Environmental sampling for Listeria monocytogenes control in food processing facilities reveals three contamination scenarios Food Control 51 (2015): Meryem Muhterem-Uyar a, b, Marion Dalmasso c, Andrei Sorin Bolocan d,Marta Hernandez e, Anastasia E. Kapetanakou f, Tomas Kuchta g, Stavros G. Manios f,Beatriz Melero e, Jana Minarovicova g, Anca Ioana Nicolau d, Jordi Rovira e,Panagiotis N. Skandamis f, Kieran Jordan c, David Rodríguez-Lazaro e, Beatrix Stessl a,Martin Wagner a a Institute of Milk Hygiene, Milk Technology, and Food Science, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Veterin€arplatz 1, A-1210 Vienna, Austria b Department of Nutritional Sciences, Faculty of Life Sciences, University of Vienna, Althanstraße 14, 1090 Vienna, Austria c Teagasc Food Research Centre, Moorepark, Fermoy, Co. Cork, Ireland d Faculty of Food Science and Engineering, Dunarea de Jos University of Galati, str. Domnesca 47, , Galati, Romania e University of Burgos, Department of Biotechnology and Food Science, Hospital del Rey, s/n, Burgos, Spain f Agricultural University of Athens, Iera odos 75, , Athens Greece g VUP Food Research Institute, National Agricultural and Food Centre, Priemyselna 4, SK Bratislava, Slovak Republic Προσαρμογή: Α. Μπατρίνου 1

1. Περίληψη εργασίας H Listeria monocytogenes διεισδύει σε μονάδες επεξεργασίας τροφίμων μέσω του περιβάλλοντος ή από επιμολυσμένες πρώτες ύλες. Η έρευνα αυτή έγινε για να κατανοηθεί καλύτερα η περιβαλλοντική επιμόλυνση σε μονάδες επεξεργασίας κρέατος και σε γαλακτοκομικές μονάδες. Συνεργάστηκαν 6 Eυρωπαικά επιστημονικά ινστιτούτα. Εγινε δειγματοληψία από 12 διαφορετικά περιβάλλοντα επεξεργασίας τροφίμων (FPE=Food Processing Εnvironments) σε 6 διαφορετικές χώρες με μία εναρμονισμένη μεθοδολογική προσέγγιση. 2

Επιλέχθηκαν 6 υποτιθέμενα μη επιμολυσμένα περιβάλλοντα με L. monocytogenes (uncontaminated(UC) FPEs) δηλαδή δεν είχαν καταγραφεί κρούσματα μέχρι την στιγμή της έρευνας και 6 επιμολυσμένα περιβάλλοντα (contaminated (C) FPEs). Ο σκοπός της μελέτης ήταν να τονιστεί ότι FPEs που θεωρούνται για χρόνια ως μη επιμολυσμένα, μπορούν επίσης να μολυνθούν από L. monocytogenes. Επαναλαμβανόμενες δειγματοληψίες από το περιβάλλον μπορούν να βοηθήσουν στον εντοπισμό των πηγών επιμόλυνσης. 3

Από ένα σύνολο 2242 FPE δειγμάτων, η L. monocytogenes ήταν παρούσα σε 32% και 8.8% των μονάδων επεξεργασίας κρέατος και γάλακτος αντίστοιχα. Στην παρούσα εργασία κάθε FPE ήταν επιμολυσμένο με L. monocytogenes σε τουλάχιστον μία περίπτωση δειγματοληψίας Τρία σενάρια επιμόλυνσης παρατηρήθηκαν: (i) σποραδική επιμόλυνση στο σημείο επαφής υποδοχής πρώτων υλών και περιοχών υγιεινής (ii) επιμόλυνση σημείων υψηλού κινδύνου (hot spot contamination) στις περιοχές υγιεινής επεξεργασίας (iii) διάχυτη επιμόλυνση σε όλο το FPE. 4

Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι τα βακτήρια L. monocytogenes είναι κοινοί εποικιστές των FPEs στις Ευρωπαικές μονάδες που μελετήθηκαν και ότι υπάρχει ένα συνεχές ρίσκο διασταυρούμενης επιμόλυνσης. Για την αποφυγή επιμόλυνσης σε τρόφιμα, μία προσέγγιση αξιολόγησης ρίσκου θα έπρεπε να ορίσει επίπεδα ρίσκου σε κρίσιμες περιοχές ελέγχου (critical control areas (CCAs) ) και να προσδιορίσει εκείνες όπου η διασταυρούμενη επιμόλυνση θα έπρεπε ουσιαστικά να αποκλειστεί. 5

2. Εισαγωγή Η μετάδοση της Listeria monocytogenes μέσω των τροφίμων επιδρά σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς, έγκυες γυναίκες και ηλικιωμένους καταλήγοντας σε υψηλά ποσοστά θνητότητας (20-30%). Η κατανάλωση καπνιστών ψαριών, ζυμωμένων και μαγειρεμένων κρεάτων, πουλερικών και γαλακτοκομικών είναι οι πιο συχνές αιτίες λιστερίωσης. 6

Η L. monocytogenes ως σαπροφυτική είναι παρούσα σε FPEs Ρήξεις στις φραγές υγιεινής και μη ορθές πρακτικές υγιεινής συμβάλλουν στην επιμόλυνση με L. monocytogenes των μονάδων επεξεργασίας τροφίμων και εξάπλωση της μέσω επιμολυσμένων υλικών, επιφανειών, προσωπικού και των διαδρομών και μετακινήσεων τους. Οι διαχειριστές των επιχειρήσεων τροφίμων (Food business operators (FBOs)) που παράγουν ready-to-eat foods θα πρέπει να ελέγχουν τους χώρους και τον εξοπλισμό για την παρουσία/απουσία L. monocytogenes 7

3. Υλικά και Μέθοδοι Δειγματοληψία σε 12 FPEs σε 6 Ευρωπαικές χώρες (Αυστρία, Ιρλανδία, Ισπανία, Σλοβακία, Ελλάδα και Ρουμανία) από τον Μάρτιο 2012 ως τον Μάρτιο Είχε καταγραφεί το ιστορικό επιμόλυνσης με L. monocytogenes σε αυτές τις μονάδες και είχαν κατηγοριοποιηθεί σε – Μη επιμολυσμένες, uncontaminated (UC)- FPEs ή – Επιμολυσμένες, contaminated (C)-FPEs. Η επιλογή των FPEs ανάλογα με την προηγούμενη ή όχι επιμόλυνση τους έγινε για να αξιολογηθεί η δυναμική επιμολύνσεων σε ένα «θετικό σε επιμολύνσεις» FPE, ή αν ένα αρνητικό FPE θα μπορούσε να παραμείνει αρνητικό στην διάρκεια των 12 μηνών της έρευνας. Τα FPEs ήταν 4 μικρές φάρμες παραγωγής τυριού, 5 βιομηχανικές γαλακτοκομικές μονάδες και 3 παραγωγοί κρέατος. 8

– Οι βιομηχανικές μονάδες τυριού (Αυστρία, Ελλάδα, και Ισπανία) και οι παραγωγοί κρέατος στην Ρουμανία επεξεργαζόντουσαν πρώτες ύλες από τουλάχιστον 2 διαφορετικές ζωικές πηγές – Οι 4 μικρές φάρμες παραγωγής τυριού, ένα σφαγείο πτηνών και οι παραγωγοί κρέατος επίσης ετοίμαζαν RTE food (Ready to Eat) χωρίς θερμική επεξεργασία. – 6 παραγωγοί τυριού στην Ιρλανδία, Αυστρία, Ελλάδα, Ισπανία παράγουν τυριά μαλακά, ημι-μαλακά, σε άλμη, και σκληρά τυριά με ελάχιστο χρόνο κατανάλωσης 2 ή 3 εβδομάδες. 9

10

Δειγματοληψία 4 επισκέψεις ανά UC-FPE ή C-FPE, κάθε 3 ή 4 μήνες Δείγματα από όλο το FPE ανάλογα με το μέγεθος του FPE (μικρά FPEs, 500m 2 ). Ελάχιστος αριθμός 15 δειγμάτων ανά ημέρα δειγματοληψίας 11

Ελέγχθηκαν επιφάνειες που δεν έρχονται σε επαφή με τρόφιμα (Non-food contact surfaces (NFCS), πατώματα, τοίχοι, αποχετεύσεις) και επιφάνειες που έρχονται σε επαφή με τρόφιμα (FCS; μεταφορείς, ζώνες, τραπέζια, μηχανήματα κοπής σε φέτες, καλούπια, και μαχαίρια) 12

Ανάλυση δειγμάτων Όλα τα δείγματα διατηρήθηκαν στους 4 ο C κατά την μεταφορά στο εργαστήριο και αναλύθηκαν μέσα σε 24 h. Όλα τα δείγματα (swabs, υγρά, και στερεά) αναλύθηκαν σύμφωνα με το πρότυπο ISO protocol (ISO, 1996,Amendment 2004). 13

Μέχρι 5 αποικίες L. monocytogenes απομονώθηκαν από τα εκλεκτικά άγαρ (ALOA, Palcam) και ανακαλλιεργήθηκαν σε Tryptone soy agar με 0.6% (wt/vol) yeast extract (TSAY; Oxoid Ltd., Basingstoke, UK). Επιπλέον επιβεβαίωση έγινε με μέθοδο PCR Στατιστική επεξεργασία αποτελεσμάτων 14

Αποτελέσματα 2242 περιβαλλοντικά δείγματα αναλύθηκαν συνολικά Η συχνότητα της L. monocytogenes ήταν 12.6% ((n=282); 8.8% στις γαλακτοκομικές και 32% στις μονάδες παραγωγής κρέατος). Από τα 2242 δείγματα το 3.5% (n=78) και 9.1% (n=204) ήταν θετικά δείγματα από FCS και NFCS αντίστοιχα. Η εκτεταμένη δειγματοληψία έδειξε ότι όλα τα FPEs που ήταν χαρακτηρισμένα ως μη επιμολυσμένα, είχαν επιμολυνθεί σε τουλάχιστον μία περίπτωση δειγματοληψίας. 2 UC-FPEs και 3 C-FPEs ήταν επιμολυσμένα σε κάθε περίπτωση δειγματοληψίας (Tables 2 and 3). 15

Στα τυροκομεία η συχνότητα της L. monocytogenes ήταν μεταξύ 1.3% και 6.4%. Η υψηλότερη παρουσία καταγράφηκε σε ένα περιβάλλον UC-FPE. Στις βιομηχανίες παραγωγής τυριού η συχνότητα L. monocytogenes ήταν %, εκτός από μία μονάδα που είχε θετικά δείγματα και στις 4 δειγματοληψίες (μέση επιμόλυνση 26%) και η επιμόλυνση ήταν διάχυτη σε όλη την μονάδα. 16

Στις 3 μονάδες επεξεργασίας κρέατος, η επιμόλυνση L. monocytogenes ήταν 18.8%, 26.5% και 50.5%, (UC- FPE in Romania, C-FPE in Romania and the C-FPE in Spain). Η υψηλότερη επιμόλυνση (50.5%) ήταν όταν η σφαγή και η επεξεργασία του κρέατος διεξάγονταν στο ίδιο κτίριο (Tables 2 and 3). Οι NFCS μίας C- FPE (Austrian cheese producer) και οι FCS και NFCS των C-FPE μονάδων επεξεργασίας κρέατος (Ρουμανία και Ισπανία) ήταν σημαντικά υψηλότερα επιμολυσμένες με L. monocytogenes. 17

Επιβεβαιώθηκαν 3 σενάρια επιμόλυνσης: (i)σποραδική επιμόλυνση στο σημείο επαφής μη καθαρών περιοχών (υποδοχή πρώτων υλών) και καθαρών περιοχών: – Στα UC-FPE Slovakia, C-FPE Slovakia, UC-FPE Greece, and UC- FPE Austria, όπου η επιμόλυνση βρέθηκε μία φορά και συχνά εντοπίστηκε στην αρχή της αλυσίδας επεξεργασίας. – Ηταν φανερή η σημαντική επίδραση της διασταυρούμενης επιμόλυνσης (cross-contamination) με L. monocytogenes από το εσωτερικό και εξωτερικό περιβάλλον εξαιτίας της έλλειψης φραγών υγιεινής στα σημεία επαφής μη καθαρών περιοχών (υποδοχή πρώτων υλών) και καθαρών περιοχών στις φάρμες παραγωγής τυριού και σε 2 μικρομεσαίες γαλακτοκομικές μονάδες. 18

(ii) επιμόλυνση σημείων υψηλού κινδύνου (hot spot contamination) στις περιοχές υγιεινής επεξεργασίας: Στα C-FPE Ireland, UC-FPE Spain, C-FPE Greece, UC-FPE Romania, όπου η επιμόλυνση ήταν σε συγκεκριμένα σημεία τα οποία ήταν L. monocytogenes θετικά σε πολλές επαναλήψεις. Τα L. monocytogenes hot spots βρέθηκαν σε 4 μονάδες σε διαφορετικά στάδια επεξεργασίας: – στην περιοχή παραγωγής φρέσκου τυριού, – στο δωμάτιο ωρίμανσης τυριού (both Greek C-FPE), – στο δωμάτιο διαμόρφωσης σε καλούπια – στο δωμάτιο αποστολής (both Irish C-FPE). – Στην άλμη (Spanish UC-FPE). I – Σε ένα παραγωγό κρέατος στην Ρουμανία ένα hotspot ήταν στο δωμάτιο που το κρέας τεμαχιζόταν. 19

(iii) διάχυτη επιμόλυνση σε όλο το FPE: στα UCFPE Ireland, C-FPE Romania, C-FPE Austria, και C-FPE Spain. είχαν και επιπλέον αδύνατα σημεία στην υγιεινή που μπορεί να βοήθησαν στην εξάπλωση της επιμόλυνσης όπως: – να μην έχουν τα δωμάτια αποθήκευσης και ωρίμανσης προιόντων σε ένα καθημερινό καθεστώς καθαρισμού, – Η έλλειψη των διαδρομών one-way για το προσωπικό στις κεντρικές περιοχές επεξεργασίας – Υπολείματα τροφίμων σε μηχανήματα, πατώματα και αποχετεύσεις. 20

Ελεγχος των τελικών προιόντων των μονάδων Από 1446 δείγματα τροφίμων που ελέγχθηκαν, τα 62 (4.3%) ήταν θετικά για L. monocytogenes (2.9% στις γαλακτοκομικές και 26.2% στις μονάδες κρέατος). Δείγματα κρέατος από τα σφαγεία είχαν την υψηλότερη συχνότητα L. monocytogenes (87.5%), και τα τυριά και προιόντα κρέατος είχαν 20-25%. Δείγματα από 2 τυροκομικές μονάδες που είχαν χαρακτηριστεί ως UC-FPE, ήταν θετικά για L. monocytogenes( 25% and 10.9%). Η ευρεία εξάπλωση L. monocytogenes σε NFCS μίας γαλακτοκομικής μονάδας (26%) και μίας μονάδας κρέατος(18.9%) δεν κατέληξε σε υψηλότερα ποσοστά επιμόλυνσης στα τρόφιμα (2.2% και 0% θετικά αποτελέσματα, αντίστοιχα) 21

Σχηματική αναπαράσταση 1.του συνόλου των χώρων επεξεργασίας κάθε μονάδας 2.των διαδρομών μετακίνησης πρώτων υλών και προσωπικού (κόκκινα βέλη) 3. των χώρων που θεωρούνται υψηλής υγιεινής (hygienic areas) 4.Των σημείων που βρέθηκαν θετικά για Listeria monocytogenes σε έστω και μία από τις 4 επισκέψεις δειγματοληψίας (γαλάζια πλαίσια) 22

23

24

25

26

27

28

29

Μία πιθανή πηγή επιμόλυνσης L. monocytogenes του FPE στις φάρμες παραγωγής τυριού (διακυμάνθηκε από 1.3 σε 6.4%) μπορεί να είναι το εξωτερικό περιβάλλον Στις βιομηχανικές μονάδες παραγωγής τυριού όπου τα ζώα δεν εκτρέφονται στο ίδιο οικοδομικό συγκρότημα έχει δειχθεί ότι η εξωτερική επιμόλυνση είναι σχεδόν μηδενική 30

Τα δεδομένα αυτής της μελέτης επιβεβαιώνουν την γενική υπόθεση ότι η συχνότητα της L.monocytogenes είναι υψηλότερη στις μονάδες επεξεργασίας κρέατος ( %) σε σύγκριση με τις περισσότερες γαλακτοκομικές μονάδες( %) 31

Συστάσεις για αποφυγή επιμόλυνσης τύπου Σεναρίου 1 (σποραδική επιμόλυνση) Σε αυτή την περίπτωση χρειάζεται εφαρμογή βασικών κανόνων υγιεινής, όπως αποτελεσματική απολύμανση χεριών και παπουτσιών και την εγκατάσταση ασφαλιστικών δικλείδων υγιεινής (φραγμούς υγιεινής) για την μείωση της επιμόλυνσης L. monocytogenes από το εξωτερικό περιβάλλον. Για την μείωση του ρίσκου σποραδικής επιμόλυνσης με L. monocytogenes πρέπει επίσης να αυξηθεί ο έλεγχος για πιθανό σχηματισμό biofilm στον εξοπλισμό επεξεργασίας γάλακτος. Μπορεί να αναπτυχθούν στα βιοφιλμ πολλά διαφορετικά στελέχη L. monocytogenes ικανά να αναπαράγονται κατά την διάρκεια των διαφόρων σταδίων επεξεργασίας. 32

Συστάσεις για αποφυγή επιμόλυνσης τύπου Σεναρίου 2 (hot spot επιμόλυνση) Μη συχνή και ανεπαρκής δειγματοληψία θα μπορούσε εύκολα να παραλείψει hot spots. Εξηγείται και γιατί σε πολλά περιστατικά επιμόλυνσης, δεν μπορούσε να εντοπιστεί η διαδρομή της επιμόλυνσης 33

Συστάσεις για αποφυγή επιμόλυνσης τύπου Σεναρίου 3 (διάχυτη επιμόλυνση) Η επιμόλυνση με L. monocytogenes σε ολη την εγκατάσταση είναι σημαντικό πρόβλημα σε γρήγορα αναπτυσσόμενες επιχειρήσεις, με πολλές παραγγελίες, που βρίσκονται σε συνεχή αναδιοργάνωση, έχουν υψηλά ποσοστά μετακίνησης προσωπικού (απολύσεις, προσλήψεις) και πολύπλοκο τρόπο διακίνησης προιόντων. Στα ευρέως επιμολυσμένα FPEs η υψηλή επιμόλυνση L. monocytogenes σε τοίχους, πατώματα και αποχετεύσεις οδήγησε σε «διασυνοριακή» διάχυση σε όλους τους χώρους υγιεινής, συμπεριλαμβανομένων και των εξαρτημάτων για μεταφορά τροφίμων (πχ. καρότσια, κουτιά, ταινίες μεταφοράς, και περονοφόρων οχημάτων) 34

O εντοπισμός της πηγής επιμόλυνσης θεωρείται πολύ δύσκολος σε αυτές τις περιπτώσεις. Σε περίπτωση αντίστασης, η χρήση ενός μόνο απολυμαντικού μπορεί να οδηγήσει σε ευρεία εξάπλωση της L. monocytogenes. Επομένως πρέπει να εναλλάσσονται όξινα και αλκαλικά απολυμαντικά στις σωστές συγκεντρώσεις και χρόνους έκθεσης σε όλη την αλυσίδα παραγωγής. 35

Σε όλα τα FPEs που ήταν ευρέως επιμολυσμένα, ενώ η απολύμανση εφαρμοζόταν σε καθημερινή βάση όπως αναφέρθηκε από την ομάδα διαχείρισης ποιότητας (quality management team (QMT)), η επιμόλυνση από L. monocytogenes στο FPE δεν εξαλείφθηκε. Σε αυτές τις περιπτώσεις η QMT θα πρέπει να αναπτύξει ένα πρόγραμμα απολύμανσης και υγιεινής, βήμα προς βήμα, που να μειώνει το φορτίο της επιμόλυνσης. Ενα τέτοιο πρόγραμμα θα πρέπει να ορίσει κρίσιμα σημεία ελέγχου (CCAs) που θα είναι τα πρώτα που θα χρειάζονται αποτελεσματική απολύμανση. 36

Συμπεράσματα Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι τα βακτήρια L. monocytogenes είναι κοινοί εποικιστές των FPEs στις Ευρωπαικές μονάδες που μελετήθηκαν και ότι υπάρχει ένα συνεχές ρίσκο διασταυρούμενης επιμόλυνσης είτε σε φάρμες παραγωγής γαλακτοκομικών, είτε σε μεγαλύτερες μονάδες παραγωγής. Η L. monocytogenes ανιχνεύτηκε σε κάθε FPE που μελετήθηκε με μεγάλη διακύμανση στην συχνότητα εμφάνισης ανάλογα με την μονάδα. Η επίγνωση του τύπου επιμόλυνσης σε κάθε FPE, όπως περιγράφηκε σε αυτή την μελέτη, θα μπορούσε να διευκολύνει την καλύτερη στόχευση ενεργειών εξυγίανσης και την εφαρμογή διορθωτικών δράσεων. Για την αποφυγή επιμόλυνσης σε τρόφιμα, μία προσέγγιση αξιολόγησης ρίσκου θα έπρεπε να ορίσει επίπεδα ρίσκου σε κρίσιμες περιοχές ελέγχου (critical control areas (CCAs) ) και να προσδιορίσει εκείνες όπου η διασταυρούμενη επιμόλυνση θα έπρεπε ουσιαστικά να αποκλειστεί. Οι ομάδες FBOs και το προσωπικό πρέπει να ενημερώνεται υποχρεωτικά για τις ορθές πρακτικές υγιεινής και οι γνώσεις τους να αξιολογούνται με ερωτηματολόγια. 37

Ερωτήσεις Γιατί η ερευνητική ομάδα μελέτησε σε κάθε χώρα μία προηγουμένως μη επιμολυσμένη μονάδα και μία επιμολυσμένη; Ποιες μονάδες εμφάνισαν τα μεγαλύτερα ποσοστά επιμόλυνσης (επεξεργασίας κρέατος ή γάλακτος); Που μπορεί να οφείλεται αυτή η διαφορά; Ποιές είναι οι συστάσεις της ερευνητικής ομάδας στις περιπτώσεις α) σποραδικής και β) διάχυτης επιμόλυνσης από L. monocytogenes; Κατανόηση και ανάλυση των πινάκων 2 και 3 38