Aπομόνωση DNA από επιθηλιακά κύτταρα παρειάς

Παρουσίαση με θέμα: "Aπομόνωση DNA από επιθηλιακά κύτταρα παρειάς"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Aπομόνωση DNA από επιθηλιακά κύτταρα παρειάς

2 1. Συλλογή κυττάρων Γεμίζουμε το πλαστικό ποτήρι με 15 mL ισοτονικό αναψυκτικό (τύπου POWERADE, με μπλε χρωστική) ή εμφιαλωμένο νερό. Ξύνουμε το βλεννογόνο των παρειών με την πλαστική ράβδο ή τη μπατονέττα (αποστειρωμένη) ή το γλωσσοπίεστρο (αποστειρωμένο) για 30s-1min αποφεύγοντας την κατάποση. Εναλλακτικά ξύνουμε χρησιμοποιώντας το πεπλατυσμένο άκρο μιας οδοντογλυφίδας. Η ποσότητα DNA που θα παραλάβουμε στο τέλος της πειραματικής διαδικασίας εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από την επιμέλεια στη διαδικασία αυτού του βήματος. Βάζουμε το αναψυκτικό ή το νερό στη στοματική κοιλότητα και το κρατάμε κάνοντας κινήσεις ξεπλύματος για 30-60s (για να αυξηθεί η ποσότητα των κυττάρων που θα συλλέξουμε).

3

4 2. Αποικοδόμηση κυτταρικών πρωτεϊνών
Ρίχνουμε στο ποτήρι 5 ml υγρό καθαρισμού φακών και αναδεύουμε ήπια

5 2. Αποικοδόμηση κυτταρικών πρωτεϊνών με επίδραση πρωτεολυτικών ενζύμων
Επειδή το DNA είναι τυλιγμένο σε πρωτεΐνες (ιστόνες) είναι απαραίτητη η απομάκρυνση αυτών των πρωτεϊνών για να ληφθεί ένα εκχύλισμα DNA μεγαλύτερης καθαρότητας. Για να αποδιαταχθούν οι ιστόνες, μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε πρωτεολυτικά ένζυμα (πρωτεάσες).

6 Στο εργαστήριο Χρησιμοποιείται η πρωτεϊνάση Κ για την αποικοδόμηση των πρωτεϊνών και την αδρανοποίηση των νουκλεασών. H πρωτεϊνάση Κ είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την απομόνωση DNA στο εργαστήριο γιατί μετά την προσθήκη της στο διάλυμα απενεργοποιεί αμέσως τις ενδογενείς νουκλεάσες (DNAσες) του κυττάρου που μπορεί να κατακερματίσουν το DNA

7 2. Αποικοδόμηση κυτταρικών πρωτεϊνών με επίδραση πρωτεολυτικών ενζύμων
Εναλλακτικά χρησιμοποιούμε χυμό ανανά. Ο χυμός του ανανά περιέχει το ένζυμο βρωμελαΐνη, μια πρωτεάση που φυσιολογικά αποικοδομεί τις πρωτεΐνες στα επιμέρους αμινοξέα.

8 3. Λύση των κυτταρικών μεμβρανών
Προσθέτουμε 1mL διαλύματος υγρού σαπουνιού και ανακινούμε ήπια για ομογενοποίηση του μίγματος Το απορρυπαντικό πιάτων χρησιμεύει για τη λύση των κυτταρικών μεμβρανών και των μεμβρανών του πυρήνα για την απελευθέρωση του DNA στο διάλυμα.

9 Στο εργαστήριο Στο εργαστήριο χρησιμοποιoύμε διάλυμα λύσης που περιέχει SDS.

10 3. Λύση των κυτταρικών μεμβρανών
Οι μεμβράνες του κυττάρου είναι λιποπρωτεϊνικής σύστασης. Τα μόρια του λίπους και του απορρυπαντικού έχουν παρόμοια δομή καθώς αποτελούνται από υδρόφιλες κεφαλές και υδρόφοβες ουρές. Έτσι, όταν ένα απορρυπαντικό αλληλεπιδράσει με λίπος, σχηματίζονται σφαιρίδια απορρυπαντικού-λίπους (λόγω της παρόμοιας δομής τους). Το απορρυπαντικό έρχεται σε επαφή με τις μεμβράνες του κυττάρου, συνδέεται με τα λίπη και τις πρωτεΐνες τους και τις καταστρέφει.

11 4. Καταβύθιση πρωτεϊνών και συσσωμάτωση μορίων DNA
Προσθέτουμε 1mL (20 σταγόνες) διαλύματος NaCl Το αλάτι (NaCl) διατηρεί την διπλή έλικα του DNA προφυλάσσοντας τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς Προκαλεί καταβύθιση πρωτεϊνών και υδατανθράκων, επιπλέον παρέχει κατιόντα νατρίου (Na+) τα οποία δεσµευόµενα στα φωσφορικά ιόντα των µορίων του DNA, εξουδετερώνουν το αρνητικό φορτίο τους το οποίο έχει σαν αποτέλεσµα να απωθούνται µεταξύ τους και έτσι επιτρέπεται η συσσωµάτωση των µορίων του DNA.

12 5. Αφήνουμε το ποτήρι για 5 λεπτά στον πάγκο και μεταφέρουμε με προσοχή το διάλυμα σε γυάλινο δοκιμαστικό σωλήνα.

13 Προσθέτουμε 5mL παγωμένης αιθανόλης γυάλινο σωλήνα με προσοχή και υπό κλίση για να δημιουργήσουμε δύο στιβάδες. Αναμένουμε 2-3 min. Εμφανίζονται φυσαλίδες συνδεδεμένες με τις άσπρες ίνες του DNA που περνούν στη φάση της αλκοόλης και ταξιδεύουν προς την κορυφή του σωλήνα.

14 Απομάκρυνση νερού Στην υδατική φάση λόγω του ότι το νερό είναι διπολική ένωση τα μόρια του DNA είναι διαλυμένα, δεδομένου ότι οι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί είναι υδρόφιλοι. Η αλκοόλη αφυδατώνει τα μόρια του DNA. Έτσι συσσωματώνονται και μπορούμε να τα δούμε σαν λεπτά μπερδεμένα ινίδια. 

15 Χρησιμοποιώντας μια πιπέτα Pasteur ή ένα ξύλινο καλαμάκι ανασύρουμε το DNA και το τοποθετούμε σε σωληνάριο eppendorf στο οποίο έχουμε προσθέσει νερό.