ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

Μικροβιακή ανάπτυξη

Μέτρηση βιομάζας με φασματοφωτομετρία

Τριβλεία Petri

Ανάπτυξη καλλιέργειας

Οι ρυθμοί ο ρυθμός ανάπτυξης βιομάζας rx=dx/dt, o ρυθμός κατανάλωσης υποστρώματος rs=-ds/dt, o ρυθμός σχηματισμού προϊόντος rp=dp/dt, και o ρυθμός παραγωγής θερμότητας rH=dH/dt.

Ειδικοί ρυθμοί (ανά g κυτταρικής μάζας)

Ταξινόμηση μοντέλων

Ισορροπημένη ανάπτυξη «Μέσο» κύτταρο

Καμπύλη ανάπτυξης φάση καθυστέρησης φάση επιτάχυνσης φάση εκθετικής ανάπτυξης φάση επιβράδυνσης στάσιμη φάση φάση θανάτου ή αποδόμησης

Παράδειγμα Μοντέλο κινητικής Κινητικές σταθερές μmax = 0.21 d-1 Ks = 21.15 mg/L YX/S = 0.95

ΜΗ ΔΟΜΗΜΕΝΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΜΗ ΚΑΤΑΝΕΜΗΜΕΝΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΜΗ ΔΟΜΗΜΕΝΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΜΗ ΚΑΤΑΝΕΜΗΜΕΝΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ

ΜΟΝΤΕΛΑ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΜΙΑΣ ΜΕΤΑΒΛΗΤΗΣ

Malthus Ανεξέλεγκτη ανάπτυξη! ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μ είναι σταθερός. Ολοκληρώνοντας την εξίσωση με αρχική συνθήκη x(0)=x0: Ανεξέλεγκτη ανάπτυξη!

Ενώ μπορεί να περιγράψει την ανάπτυξη στην εκθετική φάση, δεν μπορεί να προβλέψει άλλες φάσεις. το μοντέλο αυτό αδυνατεί να προβλέψει την επίδραση στον ρυθμό ανάπτυξης οιασδήποτε παραμέτρου, όπως συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών κλπ. Από την εξίσωση μπορούμε να προβλέψουμε τον χρόνο διπλασιασμού της βιομάζας:

Λογιστικό ή σιγμοειδές Verhulst 1844, Pearl και Reed το 1920 Προβλέπει εκθετική αλλά και στάσιμη φάση

Volterra περιλαμβάνει έναν επί πλέον όρο "μνήμης" αναγνωρίζοντας ότι οι παρελθούσες συνθήκες επηρεάζουν τον τρέχοντα ρυθμό ανάπτυξης είτε θετικά (k0>0) είτε αρνητικά (k0<0)

Τα μοντέλα μιας μεταβλητής: είναι όλα εμπειρικά στην φύση τους δεν προβλέπουν φάση καθυστέρησης δεν περιγράφουν τις επιδράσεις των διαφόρων παραγόντων στον ρυθμό ανάπτυξης δεν κάνουν καμία χρήση των γνώσεων της βιοχημείας και μικροβιολογίας.

ΜΟΝΤΕΛΑ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΜΕ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟ ΑΠΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ Διάφορα μοντέλα ανάλογα με τη συνάρτηση

Το μοντέλο Monod όπου: s: περιοριστικό υπόστρωμα (mg/L) Ks: σταθερά κορεσμού (ίση με την συγκέντρωση του υποστρώματος στην οποία ο ρυθμός ανάπτυξης είναι ίσος με το ήμισυ του μέγιστου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης) μmax: μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης

Εναλλακτικές εκφράσεις Teissier: Moser: Contois:

Εναλλακτικές εκφράσεις Blackman (ή μοντέλο δύο φάσεων): Dabes:

Konak Το μοντέλο αυτό είναι υπό μορφή συνήθους διαφορικής εξίσωσης

Γενικευμένη εξίσωση Kargi και Shuler

Παρεμπόδιση από το υπόστρωμα Andrews

Πολλαπλά υποστρώματα Συμπληρωματικά υποστρώματα Ταυτόχρονη χρήση Αντικαταστάσιμα υποστρώματα Κατά προτίμηση χρήση

Συμπληρωματικά υποστρώματα Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μ(s1, s2) Μη αλληλεπιδρώντα συμπληρωματικά υποστρώματα μ = 3 μ = 2 μ = 1

Αλληλεπιδρώντα συμπληρωματικά υποστρώματα μ = 3 μ = 2 μ = 1

Κατά προτίμηση χρήση αντικαταστάσιμων υποστρωμάτων Διαυξικό φαινόμενο

Διαδοχική χρήση (α) Imanaka: (β) Moser: (γ) Bergter and Knorre:

Επαύξηση Στην περίπτωση επαύξησης του ρυθμού από την παρουσία κάποιας ένωσης Se ακολουθώντας τους Tsao και Hanson έχουμε την ακόλουθη τροποποίηση του μέγιστου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης:

Στην περίπτωση της παρεμπόδισης από κάποια ουσία Ι, συνήθως χρησιμοποιείται μία από τις ακόλουθες εκφράσεις: Συχνά η παρεμπόδιση προέρχεται από κάποιο μεταβολικό προϊόν P. Συνήθως και για την παρεμπόδιση από προϊόν χρησιμοποιούνται οι πιο πάνω εκφράσεις.

Μοντέλα καθυστέρησης O’Neil and Lyberatos Wang and Stephanopoulos

Θερμοκρασία και pH Τέλος, ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης εξαρτάται από την θερμοκρασία και το pH με τρόπο περίπου ανάλογο της περίπτωσης των ενζυμικών αντιδράσεων. Ίδιες εκφράσεις όπως και για τις ενζυμικές αντιδράσεις H εξάρτηση από το pH είναι μικρότερη απ' ό,τι για τις ενζυμικές αντιδράσεις.

ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΚΑΙ ΕΝΔΟΓΕΝΗΣ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ κατανάλωση υποστρώματος όχι μόνο για ανάπτυξη αλλά και για συντήρηση με ρυθμό ανάλογο της συγκέντρωσης της βιομάζας: Η τιμή της σταθεράς km εξαρτάται από τις συνθήκες. όσο πιο αντίξοες οι συνθήκες, τόσο μεγαλύτερη και η σταθερά

Ενδογενής μεταβολισμός ή ενδογενής αναπνοή Η ενέργεια που απαιτείται για την διατήρηση ζώντων οργανισμών και γίνεται εις βάρος της βιομάζας δεν επηρεάζεται το ισοζύγιο του υποστρώματος αλλά από τον ρυθμό ανάπτυξης βιομάζας αφαιρούμε ένα ρυθμό ενδογενούς μεταβολισμού:

Μοντέλο Ramkrishna

ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Προϊόντα Τύπου 1: Παραπροϊόντα των διεργασιών του κυττάρου που αποσκοπούν στην παραγωγή ενέργειας, π.χ. φωσφορυλίωση σε επίπεδο υποστρώματος, αναπνοή κλπ. όπως αιθανόλη, γαλακτικό οξύ, κιτρικό οξύ Προϊόντα Τύπου 2: Εξωκυτταρικά προϊόντα εκβαλλόμενα από τα κύτταρα, όπως εξωκυτταρικά ένζυμα που εκλύονται για να διασπάσουν κάποια ουσία-υπόστρωμα του κυτταρικού περιβάλλοντος, πολυσακχαρίτες για συσσωμάτωση κυττάρων και άλλα προϊόντα όπως αντιβιοτικά που μπορεί να στοχεύουν στον αποτελεσματικότερο ανταγωνισμό με άλλα είδη. Προϊόντα Τύπου 3: Ενώσεις αποθήκευσης ενέργειας όπως λίπη, γλυκογόνο κλπ. Προϊόντα Τύπου 4: Συστατικά του κυττάρου.

Ταξινόμηση του Gaden Τύπου Ι: προϊόντα του πρωτογενούς ενεργειακού μεταβολισμού (ανάλογα με τον Τύπο 1). Τύπου ΙΙ: έμμεσα προϊόντα του ενεργειακού μεταβολισμού, όπως κιτρικό οξύ. Τύπου ΙΙΙ: πολύπλοκα προϊόντα που δεν σχετίζονται με τον ενεργειακό μεταβολισμό (ανάλογα με τον Τύπο 2).

Ταξινόμηση με βάση την κινητική (α) Προϊόντα σχετιζόμενα με την ανάπτυξη, με ρυθμό παραγωγής ανάλογο του ρυθμού ανάπτυξης: (β) Προϊόντα μη σχετιζόμενα με την ανάπτυξη, με ρυθμό παραγωγής ανάλογο της συγκέντρωσης της βιομάζας: (γ) Προϊόντα μικτής κινητικής:

ΜΟΝΤΕΛΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΧΡΗΣΗ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ όπου P1,...,Pn είναι τα εξωκυτταρικά προϊόντα, και YPi/S είναι οι συντελεστές απόδοσης που συσχετίζουν το υπόστρωμα με το προϊόν i. Υποθέτοντας αμελητέα χρήση για συντήρηση και ότι όλα τα προϊόντα είναι σχετιζόμενα με την ανάπτυξη:

Παράδειγμα

Φάση καθυστέρησης Dean και Hinshelwood ο χρόνος καθυστέρησης tL είναι ο χρόνος μετά την μεταφορά της μαγιάς στο νέο θρεπτικό μέσο στο οποίο κάποιο κρίσιμο ένζυμο φτάνει σε κάποια κρίσιμη συγκέντρωση c* V: ο λόγος των όγκων του προηγούμενου μέσου προς τον όγκο του νέου Ν0: ο αριθμός των παλαιών κυττάρων ανά μονάδα όγκου στο νέο μέσο a: η συγκέντρωση του ενζύμου στο προηγούμενο μέσο a’: ο ρυθμός παραγωγής του ενζύμου από τα "παλαιά" κύτταρα ανά κύτταρο a": ο ρυθμός παραγωγής του ενζύμου από νέα κύτταρα Προκειμένου να ελαχιστοποιήσουμε τον χρόνο καθυστέρησης χρειάζεται μεγάλη μαγιά (N0) και μεγάλος λόγος όγκων (V). Στην πράξη προσπαθούμε να χρησιμοποιούμε όγκο μαγιάς περίπου το ένα δέκατο του όγκου του νέου μέσου.

Στάσιμη φάση Για την στάσιμη φάση κατ' αρχήν διακρίνουμε δύο πιθανούς λόγους διακοπής της ανάπτυξης. ο πρώτος είναι η εξάντληση κάποιου θρεπτικού συστατικού ο δεύτερος η συσσώρευση κάποιου τοξικού προϊόντος. Στην πρώτη περίπτωση η τελική συγκέντρωση της βιομάζας θα είναι απλώς:

Στάσιμη φάση Στη δεύτερη περίπτωση πρέπει να βρούμε την εξάρτηση του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης από το τοξικό προϊόν και να εκφράσουμε τον ρυθμό παραγωγής του τοξικού προϊόντος συναρτήσει του υποστρώματος και της βιομάζας. Η ανάπτυξη θα διακοπεί όταν ο ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μηδενιστεί, δηλαδή όταν η συγκέντρωση φτάσει κάποιο συγκεκριμένο επίπεδο. Επιλύνοντας τα ισοζύγια από κοινού βρίσκουμε τις τελικές συγκεντρώσεις του υποστρώματος και της βιομάζας.

Στάσιμη φάση Για να μπορέσουμε να διακρίνουμε πειραματικά τον λόγο της διακοπής της ανάπτυξης, δεν έχουμε παρά να αραιώσουμε ένα δείγμα με νερό. Αν παρατηρηθεί περαιτέρω ανάπτυξη ο λόγος είναι η συσσώρευση τοξίνης, ενώ αν δεν παρατηρηθεί πρόκειται σίγουρα για εξάντληση υποστρώματος.

Φάση θανάτου Η σταθερά kd είναι συνάρτηση της θερμοκρασίας και προσδιορίζεται εύκολα από την κλίση διαγράμματος του λογαρίθμου της βιομάζας συναρτήσει του χρόνου.

ΔΟΜΗΜΕΝΑ ΜΟΝΤΕΛΑ Όταν ενδιαφέρει η εξέλιξη κάποιου συγκεκριμένου κυτταρικού συστατικού, ή απαιτείται η αναγνώριση των κύριων συστατικών του κυττάρου για την επαρκή περιγραφή της συνολικής κινητικής ανάπτυξης (όταν δηλαδή η παραδοχή της ισορροπημένης ανάπτυξης δεν ευσταθεί) πρέπει να επιστρατεύσουμε τις γνώσεις μας για την βιοχημεία και φυσιολογία του κυττάρου για την ανάπτυξη κατάλληλων δομημένων μοντέλων.

Πως συνδέεται η συγκέντρωση κάποιου συγκεκριμένου ενδοκυτταρικού παράγοντα με τον ρυθμό ανάπτυξης του κυττάρου που αναπτύσσεται σε κάποιο μέσο όγκου VR; Έστω cj η συγκέντρωση του συστατικού j μέσα στο κύτταρο, σε moles j ανά μονάδα κυτταρικού όγκου. Έστω ότι η συνολική βιομάζα είναι m. Αν ρc είναι η πυκνότητα των κυττάρων, τότε ο συνολικός όγκος της βιολογικής φάσεως (του συνόλου των κυττάρων) είναι m/ρc. Αρα ο συνολικός αριθμός των moles του j μέσα στο μέσο είναι (mcj)/ρc.

Αν ο καθαρός ρυθμός σχηματισμού του j ανά μονάδα χρόνου ανά μονάδα όγκου μέσα στο κύτταρο είναι rj τότε το ισοζύγιο του j μπορεί να γραφεί ως ακολούθως: και θεωρώντας την κυτταρική πυκνότητα ρc σταθερή όπου

Ο πρώτος όρος είναι ο καθαρός ρυθμός μεταβολής λόγω αντίδρασης Ο δεύτερος όρος αντιπροσωπεύει την μείωση που παρατηρείται εξ αιτίας της αραίωσης που προκύπτει από την αύξηση του κυτταρικού όγκου λόγω ανάπτυξης. Η σχέση αυτή είναι ιδιαίτερα σημαντική μια και χρησιμοποιείται για την κατασκευή οιουδήποτε δομημένου μοντέλου.

ΔΙΑΜΕΡΙΣΜΑΤΙΚΑ ΔΟΜΗΜΕΝΑ ΜΟΝΤΕΛΑ Τα διαμερισματικά μοντέλα χωρίζουν την βιομάζα σε επί μέρους τμήματα. Έτσι π.χ. μπορούμε να διακρίνουμε ένα συνθετικό μέρος βιομάζας (βασικά RNA) και ένα δομικό μέρος (DNA και πρωτεΐνες). Εναλλακτικά μπορούμε να διακρίνουμε την βιομάζα σε ένα αφομοιωτικό τμήμα και ένα συνθετικό τμήμα, κ.ο.κ. Ο διαχωρισμός σε τμήματα έχει κάποια βιοχημική και δομική βάση, αλλά δεν αντιστοιχεί επακριβώς σε κάποιο πραγματικό μηχανισμό.

Williams Η βιομάζα διαιρείται σε δύο μέρη, ένα συνθετικό και ένα δομικό. Το συνθετικό μέρος παράγεται από την μετατροπή υποστρώματος που λαμβάνεται από το περιβάλλον των κυττάρων Το δομικό μέρος βιομάζας παράγεται από την μετατροπή του συνθετικού μέρους Οι ρυθμοί των διεργασιών είναι ανάλογοι των συστατικών που λαμβάνουν μέρος σε αυτές

όπου ρs και ρg είναι, αντίστοιχα, η ποσότητα της συνθετικής και της δομικής/γενετικής βιομάζας ανά μονάδα κυτταρικού όγκου, s η συγκέντρωση του υποστρώματος στο περιβάλλον μέσο (ανά μονάδα όγκου καλλιέργειας), και k1 και k2 κινητικές σταθερές. Ειδικός ρυθμός ανάπτυξης:

Ισοζύγιο για το υπόστρωμα σε κλειστό σύστημα: όπου x είναι η συγκέντρωση της βιομάζας ανά μονάδα όγκου καλλιέργειας (κύτταρα και μέσο ανάπτυξης). Ισοζύγιο για την βιομάζα σε κλειστό σύστημα:

Υπόθεση: ο αριθμός των κυττάρων ανά μονάδα όγκου καλλιέργειας είναι ανάλογος της συγκέντρωσης της δομικής/γενετικής βιομάζας xg=(ρg/ρc)x. επομένως το μέγεθος των κυττάρων είναι ανάλογο του x/xg=ρc/ρg

Καλλιέργεια σε κλειστό σύστημα με μαγιά που προέρχεται από στάσιμη φάση (ρs=0) x t

Προβλέπει ορισμένα ποιοτικά χαρακτηριστικά που συνήθως παρατηρούνται σε πραγματικές καλλιέργειες: (α) Ύπαρξη φάσης καθυστέρησης κατά την οποία αυξάνεται το μέγεθος των κυττάρων χωρίς αύξηση του αριθμού τους. (β) Ύπαρξη φάσης εκθετικής ανάπτυξης κατά την οποία και το μέσο κυτταρικό μέγεθος παίρνει την μεγαλύτερη του τιμή. (γ) Μεταβολή της σύστασης των κυττάρων κατά τον κύκλο ανάπτυξης. (δ) Ύπαρξη στάσιμης φάσης με μικρά σε μέγεθος κύτταρα. (ε) Ανομοιόμορφη μεταβολή του αριθμού και της μάζας των κυττάρων.

ΜΗΧΑΝΙΣΤΙΚΑ ΔΟΜΗΜΕΝΑ ΜΟΝΤΕΛΑ Τα μηχανιστικά μοντέλα κάνουν άμεση χρήση των γνώσεων που έχουμε για τον μεταβολισμό ή/και την γενετική του κυττάρου. τα μοντέλα αυτά περιλαμβάνουν μόνο στοιχεία που: κρίνονται ως απαραίτητα για την περιγραφή της κινητικής (μια και παίζουν καθοριστικό ρόλο στην παρατηρούμενη κινητική και στοιχειομετρία) ή συνδέονται άμεσα με την κινητική επί μέρους συστατικών που μας ενδιαφέρουν (π.χ. προϊόντων). καθοριστικό ρόλο παίζει η δυνατότητα μέτρησης των μεταβλητών που περιλαμβάνονται στο μοντέλο.

Παραγωγή κάποιας πρωτεΐνης P που λαμβάνει υπόψη του τις διεργασίες της μεταγραφής και μετάφρασης: Αν ο γόνος που έχει την πληροφορία για την παρασκευή της πρωτεΐνης είναι G, το ισοζύγιο μάζας για το αγγελιοφόρο RNA είναι: όπου kp η κινητική σταθερά μεταγραφής, kd η κινητική σταθερά της απενεργοποίησης/καταστροφής του mRNA. Ο συντελεστής αποτελεσματικότητας η εισάγεται για να περιγράψει πιθανές τροποποιήσεις του ρυθμού μεταγραφής.

Το ισοζύγιο μάζας για την πρωτεΐνη μπορεί να γραφεί ως: Εδώ ξ είναι ο συντελεστής αποδοτικότητας της μετάφρασης.

Αν υποθέσουμε ισορροπημένη ανάπτυξη, οι χρονικές παράγωγοι στο αριστερό μέρος των εξισώσεων μηδενίζονται, και οι αλγεβρικές εξισώσεις που προκύπτουν δίνουν: Η σχέση αυτή δίνει την συγκέντρωση του πρωτεϊνικού προϊόντος συναρτήσει των ρυθμών ανάπτυξης, μεταγραφής και μετάφρασης

ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΑΠΟΣΤΕΙΡΩΣΗΣ Αποστείρωση ενός μέσου ονομάζουμε την εξόντωση ή απομάκρυνση όλων των μικροοργανισμών με ταυτόχρονη απενεργοποίηση όλων των ιών. Η αποστείρωση είναι μία ιδιαίτερα βασική διεργασία που συνήθως προηγείται της κύριας βιοτεχνολογικής διεργασίας που περιλαμβάνει ανάπτυξη μικροοργανισμών (αποστείρωση θρεπτικού μέσου).

Στις φαρμακοβιομηχανίες και στις βιομηχανίες τροφίμων χρησιμοποιούνται μία ή περισσότερες από τις ακόλουθες βασικές μεθόδους αποστείρωσης: (α) υγρή θέρμανση (ατμοί) (β) ξερή θέρμανση (κλίβανοι) (γ) μικροβιοκτόνοι παράγοντες όπως χλώριο, οξείδιο του αιθυλενίου και φορμαλδεΰδη (δ) ακτινοβολία (ε) διήθηση Μία κατάλληλη επεξεργασία φέρνει την επιθυμητή απομάκρυνση μικροοργανισμών χωρίς να προκαλέσει βλάβες στα προϊόντα. Η πιο συνηθισμένη διεργασία είναι η χρήση υπέρθερμων ατμών.

Η κινητική της θερμικής αποστείρωσης είναι πρώτης τάξης ως προς την συγκέντρωση των ζώντων οργανισμών, δηλαδή περιγράφεται από την εξίσωση: η οποία δίνει: όπου n0 η αρχική συγκέντρωση μικροοργανισμών. Η σταθερά kd αυξάνει με την θερμοκρασία σύμφωνα με την σχέση τύπου Arrhenius:

Κινητική αποστείρωσης

Όταν ο αριθμός μειωθεί σημαντικά μόνο μία στοχαστική περιγραφή του φαινομένου της αποστείρωσης είναι στην πραγματικότητα δικαιολογημένη. Αν υποθέσουμε ότι: η τύχη κάθε οργανισμού είναι ανεξάρτητη από την τύχη των άλλων αρχικά έχουμε ολικό αριθμό Ν0 η πιθανότητα ένας οργανισμός να παραμένει ζωντανός μετά από χρόνο t είναι e-kt τότε η πιθανότητα να έχουμε Ν οργανισμούς εν ζωή μετά από χρόνο t είναι: Επομένως η πιθανότητα να έχουμε εξοντώσει όλους τους οργανισμούς σε χρόνο t είναι: Αυτή η πιθανότητα είναι χρήσιμη για περιπτώσεις που απαιτείται σχεδόν τέλεια αποστείρωση.

ΑΠΟΛΥΜΑΝΣΗ Απολύμανση ονομάζουμε την επιλεκτική μείωση οργανισμών που μπορεί να μη συνοδεύεται από πλήρη εξόντωση σαπροφυτικών οργανισμών και ενδοσπόρων. Η απολύμανση απαντάται στην πράξη σε ιατρικές εφαρμογές καθώς και στην επεξεργασία νερού και λυμάτων. Για τον καθαρισμό του νερού το πιο συνηθισμένο απολυμαντικό μέσο είναι το χλώριο. Η κινητική της απολύμανσης είναι ανάλογη της κινητικής θερμικής αποστείρωσης (κινητική πρώτης τάξης ως προς την συγκέντρωση οργανισμών).

Κινητική απολύμανσης Η εξάρτηση της κινητικής από την συγκέντρωση του απολυμαντικού παράγοντα δίνεται συνήθως εμπειρικά από την σχέση: Cnt=σταθερά όπου: t ο χρόνος που απαιτείται για να επιτευχθεί μία δεδομένη ποσοστιαία μείωση του πληθυσμού C η συγκέντρωση του απολυμαντικού παράγοντα. π.χ. αν t είναι ο χρόνος για 99% μείωση του πληθυσμού E. coli σε διάλυμα υποχλωριώδους οξέος, η σταθερά είναι 0,24 ενώ n=0,86.