομό Αργολίδας

Εισαγωγή (συνέχεια…) Σπουδαιότερος παράγοντας για την εξάπλωση του PPV: οι συγκεκριμένες οικολογικές συνθήκες που επικρατούν σε έναν οπωρώνα και που επηρεάζουν τον αριθμό ιοφόρων αφίδων. οι συγκεκριμένες οικολογικές συνθήκες που επικρατούν σε έναν οπωρώνα και που επηρεάζουν τον αριθμό ιοφόρων αφίδων. Παρακολούθηση των πληθυσμών αφίδων σε οπωρώνες βερικοκιάς για τον προσδιορισμό των σπουδαιότερων αφίδων-φορέων του ιού. 5 είδη αφίδων - φορέων 5 είδη αφίδων - φορέων Aphis gossypii πολυπληθέστερο Aphis gossypii πολυπληθέστερο

Εισαγωγή (συνέχεια…) Διασταυρωτή προστασία για αντιμετώπιση του PPV Διασταυρωτή προστασία για αντιμετώπιση του PPV μόλυνση φυτών με ήπιο στέλεχος ενός ιού για να μη μόλυνση φυτών με ήπιο στέλεχος ενός ιού για να μη μολυνθούν από ισχυρό στέλεχος του ίδιου ιού μολυνθούν από ισχυρό στέλεχος του ίδιου ιού Πρόκληση μεταλλάξεων με φυσικό τρόπο σε PPV – D Πρόκληση μεταλλάξεων με φυσικό τρόπο σε PPV – D Επιλέγησαν ως ήπιες PPV-B2 και PPV-B18 Επιλέγησαν ως ήπιες PPV-B2 και PPV-B18 μάρτυρες: PPV-DL μάρτυρες: PPV-DL PPV-MK PPV-MK

Υλικά και μέθοδοι Στελέχη του ιού PPV-DL Απομόνωση από ροδακινιά της περιοχής Λάρισας. Ανήκει στο στέλεχος D. Λάρισας. Ανήκει στο στέλεχος D. PPV-MK Απομόνωση από ροδακινιά της περιοχής Καβάλας. Aνήκει στο στέλεχος M. Καβάλας. Aνήκει στο στέλεχος M.

Στελέχη του ιού (συνέχεια…) PPV-B2 και PPV-B18 Μεταλλαγμένες απομονώσεις του Εργαστηρίου. Προέκυψαν με Εργαστηρίου. Προέκυψαν με μεταχείριση φυτών Nicotiana μεταχείριση φυτών Nicotiana benthamiana μολυσμένων με PPV- benthamiana μολυσμένων με PPV- DL σε χαμηλή θερμοκρασία. Ήπια DL σε χαμηλή θερμοκρασία. Ήπια συμπτωματολογία συμπτωματολογία

Είδος και πολλαπλασιασμός αφίδων Myzus persicae Myzus persicae Πολλαπλασιασμός αφίδων σε νεαρά φυτά μελιτζάνας Πολλαπλασιασμός αφίδων σε νεαρά φυτά μελιτζάνας Ανανέωση αποικιών των αφίδων 1 φορά την εβδομάδα Ανανέωση αποικιών των αφίδων 1 φορά την εβδομάδα

Μετάδοση του ιού με αφίδες Νηστεία για 3 ώρες σε τρυβλία Petri. Νηστεία για 3 ώρες σε τρυβλία Petri. Τοποθέτηση αφίδων σε φύλλα φυτο-δείκτη N. Τοποθέτηση αφίδων σε φύλλα φυτο-δείκτη N. benthamiana μολυσμένα με PPV benthamiana μολυσμένα με PPV 5 λεπτά 5 λεπτά Μεταφορά Μεταφορά σε υγιή φυτά N. benthamiana, 5-10 αφίδες/φυτό σε υγιή φυτά N. benthamiana, 5-10 αφίδες/φυτό σε φυτά ροδακινιάς GF-305 και βερικοκιάς (Manicot), σε φυτά ροδακινιάς GF-305 και βερικοκιάς (Manicot), αφίδες/φυτό αφίδες/φυτό

Μετάδοση με αφίδες (συνέχεια…) ψεκασμός με αφιδοκτόνο ψεκασμός με αφιδοκτόνο τοποθέτηση ειδικό θάλαμο - 25°C τοποθέτηση ειδικό θάλαμο - 25°C πότισμα και οπτικός έλεγχος κάθε 2 ημέρες πότισμα και οπτικός έλεγχος κάθε 2 ημέρες 3 εβδομάδες - συλλογή δειγμάτων για ανίχνευση της 3 εβδομάδες - συλλογή δειγμάτων για ανίχνευση της παρουσίας ή όχι του ιού με ELISA παρουσίας ή όχι του ιού με ELISA

Ανοσοδοκιμή ELISΑ Εκτέλεση της δοκιμής ELISA πλαστικό υποστήριγμα (πλάκα πολυστυρενίου) πλαστικό υποστήριγμα (πλάκα πολυστυρενίου) εξειδικευμένα αντισώματα (γ-ανοσοσφαιρίνες: IgG) εξειδικευμένα αντισώματα (γ-ανοσοσφαιρίνες: IgG) τα ίδια αντισώματα συζευγμένα με ένα ένζυμο τα ίδια αντισώματα συζευγμένα με ένα ένζυμο ένα υπόστρωμα του ενζύμου ένα υπόστρωμα του ενζύμου αντίσωμα σε συγκέντρωση 1 μg/ml σύζευγμα σε αραίωση 1/1000 σύζευγμα σε αραίωση 1/1000

Εκτέλεση της δοκιμής ELISA (συνέχεια…) Αντιδραστήρια φωσφορικό διάλυμα (+NaCl) pH ουδέτερο (PBS) φωσφορικό διάλυμα (+NaCl) pH ουδέτερο (PBS) Τween για αποφυγή κάθε απορρόφησης στα τοιχώματα της πλάκας Τween για αποφυγή κάθε απορρόφησης στα τοιχώματα της πλάκας polyvinyl-pyrrolidone (PVP) για σταθεροποίηση του ιού polyvinyl-pyrrolidone (PVP) για σταθεροποίηση του ιού οvalbumine (διάλυμα του συζεύγματος) για προστασία προσκολλημένου στα αντισώματα του ενζύμου οvalbumine (διάλυμα του συζεύγματος) για προστασία προσκολλημένου στα αντισώματα του ενζύμου

Αντιδραστήρια (συνέχεια…) ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης των αντισωμάτων: ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης των αντισωμάτων: ανθρακικό διάλυμα, pH 9,6 που επιτρέπει την ανθρακικό διάλυμα, pH 9,6 που επιτρέπει την προσκόλληση των αντισωμάτων στην πλάκα προσκόλληση των αντισωμάτων στην πλάκα διάλυμα υποστρώματος με pH (9,8) για να επιτρέψει τη διάλυμα υποστρώματος με pH (9,8) για να επιτρέψει τη δράση του ενζύμου δράση του ενζύμου

Συντήρηση και χρησιμοποίηση των αντιδραστηρίων Συντήρηση Διαλύματα (4ºC) Συνθήκες χρήσης Βιολογικά Αντιδραστήρια στο PBS Γ-Ανοσοσφαιρίνες (IgG) -20ºC Ανθρακικό διάλυμα (pH 9.6) 1μg/ml Σύζευγμα 4 ºC PBS + Tween 0.05% + PVP 2% + ovalbumine 0.2% 1/1000 Χημική αντίδραση Υπόστρωμα αλκαλικής φωσφατάσης: -20ºC διαιθανολαμίνη 10% (pH 9.8) 1 mg/ml Φυτικό υλικό 4ºC PBS + Tween 0.05% + PVP 2%

Σύνθεση χρησιμοποιούμενων ρυθμιστικών διαλυμάτων Διάλυμα PBS x10 Διάλυμα PBS-Tween NaCl 80g διάλυμα PBS + Tween 0.05% KH 2 PO 4 2g Διάλυμα PBS-Tween-PVP Na 2 HPO 4 ·12 H 2 O 29g διάλυμα PBS + Tween 0.05% + PVP 2% KCl 2g Διάλυμα PBS-Tween-PVP- ovalbumine NaN 3 2g διάλυμα PBS-Tween-PVP + ovalbunine 0.2% Προσθήκη απεσταγμένου H 2 O έως τελικό όγκο 1000ml, PH: 7,4

Σύνθεση ρυθμιστικών διαλυμάτων (συνέχεια…) Ανθρακικό διάλυμα Διάλυμα διαιθανολαμίνης Na 2 CO g Διαιθανολαμίνη 97ml NaHCO g H 2 O 800ml NaN g NaN 3 0.2g Προσθήκη απεσταγμένου H 2 O έως τελικό όγκο 1000ml + ΗCl pH 9.6 Προσθήκη απεσταγμένου H 2 O έως τελικό όγκο 1000ml + ΗCl pH 9.8

Διάταξη πλάκας πολυστυρενίου A BB CY DY EΘ F G H

Προετοιμασία των δειγμάτων  ομογενοποίηση φυτικού ιστού με PBS-Tween-PVP  1/10  παραμονή δειγμάτων στους 4ºC

Περιγραφή των σταδίων της μεθόδου ELISA Α. Στάδιο Προσρόφηση των αντισωμάτων (IgG) στην πλάκα 1. Προσθήκη 200 μl/κυψελίδα ανθρακικού ρυθμιστικού διαλύματος και επώαση για 3-6 h στους 37ºC. διαλύματος και επώαση για 3-6 h στους 37ºC. 2. Πλύσιμο της πλάκας: 3 φορές από 5 min με PBS-Tween. Β. Στάδιο Δημιουργία του συμπλόκου αντιγόνο-αντίσωμα. 1. Προσθήκη 190 μl φυτικό δείγμα/κυψελίδα (διάλυμα ομογενοποίησης: PBS-Tween-PVP) και επώαση για 18h ομογενοποίησης: PBS-Tween-PVP) και επώαση για 18h στους 4°C. στους 4°C. 2. Πλύσιμο της πλάκας: 3 φορές από 5 min με PBS-Tween

Περιγραφή των σταδίων της μεθόδου ELISA (συνέχεια…) Γ. Στάδιο Σταθεροποίηση του συζεύγματος πάνω στο σύμπλοκο. 1. Προσθήκη 200 μl/κυψελίδα συζεύγματος (conjugate: διάλυμα PBS-Tween-PVP-ovalbumine) και επώαση για 3-6h στους 37ºC 3-6h στους 37ºC 2. Πλύσιμο της πλάκας: 3 φορές από 5 min με PBS-Tween. Δ. Στάδιο Αποκάλυψη 1. Προσθήκη υποστρώματος 200 μl/κυψ. (διάλυμα διαιθανολαμίνης) και επώαση για 1 – 2 h σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 2. Οπτική εκτίμηση ή αναγνώριση της οπτικής πυκνότητας με τη χρησιμοποίηση ειδικού φωτόμετρου για τη δοκιμή ELISA.

Μετρήσεις  Ύπαρξη μολυσμένων δειγμάτων αλλαγή χρώματος  προσδιορισμός οπτικής πυκνότητας με φωτόμετρο  ανάγνωση σε μ. κύματος 405 nm  1η ανάγνωση: 30 min μετά την επώαση της πλάκας  2η ανάγνωση: 30 min μετά την πρώτη  Καθορισμός ενός οπτικού ορίου ανίχνευσης για κάθε πλάκα άνω του ορίου: μολυσμένο δείγμα άνω του ορίου: μολυσμένο δείγμα

ELISA

Αποτελέσματα Αποτελεσματικότητα μετάδοσης με αφίδες τεσσάρων απομονώσεων του PPV στον ποώδη δείκτη N. benthamiana Αποτελεσματικότητα μετάδοσης με αφίδες τεσσάρων απομονώσεων του PPV στον ποώδη δείκτη N. benthamiana ΑπομονώσειςΕπαναλήψεις Σύνολο φυτών Μετάδοση % PPV-DL ,5 PPV-MK ,5 PPV-B PPV-B

Αποτελέσματα (συνέχεια…) Αποτελεσματικότητα μετάδοσης με αφίδες της απομόνωσης PPV-B18 σε ξυλώδεις δείκτες ΞενιστήςΕπαναλήψεις Σύνολο φυτών Αριθμός μολυνθέντων φυτών (%) Ροδακινιά240 4 (10%) Βερικοκιά28 2 (25%)

Συμπεράσματα Τα φυτά εκτέθηκαν σε διαφορετικό αριθμό αφίδων - φορέωνΤα φυτά εκτέθηκαν σε διαφορετικό αριθμό αφίδων - φορέων του ιού του ιού Ανίχνευση PPV με ELISAΑνίχνευση PPV με ELISA  Υψηλή ευαισθησία  Δυνατότητα ανίχνευσης μικρών ποσοτήτων αντιγόνου  Απλή, γρήγορη και εφαρμόσιμη για μαζική ανίχνευση φ. δειγμάτων δειγμάτων Ανίχνευση ιού σε ροδακινιά και βερικοκιά 3η εβδομάδα μετά τα πειράματα Ανίχνευση ιού σε ροδακινιά και βερικοκιά 3η εβδομάδα μετά τα πειράματα

Συμπεράσματα (συνέχεια…) N. benthamiana Μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα μετάδοσης οι φυσικέςΜεγαλύτερη αποτελεσματικότητα μετάδοσης οι φυσικές απομονώσεις PPV-MK (16,5%) και PPV-DL (14,5%) απομονώσεις PPV-MK (16,5%) και PPV-DL (14,5%) Μεταλλαγμένες απομονώσεις:Μεταλλαγμένες απομονώσεις: PPV-B18 (11%) PPV-B2 (μηδενικό ποσοστό) PPV-B18 (11%) PPV-B2 (μηδενικό ποσοστό) Ξυλώδεις δείκτες Μόλυνση ροδακινιάς και βερικοκιάς με PPV-B18 (μεγάλη αποτελεσματικότητα σε βερικοκιά - 25%)Μόλυνση ροδακινιάς και βερικοκιάς με PPV-B18 (μεγάλη αποτελεσματικότητα σε βερικοκιά - 25%) Επιβεβαίωση της ευπάθειας της βερικοκιάς με χρησιμοποίηση μεγαλύτερου αριθμού φυτώνΕπιβεβαίωση της ευπάθειας της βερικοκιάς με χρησιμοποίηση μεγαλύτερου αριθμού φυτών

Ευχαριστώ πολύ