7η Ημερίδα Κλινικής Μικροβιολογίας - 2007 Κύριοι φαινότυποι μικροβιακής αντοχής και η ερμηνεία τους Μη-ζυμωτικά βακτήρια Ε. Λεμπέση Αν. Διευθύντρια Μικροβιολογικού Εργαστηρίου Ν. Παίδων Αθηνών «Π. & Α. Κυριακού» 7η Ημερίδα Κλινικής Μικροβιολογίας - 2007

Ιδιαιτερότητες μικροβιακής αντοχής των μη ζυμωτικών βακτηρίων Ενδογενής αντοχή – οφείλεται σε: Μικρή διαπερατότητα της εξωτερικής μεμβράνης (ΕΜ) Συστήματα αντλιών ενεργητικής εκροής Παραγωγή β-λακταμασών τάξης AmpC ή καρβαπενεμασών Επίκτητη αντοχή - προκαλείται από: Σημειακές μεταλλαγές ή/και Απόκτηση εξωγενούς γενετικού υλικού

Σχετική Διαπερατότητα Εξωτ Μεμβράνης των μη ζυμωτικών βακτηρίων Είδος μικροβίου Σχετική διαπερατότητα (%) E. coli 100 P. aeruginosa 1-8 A. baumannii 1-3 S. maltophilia 3-5 B. cepacia 11

Βασικοί Τύποι Αντλιών Ενεργητικής Εκροής Stover et al, 2000 * P. aeruginosa * * MexAB-OprM: ιδιοσυστασιακή έκφραση MeXY-OprM, MexCD-OprJ: επαγώγιμη » MexEF-OprN, MexJK-OprM: σιωπηλή »

Μη-ζυμωτικά βακτήρια Κλινικά σημαντικά: Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Stenotrophomonas maltophilia Burkholderia cepacia

P.aeruginosa Ενδογενής αντοχή σε: AMP, AM/CL, α’, β’, γ’ γενιάς κεφ/νες (πλην CAZ), λόγω: Μειωμένης διαπερατότητας της EM και Παραγωγής β-λακταμασών τάξης AmpC –(χρωμοσωματικές και επαγώγιμες) NAL, TET, CHL, SXT, TIG, λόγω: Αντλίας Ενεργητικής Εκροής (MexAB-OprM)

Φαινότυπος αντοχής P. aeruginosa (άγριο στέλεχος) Παραγωγή AmpC Φαινόμενο Επαγωγής Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ν. Παίδων “Π.& Α. Κυριακού”

P.aeruginosa Επίκτητη αντοχή Αφορά: β-λακταμικά Αμινογλυκοσίδες Φθοριοκινολόνες Πολυμυξίνες Οφείλεται σε: Παραγωγή ενζύμων Υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής Τροποποίηση στόχων δράσης των αντιβιοτικών Μειωμένη διαπερατότητα της ΕΜ

Επίκτητη αντοχή της P.aeruginosa στις β-λακτάμες, πλην καρβαπενεμών PSE β-λακταμάσες (AmpA):PSE-1, -4, CARB-3, -4 Είναι οι συχνότερες β-λακταμάσες AmpC: Υπερπαραγωγή OXA β-λακταμάσες (AmpD):OXA-10,-13,-19,-28,-31 Αρκετά συχνές – μόνο στην P.aeruginosa Φαινότυπος ESBL (μη κλασικός) Εκτεταμένου φάσματος β-λακταμάσες (AmpA) Πιο σπάνιες – Φαινότυπος ESBL TEM-21,-24,-42,-4 και SHV-2a,-12,-5 Άλλες: PER-1, VEB-1, GES-1, IBC-1

P. aeruginosa Παραγωγή PSE-1 (AmpA) Υπερπαραγωγή AmpC PIP PIP TIC TCC CAZ TIC TCC CAZ R: TIC, PIP S:TCC, CAZ R: TIC, PIP, TCC, CAZ

P. aeruginosa Παραγωγή ESBLs τάξης Α / SHV-5 Double Disk Synergy Test(+) Ζώνες αναστολής: CAZ-CAZ/CLAV >4mm AMC AZT CAZ Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ν. Παίδων “Π.& Α. Κυριακού”

P. aeruginosa Παραγωγή ESBLs τάξης Α / PER-1 DDST(-) DDST(+) TIC TCC CAZ AMC DDST(+) AZT

18th ESCMID Postgraduate Education Course P. aeruginosa Παραγωγή ESBL τάξης D /OXA-28 DDST(-) 18th ESCMID Postgraduate Education Course

P. aeruginosa Αντοχή στις καρβαπενέμες Μη ενζυμικοί μηχανισμοί Απώλεια ή μειωμένη έκφραση πορίνης: OprD Υπερέκφραση αντλίας: MexAB-OprM Ενζυμικοί μηχανισμοί Yπερπαραγωγή AmpC Παραγωγή β-λακταμασών τάξης A (GES/IBC) R: IMP, λοιπά β-LACT, S/IS: MEM, AZT Παραγωγή μεταλλο-β-λακταμασών τάξης Β IMP, VIM, SPM, GIM

P. aeruginosa Απώλεια ή μειωμένη έκφραση πορίνης OprD IP:4mg/L, IPI: 4mg/L MBL: Negative Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ν. Παίδων “Π.& Α. Κυριακού”

Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ν. Παίδων “Π. & Α. Κυριακού” P. aeruginosa Υπερέκφραση αντλίας ενεργητικής εκροής MEM: R IMP: S MBL: Negative Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ν. Παίδων “Π. & Α. Κυριακού”

P. aeruginosa Μεταλλο-β-λακταμάσες (τάξης AmpΒ) Ταξινομούνται σε 4 τύπους: IMP-1, -2, -4, -7, -9, -10, -11, -13, -16, -18 VIM-1, -2, -3, -4, -5, -7, -11 SPM-1 GIM-1 Ευρεία διασπορά - Ελλάδα: VIM-1, -2, -4 Υδρολύουν όλα τα β-λακταμικά, πλην ΑΖΤ Κωδικοποιούνται από γονίδια που φέρονται σε συνήθως ιντεγκρόνια τάξης 1

Clin Microbiol Infect (2002);8:321 Ιντεγκρόνια τάξης 1 με γονιδιακές κασέττες που κωδικοποιούν μεταλλοένζυμα τύπου IMP και VIM σε P. aeruginosa Clin Microbiol Infect (2002);8:321

P. aeruginosa Παραγωγή μεταλλοενζύμου (VIM) EDTA-Disk synergy test IMP MEM TB TMP EDTA 5μL (0.5M) NT SUL CAZ FOX AZT PIP AMC AK TZP FEP CIP GN Π. Γιακούπη – Εθνική Σχολή Δημόσιας Υγείας 18th ESCMID Postgraduate Education Course

Ανίχνευση μεταλλοενζύμων -καρβαπενεμασών τάξης Β EDTA – disk synergy test IMP EDTA Lee K. et al, CMI (2001),7,88-102 MBLs(+) 15mm Ενοφθαλμισμός των ΙΜΡR στελεχών σε ΜΗ Τοποθέτηση δίσκων IMP(10μg) και EDTA (500mM-10μL) σε απόσταση 15-20mm Επώαση 18h και Ερμηνεία IMP EDTA MBLs(-) IMP EDTA MBLs(+) 20mm

Ανίχνευση μεταλλοενζύμων -καρβαπενεμασών τάξης Β Etest - MBL IMP/EDTA IMP MIC ratio of IP/IPI of≥8 or ≥3 log dilutions indicates MBLs Phantom zone between IP/IPI indicates MBLs Deformation of the IP or IPI ellipse indicates MBLs www.abbiodisk.com

P. aeruginosa Αντοχή στις αμινογλυκοσίδες Παραγωγή αμινογλυκοσιδο-τροποποιητικών ενζύμων ACCs ANTs APHs

Είδος αμινογλυκοσιδο-τροποποιητικού ενζύμου Φαινότυπος Αντοχής AAC(6’)-I T, N, A AAC(6’)-II G, T, N AAC(3)-I G AAC(3)-II AAC(3)-III ή ANT(2’) G, T AAC(3)-IV AAC(3’)-? G, N ANT(2’’)-I ANT(4’)-II T, A, I APH(3’)-VI A, I T: τομπραμυκίνη, Ν: νετιλμικίνη, Α: αμικασίνη, G: γενταμικίνη, Ι: ισεπαμικίνη

Μη ενζυμικοί μηχανισμοί αντοχής της P. aeruginosa στις αμινογλυκοσίδες Αντλία ενεργητικής αποβολής: MexXY-OprM Χαμηλού επιπέδου αντοχή σε όλες τις ΑΜΓς και σε άλλες τάξεις αντιβιοτικών: β-Lac, FQ, ERY, TET, TIG Μειωμένη είσοδος και συγκέντρωση φαρμάκου μέσα στο κύτταρο Συνήθης μηχανισμός αντοχής σε CF- και ICU-ασθενείς Χαμηλού ή μέτριου επιπέδου αντοχή σε όλες τις ΑΜΓς Τροποποίηση ριβοσωματικού στόχου Ευθύνεται το γονίδιο rmtA που κωδικοποιεί μια 16S rRNA μεθυλάση Προκαλεί υψηλού επιπέδου αντοχή σε όλες τις ΑΜΓς Παραγωγή βιομεμβράνης

Παραγωγή βιομεμβράνης Science (1998), 280:226-227 Ευθύνεται ο γονιδιακός τόπος ndvB, που κωδικοποιεί την παραγωγή γλυκανών στον περιπλασμικό χώρο Οι γλυκάνες δεσμεύουν τις ΑΜΓς εμποδίζοντας την είσοδο τους στο κυτταρόπλασμα Προκαλεί ιδιαίτερη αντοχή στην ΤΟΒ και σε πολλές τάξεις αντιβιοτικών

P. aeruginosa Αντοχή στις κινολόνες Ενδογενής αντοχή Μειωμένη διαπερατότητα της ΕΜ Αντλία ενεργητικής εκροής: MexAB-OprM Εκφράζεται ιδιοσυστασιακά σε βασικά επίπεδα Αφορά κυρίως το NAL

Επίκτητη αντοχή στις κινολόνες Euro Surveillance Of Antimicrobial Consumption, ESAC

P. aeruginosa Επίκτητη αντοχή στις φθοριοκινολόνες (FQ) Τροποποίηση του στόχου δράσης Σημειακές μεταλλαγές στα γονίδια gyrA και parC που κωδικοποιούν τις τοποϊσομεράσες ΙΙ (DNA γυράση) και ΙV Υπερέκφραση Αντλιών Ενεργητικής Εκροής MexAB-OprM: β-Lac, FQ, CHL, NV, TPM, SUL, TG MexCD-OprJ: β-Lac, FQ, CHL, NV, TPM, SUL,TG MexXY-OprM: β-Lac, FQ, AMGs, ERY, TET, TG MexEF-OprN: FQ, CHL, TPM MexVW-OprM: FQ, CHL, ERY, TET

P. aeruginosa Πολυανθεκτικό στέλεχος β-Lact, FQs, AMGs S: Colistin

Aντοχή της P. aeruginosa στις πολυμυξίνες Β και Ε (colistin) Διασταυρούμενη αντοχή Σπάνια (SENTRY 2001-04: 1.1-2.9%) Yψηλού επιπέδου Οφείλεται σε μεταβολές στη χημική σύνθεση της εξωτερικής μεμβράνης

P. aeruginosa CLSI τροποποιημένο Μέθοδος διάχυσης των δίσκων MH άγαρ - 35±20C- 16 έως 18h Περιβάλλον ατμοσφαιρικού αέρα P. aeruginosa CLSI τροποποιημένο Ομάδα Α Κεφταζιδίμη Γενταμικίνη Τικαρκιλλίνη - Πιπερακιλλίνη Ομάδα Β Αμικασίνη Αζτρεονάμη Κεφεπίμη Σιπροφλοξακίνη – Λεβοφλοξακίνη Ιμιπενέμη – Μεροπενέμη Τομπραμυκίνη Νετιλμικίνη Ομάδα Ο Καρμπενικιλλίνη Λομεφλοξακίνη ή Νορφλοξακίνη ή Οφλοξακίνη

Acinetobacter baumannii Ενδογενής αντοχή Μειωμένη διαπερατότητα 1-3% της διαπερατότητας της E.coli 2-7 φορές μικρότερη, σε σχέση με την P. aeruginosa Παραγωγή β-λακταμασών σε βασικά επίπεδα AmpC: χρωμοσωματικές – μη επαγώγιμες OXA-51/69 Αντλία ενεργητικής αποβολής: AdeABC R: AMGs, CTX, TET, ERY, CHL, TPM, FQs

A. baumannii Επίκτητη αντοχή Αντοχή στα β-Lac, πλην καρβαπενεμών Υπερπαραγωγή AmpC β-λακταμασών (ADC-1…-7) Εισδοχή της αλληλουχίας ISAba1 στο γονίδιο blaAmpC επιφέρει υπερπαραγωγή της AmpC και R στην CAZ Παραγωγή άλλων β-λακταμασών τύπου ESBL TEM, SHV, CTX-M, PER-1, VEB-1

18th ESCMID Postgraduate Education Course baumannii Παραγωγή ESBL β-λακταμάση VEB-1 18th ESCMID Postgraduate Education Course

baumannii Αντοχή στις καρβαπενέμες Μη ενζυμικοί μηχανισμοί Απώλεια ή μειωμένη έκφραση πορινών (CarO) εξωτερικής μεμβράνης Προκαλούν αντοχή κυρίως στην ΙΜΡ Υπερέκφραση αντλίας ενεργητικής εκροής (AdeABC) R: IMP, MEM, CTX, TET, ERY, CHL, TPM, FQs Τροποποίηση των PBPs (σπάνια)

Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ν. Παίδων “Π. & Α. Κυριακού” baumannii Παραγωγή OXA –58 (CHDLs) MEM MBL:Negative IP/IPI:16 / 16mg/L=1 AZT IMP Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ν. Παίδων “Π. & Α. Κυριακού”

Α. baumannii Αντοχή στις κινολόνες Σημειακές μεταλλαγές στα γονίδια gyrA και parC Χαμηλού ή υψηλού επιπέδου αντοχή Υπερέκφραση Αντλίας ενεργητικής αποβολής: AdeABC (RND-type) Χαμηλού ή μέτριου επιπέδου αντοχή Επί πλέον αντοχή σε: CTX, TET, ERY, CHL, TPM, AMGs Μείωση ή απώλεια πορινών

Α. baumannii Αντοχή στις αμινογλυκοσίδες Παραγωγή Αμινογλυκοσιδο-τροποποιητικών ενζύμων ACCs: ακετυλ- τρανσφεράσες ANTs: αδενυλ- ή νουκλεοτιδυλ- τρανσφεράσες APHs: φωσφορυλ- τρανσφεράσες Υπερέκφραση Αντλίας ενεργητικής εκροής: AdeABC Επί πλέον αντοχή σε: CTX, TET, ERY, CHL,TPM, FQs

Α. baumannii Αντοχή στις πολυμυξίνες Β και Ε (colistin) Διασταυρούμενη αντοχή Σπάνια (SENTRY 2001-2004: 1.7-2.7%) Yψηλού επιπέδου Οφείλεται σε μεταβολές στη χημική σύνθεση της εξωτερικής μεμβράνης

Acinetobacter baumannii CLSI Μέθοδος διάχυσης των δίσκων MH άγαρ - 35±20C- ατμ. αέρα -20 έως 24h Ομάδα Α Κεφταζιδίμη Ιμιπενέμη – Μεροπενέμη Ομάδα Β Αμικασίνη – Γενταμικίνη – Τομπραμυκίνη Αμπικ/σουλβακτάμη – Πιπερακ/ταζοβ – Τικαρκ/κλαβουλ Κεφεπίμη Κεφοταξίμη – Κεφτριαξόνη Σιπροφλοξακίνη – Γατιφλοξακίνη – Λεβοφλοξακίνη Δοξυκυκλίνη – Μινοκυκλίνη - Τετρακυκλίνη Πιπερακιλλίνη - Τικαρκιλλίνη Τριμεθοπρίμη/σουλφαμεθοξαζόλη Ομάδα Γ Πολυμυξίνη Β ή Κολιστίνη – ΜΟΝΟ ΜΕ MIC***

Stenotrophomonas maltophilia Ενδογενής Αντοχή Μειωμένη διαπερατότητα ΕΜ Πτωχή διάχυση β-λακταμικών, πλήν TCC Μειωμένη είσοδος αμινογλυκοσιδών (AMGs) Παραγωγή β-λακταμασών L1 – μεταλλοένζυμο (AmpΒ) R: καρβαπενέμες & άλλα β-Lac, πλην AZT L2 – β-λακταμάση (AmpΑ), τύπου ΤΕΜ R: κεφαλοσπορίνες & AZT (αναστέλλεται από CLAV) Αντλία ενεργητικής αποβολής SmeDEF: β-Lac, AMGs, FQs

S. maltophilia TCCS IMPR DDST: AMC+CTX/AZT TCC TZP CF TC TB AN GN OF CP IMP IMPR

S. maltophilia CLSI Ομάδα Α Τριμεθοπρίμη/ σουλφαμεθοξαζόλη Ομάδα Β Μέθοδος διάχυσης των δίσκων MH άγαρ -35±20C -20 έως 24h Περιβάλλον ατμοσφ. αέρα MIC: Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό (CAMHB) ή άγαρ (ΜΗΑ) 35±20C -20 έως 24h Ομάδα Α Τριμεθοπρίμη/ σουλφαμεθοξαζόλη Ομάδα Β Λεβοφλοξακίνη Μινοκυκλίνη Ομάδα Α Τριμεθοπρίμη/ σουλφαμεθοξαζόλη Ομάδα Β Κεφταζιδίμη Χλωραμφαινικόλη Λεβοφλοξακίνη Μινοκυκλίνη Τικαρκιλλίνη/ κλαβουλανικό

Βurkholderia cepacia Αντιμικροβιακή αντοχή Ενδογενής ΑΜΓς και Πολυμυξίνες Αδυναμία εισόδου από την Ε.Μ. β-λακταμικά Μειωμένη διαπερατότητα (πολύ στενές πορίνες: OpcPO, OpcS) ΤΕΤ, CHL, CIP Αντλία ενεργητικής εκροής (OpcK) Επίκτητη Αντλία ενεργητικής εκροής: CeoAB-OpcM R: CHL, CIP, TPM Υπερπαραγωγή AmpC και απώλεια πορινών R: β-LACT

Βurkholderia cepacia

B. cepacia CLSI Ομάδα Α Τριμεθοπρίμη/ σουλφαμεθοξαζόλη Ομάδα Β Μέθοδος διάχυσης των δίσκων MH άγαρ -35±20C -20 έως 24h MIC: Μέθοδος αραιώσεων σε ζωμό (CAMHB) ή άγαρ (ΜΗΑ) 35±20C -20 έως 24h Ομάδα Α Τριμεθοπρίμη/ σουλφαμεθοξαζόλη Ομάδα Β Κεφταζιδίμη Μεροπενέμη Μινοκυκλίνη Ομάδα Α Τριμεθοπρίμη/ σουλφαμεθοξαζόλη Ομάδα Β Κεφταζιδίμη Χλωραμφαινικόλη Λεβοφλοξακίνη Μεροπενέμη Μινοκυκλίνη Τικαρκιλλίνη/ κλαβουλανικό

Ενδογενής αντοχή μη ζυμωτικών βακτηρίων P. aeruginosa AMP, AMOX, AMO/CL, α’ –β’ –γ’ γενιάς κεφαλοσπορίνες (πλην CAZ) NAL, SXT, TET, CHL, TIG A. baumannii AMP, AMOX, α’, β’ γενιάς κεφαλοσπορίνες, ΑΖΤ S. maltophilia Ολα τα β-λακταμικά εκτός από TIC/CLAV, Αμινογλυκοσίδες B. cepacia α’ β’ γενιάς κεφαλοσπορίνες, Αμινογλυκοσίδες, COLISTIN

Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ν. Παίδων “Π. & Α. Κυριακού” Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ν. Παίδων “Π. & Α. Κυριακού” Επιστημονικό Προσωπικό Φουστούκου Μ Καλλέργη Κ. Λεμπέση Ε. Μάλλιου Κ. Αντωνάκη Γ. Ιωαννίδου Σ. Νινιού Ι. Παπαδημητρίου Μ. Παλαιολόγου Ν. Τεχνολόγοι Γιαννακουδάκη Κ. Λέντζου Χ. Μελισσά Ρ. Παπαδομανωλάκη Λ. Πατούνια Α. Μπορομπόκα Γ. Τρούπη Ν.

Αμινογ/σίδες β-λακταμικά Κινολόνες Ιμιπενέμη Εξ μεμβράνη Κυττ μεμβράνη

P. aeruginosa ESBL(+) SHV-5

P. Aerug.....OprD....ΕΠΑΓΩΓΉ.

P. Aeru- oprD

Ανίχνευση μεταλλοενζύμων -καρβαπενεμασών τάξης AmpΒ Modified Hodge test Lee K. et al, CMI (2001),7,88-102 IMP Ενοφθαλμισμός E. coli ATCC 25922 σε ΜΗ. Δίσκος ΙΜΡ στο κέντρο. Ενοφθαλμισμός των ΙΜΡR στελεχών Α, Β, C, D Επώαση 18h Ερμηνεία:(Α) και (C) υδρολύουν την ΙΜΡ (Β) και (D) δεν υδρολύουν την ΙΜΡ

A. baumannii VEB-1/ESBL P. aeruginosa PER-1/ESBL

A.baumannii/OXA-40

P. aeruginosa Πιθανός μηχανισμός αντοχής στην ιμιπενέμη? IP:4mg/L, IPI: 4mg/L MBL: Negative Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ν. Παίδων “Π.& Α. Κυριακού”

S. maltophilia Επίκτητη αντοχή Οφείλεται σε: Παραγωγή β-λακταμασών ΤΕΜ- Παραγωγή αμινογλυκοσιδο-τροποποιητικών ενζύμων (σπάνια) ACC- ANT-

Ενζυμικοί μηχανισμοί αντοχής της P. aeruginosa στις αμινογλυκοσίδες Παραγωγή αμινογλυκοσιδο-τροποποιητικών ενζύμων ACCs: ακετυλ- τρανσφεράσες ANTs: αδενυλ- ή νουκλεοτιδυλ- τρανσφεράσες APHs: φωσφορυλ- τρανσφεράσες Ένα στέλεχος μπορεί να παράγει πολλά ένζυμα (2-5) Κωδικοποιούνται από χρωμόσωμα ή από πλασμίδια Τελευταία τα αντίστοιχα γονίδια φέρονται σαν γονιδιακές κασέτες μέσα σε ιντεγκρόνια που κωδικοποιούν μεταλλο-β-λακταμάσες