ηλεκτροφόρηση

ηλεκτροφόρηση – βασικές γνώσεις 1 από 5 Η ηλεκτροφόρηση αναφέρεται στη μετακίνηση κάθε υλικού στοιχείου που φέρει ηλεκτρικό φορτίο, όταν βρίσκεται υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου.

ηλεκτροφόρηση – βασικές γνώσεις 2 από 5 Οι πρωτείνες είναι αμφολύτες. Αυτό σημαίνει ότι παρουσιάζουν θετικό ή αρνητικό φορτίο ανάλογα με το pH του διαλύματος στο οποίο βρίσκονται.

ηλεκτροφόρηση – βασικές γνώσεις 3 από 5 Η αιμοσφαιρίνη (Hb) είναι μια πρω-τείνη του αίματος και έτσι μπορούμε θεωρητικά και πρακτικά να την βά-λουμε σε ένα ηλεκτρικό πεδίο και να την ηλεκτροφορήσουμε. Κατά την ηλεκτροφόρηση της Hb οι διάφοροι τύποι (A1, A2, F ,S) “τρέχουν» με διαφορετική ταχύτητα και έτσι διαχωρίζονται.

ηλεκτροφόρηση – βασικές γνώσεις 4 από 5 Με τον όρο «τρέχει» εννοούμε την μετακίνηση των πρωτεϊνικών μορίων πάνω στο υλικό – υπόστρωμα που χρησιμοποιούμε (ταινίες οξικής κυτταρίνης ή cellogel) H ταχύτητα είναι ανάλογη με το Μ.Β.και το φορτίο κάθε κλάσματος.

ηλεκτροφόρηση – βασικές γνώσεις 5 από 5 Η όλη διαδικασία εκτελείται μέσα σε ρυθμιστικό διάλυμα (buffer) με pH=8,9 δηλαδή αλκαλικό οπότε η αιμοσφαιρίνη αποκτά αρνητικό φορτίο και όταν βρεθεί σε ηλεκτρικό πεδίο μετακινείται προς την άνοδο. Η τεχνική μπορεί να γίνει και σε όξινο buffer με αντίστοιχη μετακίνηση προς την κάθοδο.

ηλεκτροφόρηση – υλικά 1 από 2 τα βασικά μέρη μιας συσκευής ηλεκτροφόρησης είναι τα εξής: το λεκανίδιο – λουτρό το τροφοδοτικό

ηλεκτροφόρηση – υλικά 2 από 2 Άλλες συσκευές που χρειάζονται για μια ηλεκ-τροφόρηση είναι: Διανομέας του δείγματος. Χρειάζεται για την τοποθέ-τηση συγκεκριμένης ποσότητας δείγματος στο ηλεκ-τροφορητικό υλικό (ταινία) με όσο το δυνατόν πε-ρισσότερη ακρίβεια. Λεκανίδια ειδικά για τον χρωματισμό και αποχρωμα-τισμό της ταινίας. Στεγνωτήριο ταινιών Scanner (Σαρωτής) για την επεξεργασία των αποτε-λεσμάτων. Τα υλικά αυτά είναι προαιρετικά αλλά απα-ραίτητα για ένα ακριβέστερο αποτέλεσμα.

ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των αιμοσφαιρινών (σε αλκαλικό pH) Από τις αιμοσφαιρίνες η πιο γρήγορη είναι η HbH, ακολουθεί η HbΑ, λίγο πιο αργή είναι η HbF, και η πιο αργή όλων είναι η HBA2. Κοντά στην HbA2 εμφανίζονται διάφορες παθολογικές αιμοσφαιρίνες και κυρίως η HbS (δρεπανοκυταρική αναιμία).

ηλεκτροφόρηση - πορεία 1 από 14 Επιλέγουμε προσεκτικά τη μέθοδο που θα ακολουθήσουμε η οποία εξαρτάται από τον εξοπλισμό που διαθέτει το εργαστήριο (κατασκευαστής, ηλεκτροφορητικό υλικό, κ.α). Διαβάζουμε και ακολουθούμε προσεκτικά τις οδηγίες χρήσης του κατασκευαστή της μεθόδου.

ηλεκτροφόρηση - πορεία 2 από 14 Ετοιμάζουμε όλα τα αντιδραστήρια με μεγάλη ακρίβεια. Η προετοιμασία του ηλεκτροφορητικού μέσου (αγαρόζη ή οξική κυτταρίνη) γίνεται με σχολαστικότητα σύμφωνα με τις οδηγίες. Γεμίζουμε ίσες ποσότητες ρυθμιστικού διαλύματος στις 2 πλευρές του λεκανιδίου. Άνοδος + Κάθοδος -

ηλεκτροφόρηση - πορεία 3 από 14 Τοποθετούμε το δείγμα (αιμόλυμα) πάνω στην ταινία με τη βοήθεια του διανομέα. Ο διανομέας είναι μια συσκευή που μας βοηθάει να τοποθετούμε κάθε φορά την ίδια ποσότητα δείγματος και ομοιόμορφα. Το δείγμα μπαίνει πάντα από τη μεριά της καθόδου (-).

ηλεκτροφόρηση - πορεία 4 από 14 Στερεώνουμε την ταινία στις ειδικές υποδοχές φροντίζοντας να είναι βυθισμένα και τα δύο άκρα στο ρυθμιστικό διάλυμα.

ηλεκτροφόρηση - πορεία 5 από 14 Συνδέουμε με το τροφοδοτικό. Μια ματιά στο εγχειρίδιο χρήσης του μηχανήματος είναι πάντα χρήσιμη για τη ρύθμιση των παραμέτρων της ηλεκτροφόρησης (Volts, Ampers κ.α)

ηλεκτροφόρηση - πορεία 6 από 14

ηλεκτροφόρηση - πορεία 7 από 14 Αφήνουμε το ρεύμα να περάσει για όση ώρα λένε οι οδηγίες. Βγάζουμε την ταινία και την περνάμε από όλα τα στάδια χρωματισμού και αποχρωματισμού χρησιμοποιώντας τα ειδικά λεκανίδια.

ηλεκτροφόρηση - πορεία 8 από 14 Το τελικό αποτέλεσμα είναι κάπως έτσι:

ηλεκτροφόρηση - πορεία 9 από 14 Το αποτέλεσμα της ηλεκτροφόρησης δίνεται ως η εκατοστιαία (%) αναλο-γία των επιμέρους κλασμάτων που εμφανίστηκαν στην ηλεκτροφόρηση. Ένας φυσιολογικός ενήλικας έχει 97,5% HbA και 1,5 – 3,5% HbA2 και 0 – 2% HbF (εμβρυϊκή). Ένα φυσιολογικό νεογνό έχει 60 – 90% HbF και το υπόλοιπο HbA2

ηλεκτροφόρηση - πορεία 10 από 14 Για να υπολογίσουμε την % αναλογία του κάθε κλάσματος εργαζόμαστε ως εξής: Ετοιμάζουμε σειρά δοκιμαστικών σω-λήνων όσα είναι τα κλάσματα που διαχωρίστηκαν + 1 ακόμα που θα το χρησιμοποιήσουμε σαν Τυφλό. Βάζουμε σε όλα τα σωληνάρια 1 ml διαλύματος έκλουσης.

ηλεκτροφόρηση - πορεία 11 από 14 Διαχωρίζουμε προσεκτικά σε ίσα μεγέθη τα κλάσματα με ένα ψαλίδι. Υστερα κόβουμε ένα, ίσων διαστάσεων, κομμάτι διαυγούς ταινίας (χωρίς κλάσμα αιμοσφαιρίνης).

ηλεκτροφόρηση - πορεία 12 από 14 Βυθίζουμε μέσα στο διάλυμα των σωλη-ναρίων με λαβίδα ένα – ένα τα κομμάτια της ταινίας σημειώνοντας στα σωληνάρια τα κλάσματα που έχουμε βάλει. Στο σωληνάριο με την ένδειξη Τ βάζουμε το διαυγές κομμάτι της ταινίας, το οποίο θα χρησιμοποιήσουμε για μηδενισμό του φωτομέτρου. Ανακινούμε τα σωληνάρια για 15 λεπτά μέχρι να διαλυθεί τελείως η ταινία.

ηλεκτροφόρηση - πορεία 13 από 14 Η ένταση του χρώ-ματος του κάθε σωληναρίου είναι ανάλογη του ποσού της αιμοσφαιρίνης κάθε κλάσματος. Μηδενίζουμε με το Τυφλό και φωτομε-τρούμε όλα τα σω-ληνάρια σε λ = 540 nm.

ηλεκτροφόρηση - πορεία 14 από 14 Υπολογίζουμε το % ποσοστό κάθε κλάσματος εφαρμόζοντας τον τύπο: % ποσοστό κλάσματος = απορρόφηση κλάσματος / άθροισμα απορροφήσεων όλων των κλασμάτων * 100. Εάν διαθέτουμε ένα ειδικό μηχάνημα που λέγεται scanner (σαρωτής) τότε το αποτέλεσμα δίνεται αυτόματα σε ποσοστό καθώς και σε γραμμικό διάγραμμα.