 Team : Dong Hwa Kim, Su-Jin Heo, Jung- Woog Shin, and Chi Woong Mun

 ΠΕΡΙΛΗΨΗ  ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΙΣΤΩΝ  ΣΧΕΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΠΟΡΕΙΑΣ ΜΕΛΕΤΗΣ  ΑΝΑΦΟΡΑ ΥΛΙΚΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ  ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ – ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΑ  ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ  ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

 Μελέτη συμπεριφοράς συζευγμένου θερμοευαίσθητου συμπολυμερούς (Pluronic) με ζελατίνη για την χρήση τους στην μηχανική ιστών χόνδρου.  Παρατήρηση διαφορών μεταξύ των υλικών με χρήση χαρακτηρισμών, όπως 1 Η - ΝΜ R,FTIR κ. α.  Παρατήρηση συμπεριφοράς των κυττάρων που θα χρησιμοποιήσουμε για την ανάπτυξη χονδρικού ιστού με το συζευγμένο συμπολυμερές.

Μέθοδος που συνδυάζει ποικιλία βιολογικών & μηχανικών αρχών για την δημιουργία λειτουργικών ιστών και οργάνων, οι οποίες αποκαθιστούν, υποστηρίζουν ή βελτιώνουν την λειτουργία του μη – λειτουργικού ιστού.  Η τεχνολογία της απευθύνεται στην δημιουργία ποικίλων ειδών ιστών, όπως του δέρματος, του χόνδρου, του οστού, του ήπατος, των νεύρων κ των αγγείων.  Η επιτυχία της αναδημιουργίας του ιστού, αποδίδεται σε μεγάλο βαθμό : › στην ικανότητα του ικριώματος για δομική μορφοποίηση › στην βιοδραστικότητα του με τα εμφυτευμένα κύτταρα. › στην ύπαρξη βιολογικού δομημένου 3-D ιστού ως πρότυπο για τον σχεδιασμό της δομής του ικριώματος.

 ΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ( Σ Τ Α Δ Ι Α Ε Φ Α Ρ Μ Ο Γ Η Σ ) › Δημιουργία ικριώματος από κατάλληλο δομικό υλικό. › ΤΟ ΔΟΜΙΚΟ ΥΛΙΚΟ :  ΔΟΜΙΚΗ ΜΟΡΦΟΠΟΙΗΣΗ ( π. χ θερμο - ευαίσθητο )  ΒΙΟΫΛΙΚΟ  ΒΙΟΣΥΜΒΑΤΟ  ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΟ & ΒΙΟΑΠΩΔΟΜΗΣΙΜΟ

3D ΣΥΝΕΣΤΙΑΚΗ ΕΙΚΟΝΑ ΜΕΡΟΥΣ ΙΚΡΙΩΜΑΤΟΣ

ΕΙΚΟΝΕΣ ΑΠΟ SEM, του PLA ικριώματος που εκπονήθηκε από την τεχνική διαχωρισμού φάσης σε 2 διαφορετικές θερμοκρασίες (T) του δ / τη εκχύλισης, (a) T 1 = -18˚C (b) -18˚C <T 2 <25˚C. Τα ένθετα δείχνουν υψηλή μεγέθυνση μικρογραφίας SEM ενός PLA ικριώματος που εκπονήθηκε από τεχνική φάσης διαχωρισμού σε 2 διαφορετικές θερμοκρασίες (T) του δ / τη εκχύλισης. α b

 ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ( Σ Τ Α Δ Ι Α Ε Φ Α Ρ Μ Ο Γ Η Σ ) › Απομόνωση ιστών από τον ασθενή. › Επέκταση των κυττάρων σε κυτταροκαλλιέργειες (in vitro μελέτη ). › Εμφύτευση των κυττάρων μέσα στο ικρίωμα. › Εμφύτευση κατασκευής ικριώματος – κυττάρων στον ασθενή ( κλινικό μέρος ) ως υποκατάστατο ιστού. › Διάλυση ικριώματος, και σύνδεση του νέου ολοκληρωμένου ιστού με αυτούς που τον περιβάλλουν.

Σύζευξη ζελατίνης & μονοκαρβοξυλικού συμπολυμερούς Pluronic (ΜΡ) δίνοντας το προϊόν GP. Χαρακτηρισμός GP μέσω τεχνικών H-NMR & FTIR & Σύγκριση με τα αντιδρώντα υλικά. Επιλογή & προετοιμασία κυττάρων. Καλλιέργεια κυττάρων με το πολυμερές σε θερμοκοιτίδα για 5 ημέρες. Αξιολόγηση βιωσιμότητας των κυττάρων με την μέθοδο MTT. Το GP διαθέτει χρήσιμο 3-D περιβάλλον για χονδροκυτταρική κυτταροκαλλιέργεια.

A. ΘΕΛΩ ΤΟ ΣΥΜΠΟΛΥΜΕΡΕΣ PLURONIC ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟ ΣΤΑ ΑΚΡΑ : › ΕΝΩΣΗ ΜΕ ΑΝΥΔΡΙΤΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΠΟΚΤΗΣΗ ΚΑΡΒΟΞΥΛΙΚΗΣ ΟΜΑΔΑΣ ΣΤΑ ΑΚΡΑ ΤΟΥ. B. ΕΝΩΣΗ ΤΟΥ ΔΡΑΣΤΙΚΟΥ ΜΟΝΟΚΑΡΒΟΞΥΛΙΚΟΥ PLURONIC ΜΕ ΤΗΝ ΖΕΛΑΤΙΝΗ ΥΠΟ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΤΑΛΥΤΗ EDC ΓΙΑ ΤΟΝ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟ crosslinked Pluronic-Gelatin.

 ΧΡΗΣΗ ΑΝΥΔΡΙΤΗ

 Θερμοευαίσθητο & αμφύφιλο συμπολυμερές, συνθετικό hydrogel βιοσυμβατό & μη τοξικό μόριο.  Λόγω της αμφύφιλης φύσης του μπορεί να σχηματίιζει μικύλια.  Οικονομικό, & εμπορικά διαθέσιμο. a : πολυ - όξυ - αιθυλένιο (PEO) - υδρόφυλο Το συμπολυμερές παράγεται b : πολυ - όξυ - προπυλένιο (PPO)- υδρόφοβο από συμπύκνωση του οξειδίου αιθυλενίου & του προπυλενίου. TO ~ 70% ΠΕΡΙΕΧΕΙ ΟΞΕΙΔΙΟ ΑΙΘΥΛΕΝΙΟΥ ΤΟ ΟΠΟΙΟ ΑΝΤΙΠΡΟΣΩΠΕΥΕΙ ΤΗΝ ΥΔΡΟΦΙΛΙΚΟΤΗΤΑ ΤΟΥ Pluronic

 Το Pluronic F-127 είναι πιο διαλυτό σε κρύο Η 2 Ο από ότι σε ζεστό Η 2 Ο και αυτό είναι αποτέλεσμα της αυξημένης διάλυσης και συναρμογής υδρογόνων σε χαμηλές θερμοκρασίες.  Το υδατικό δ / μα του Pluronic F-127 σε 20% ή 30% έχει ενδιαφέρον χαρακτηριστικό της αντίστροφης θερμικής συσσωμάτωσης.  Είναι υγρό σε θερμοκρασίες ψύξης (~ 4-5 ˚C) Είναι gel σε θερμοκρασίες δωματίου (~ 27 ˚C)

 Δικαρβολικό οξύ με 4 C.  Λαμβάνεται με αφυδάτωση 2 μορίων COOH ( απομάκρυνση 1 H2O) σε υψηλή θερμοκρασία. ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ΥΔΡΟΓΟΝΩΣΗΣ ΓΙΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΑΝΥΔΡΙΤΗ.

ΜΟΝΟΚΑΡΒΟΞΥΛΙΚΟ PLURONIC F-127 (MP)  Καταλύτες που χρησιμοποιήθηκαν είναι : › DMAP, TEA  Ο διαλύτης που χρησιμοποιήθηκε ήταν η dioxane.  Το Pluronic με την απόκτηση (-COOH) στα άκρα του γίνεται πιο δραστικό.

 ΧΡΗΣΗ ΖΕΛΑΤΙΝΗΣ  ΧΡΗΣΗ EDC

 Πρωτεΐνη από μερική υδρόλυση κολλαγόνου, καθώς αποτελεί κύριο συστατικό και της εξωκυττάριας μήτρας.  Παρασκευάζεται από βράσιμο συνδετικών ιστών, οστών ζώων κτλ.  Παρουσιάζει χημική σύνθεση παρόμοια με εκείνη του κολλαγόνου της μητρικής της.  Προτείναμε προσθήκη ζελατίνης στο Pluronic ως ένα βοηθητικό συγκολλητικό υλικό που κάνει το σύνθετο ικρίωμα πιο κυτταρο - δραστικό.  Βελτίωση υδροφιλικότητας του ικριώματος.

Είναι διαλυτή σε πολλούς δ / τες. Μαζί με το νερό σχηματίζει ένα ημιστερεό κολλοειδές gel. Το ιξώδες των μειγμάτων ζελατίνης / νερού αυξάνεται με την συγκέντρωση & όταν διατηρούνται δροσερά (~4 ο C)

EDC: ΚΑΤΑΛΥΤΗΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟ CROSS-LINK ΔΕΣΜΩΝ ΑΝΑΜΕΣΑ ΣΤΗΝ (-COOH) ΤΟΥ ΔΡΑΣΤΙΚΟΥ PLURONIC & ΣΤΗΝ ΑΜΙΝΟΜΑΔΑ ΤΗΣ ΖΕΛΑΤΙΝΗΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟ ΔΕΣΜΟΥ ΑΜΙΔΙΟΥ.

O ║ R-C-OH + H 2 N –R’ O EDC ║ R-C- N –R’ + H 2 O H

 Στο μονοκαρβοξυλικό Pluronic F-127 εγχύουμε την ζελατίνη σε μείγμα EDC/NHS ( το οποίο λειτουργεί ως αντιδραστήριο σύζευξης ) σε Θ. Δ για 24 ώρες, παίρνοντας το προϊόν GP.  Η ζελατίνη πριν είχε λιώσει σε ένα προθερμασμένο (30 oC) δ / μα MES.  Το τελικό προιόν διαλύεται ξανά σε απιονισμένο νερό χρησιμοποιώντας μια μεμβράνη για 3 ημέρες όπου και τελικά έγινε λυοφιλικό.

ΤΟ ΙΚΡΙΩΜΑ ΜΕ ΖΕΛΑΤΙΝΗ ΟΙ ΙΝΕΣ ΤΩΝ ΒΛΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΟΙ ΙΝΕΣ ΤΩΝ ΒΛΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΦΘΟΡΙΖ. ΟΥΣΙΑ (DAPI) ΠΟΥ ΣΥΝΔΕΕΤΑΙ ΙΣΧΥΡΑ ΜΕ ΤΟ DN Α ΦΘΟΡΙΖ. ΟΥΣΙΑ (DAPI) ΠΟΥ ΣΥΝΔΕΕΤΑΙ ΙΣΧΥΡΑ ΜΕ ΤΟ DN Α

Η διαδικασία χαρακτηρισμού του προϊόντος έγινε για την επιβεβαιωμένη αλλαγή της χημικής δομής των τροποιημένων ζελατίνων.  Χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι χαρακτηρισμού : i. 1 H-NMR ii. FTIR iii. Το τεστ διαλυτότητας. iv. M ετάβαση φάσης και βάση αλλαγής συγκέντρωσης - θερμοκρασίας.

1 H-NMR A. GELATIN A. GELATIN - ΕΜΦΑΝΙΖΟΝΤΑΙ ΤΥΠΙΚΕΣ ΚΟΡΥΦΕΣ : i. Το 1 Η του ανωμερή άνθρακα στα 4.8 ppm ! ii. Τα 1 Η των αλκυλικών πρωτονίων της ζελατίνας στα 1.9 – 4.0 ppm iii. Το 1 Η του άνθρακα που φέρει τις – ΝΗ 2 ομάδες στα 1.3 ppm 4.8 ppm 1 H

1 H-NMR PLURONIC Β. PLURONIC i. Εμφανίζονται δύο κορυφές 1 H των CH2-CH2 στα ppm ii. Μια ισχυρή αιχμή του 1 H της μεθυλο ομάδας στα 1.11 ppm ! ppm 1 H 1.11 ppm 1 H

1 H-NMR C. GELATIN-PLURONIC (GP) i. Την ισχυρή κορυφή του 1 H της ζελατίνας του ανωμερή άνθρακα στα 4.8 ppm ! ii. Την ισχυρή κορυφή του 1 H του Pluronic λόγω μεθυλομάδας στα 1.3ppm ! iii. Τις δύο κορυφές των 1 H των CH2-CH2 στα ppm. 4.8ppm ppm 1.3 ppm ( C ) GP

1 H-NMR - ΣΥΝΟΠΤΙΚΑ A. GELATIN - ΕΜΦΑΝΙΖΟΝΤΑΙ ΤΥΠΙΚΕΣ ΚΟΡΥΦΕΣ : i. Το Η του ανωμερή άνθρακα στα 4.8 ppm ii. Τα αλκυλικά πρωτόνια της ζελατίνα στα 1.9 – 4.0 ppm iii. Οι άνθρακες που φέρουν την -COOH ομάδα στα 1.3 ppm B. PLURONIC i. Εμφανίζονται δύο κορυφές CH2-CH2 στα ppm ii. Μια ισχυρή αιχμή της μεθυλο ομάδας στα 1.11 ppm C. GELATIN-PLURONIC (GP) i. Το πρωτόνιο της ζελατίνας του ανωμερή άνθρακα στα 4.8 ppm ii. Την ισχυρή κορυφή του Pluronic λόγω μεθυλομάδας στα 1.3ppm iii. Τις δύο κορυφές CH2-CH2 στα ppm.

FTIR (C=O) 1700cm cm -1 GP GELATIN PLUR MP

 ΕΛΕΓΧΟΣ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑΣ. Η ζελατίνη, το Pluronic και το GP αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τα σε διάφορους διαλύτες συμπεριλαμβανομένου και το H2 Ο.

 ΜΕΤΑΒΑΣΗ ΦΑΣΗΣ ΤΩΝ GP & PLURONIC (aqueous sol) Αλλάζοντας την συγκέντρωση άλλαζε και η θερμοκρασία ώστε να σχηματιστεί το gel. Αλλάζοντας την συγκέντρωση άλλαζε και η θερμοκρασία ώστε να σχηματιστεί το gel.

 ΠΡΩΤΟ ΣΤΑΔΙΟ : ΕΠΙΛΟΓΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ. ( ΩΡΙΜΑ ΧΟΝΔΡΟΚΥΤΤΑΡΑ ) ( ΩΡΙΜΑ ΧΟΝΔΡΟΚΥΤΤΑΡΑ )  ΔΕΥΤΕΡΟ ΣΤΑΔΙΟ : ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ & 3-D ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ. 3-D ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ.  ΤΡΙΤΟ ΣΤΑΔΙΟ : ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΑ Δ / ΤΑ (PLURONIC & GELATIN- PLURONIC)

ΧΟΝΔΡΟΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΟΥΝΤΑΙ ΣΤΟ 3D ΙΚΡΙΩΜΑ.

 Αξιολόγηση σύνδεσης και η βιωσιμότητας των χονδροκυττάρων που καλλιεργήθηκαν πάνω και στο Pluronic και στο GP.  ΕΛΕΓΧΟΣ ΚΑΘΑΡΟΤΗΤΑΣ ( ΜΤΤ )

Η οπτική πυκνότητα του GP ήταν σημαντικά υψηλότερη (p<0.05) από εκείνη του Pluronic σε 1,3,5 ημέρες ενδεικτικά.

ΤΟ ΥΔΑΤΙΚΟ Δ / ΜΑ ΤΟΥ GELATIN-PLURONIC ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΕ ΜΙΑ ΘΕΡΜΟ - ΕΥΑΙΣΘΗΤΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΓΥΡΩ ΑΠΟ ΤΗΝ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΤΟΥ ΣΩΜΑΤΟΣ ΧΩΡΙΣ ΚΑΜΙΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ. ΑΥΤΌ ΤΟ ΚΑΘΙΣΤΑ ΧΡΗΣΙΜΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΒΙΟΫΛΙΚΕΣ & ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ. ΑΞΙΟΛΟΓΩΝΤΑΣ ΤΙΣ ΑΛΛΗΛ / ΔΡΑΣΕΙΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΕΔΕΙΞΑΝ : I. ΑΥΞΗΜΕΝΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΣΗ II. ΑΥΞΗΜΕΝΟ ΠΟΛΛ / ΣΙΑΣΜΟ III. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΣΤΟ HYDROGEL GP. ΒΑΣΗ ΑΥΤΩΝ : TO HYDROGEL GP ΠΑΡΕΧΕΙ ΚΑΤΑΛΛΗΛΟ 3-D ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΓΙΑ ΧΟΝΔΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ.

 ‘Tuning hierarchical architecture of 3D polymeric scaffolds for cardiac tissue engineering’ {E. Traversaa*, B. Mecheria, C. Mandolia, S. Solimana, A.Rinaldia, S. Licocciaa,G. Forteb, F. Pagliarib, S. Pagliarib, F. Carotenutob, M. Minierib and P. Di Nardob, aDepartment of Chemical Science and Technology, University of Rome ‘‘Tor Vergata’’, Rome, bDepartment of Internal Medicine, University of Rome ‘‘Tor Vergata’’, Rome(Received 1 August 2007; final version received 29 September 2007)}  77u3075/ 77u3075/  htm htm  wikipedia.org

Μέσω H-NMR επιβεβαιώνονται οι αλλαγές της χημικής δομής του συμπολυμερούς ζελατίνη - Pluronic (G Ρ ).  Βασίζεται σε διεργασίες μαγνητικών πυρήνων οι οποίοι βρίσκονται σε ισχυρό μαγνητικό πεδίο.  Προσανατολισμός πυρήνων  Η θέση των κορυφών δείχνει το χημικό περιβάλλον πρωτονίων  Το εμβαδόν κορυφών είναι ανάλογο με τον αριθμό πρωτονίων.

Μέσω της μεθόδου FTIR παρατηρούνται δονήσεις που προκαλλούν αλλαγή στην πολικότητα του μορίου GP.  Προσδιορισμός ύπαρξης συγκεκριμένων ειδών δεσμού ( χαρακτηριστικές ομάδες ) στο μόριο.  Η θέση δείχνει : ΑΝΟΙΓΜΕΝΗ ΜΑΖΑ ( άτομα υψηλές συχνότητες ) ΙΣΧΥΣ ΔΕΣΜΟΥ ( ισχυροί δεσμοί, υψηλές συχνότητες )  Η ένταση ( Αλλαγή στην πολικότητα : ισχυρά πολικοί δεσμοί )  Έυρος κορυφής δεσμών 1 Η ευρείες κορυφές.