Εργαστηριακή άσκηση 7: Ανοσοενζυμικοί προσδιορισμοί Εργαστήριο Ανοσολογίας Εαρινό εξάμηνο 2019 Υπεύθυνες Διδασκαλίας: Βογιατζάκη Χρυσάνθη, Τσουμάνη Μαρία

Εισαγωγικά στοιχεία Ορισμός: Οι ανοσοχημικοί προσδιορισμοί είναι αναλυτικές μέθοδοι που στηρίζονται στη χρήση αντισωμάτων με υψηλή εξειδίκευση έναντι ενός συγκεκριμένου αντιγόνου (Ag) ή αντισώματος (Ab). Οι ανοσοπροσδιορισμοί εμφανίστηκαν για πρώτη φορά το 1959, με την μορφή της ραδιοανοσοανάλυσης (RIA) για τη μέτρηση της ινσουλίνης και το 1960 για τον ποσοτικό προσδιορισμός της θυροξίνης. Η εμφάνιση και η εξέλιξη της τεχνολογίας των υβριδωμάτων και των μονοκλωνικών αντισωμάτων συντέλεσε στην εξέλιξη των ανοσοχημικών τεχνικών και την ανάπτυξη μεθόδων με νέα βελτιωμένα χαρακτηριστικά και μεγαλύτερη ευαισθησία Εφαρμογές: μέτρηση πολλών πρωτεϊνικών μορίων, ορμονών θεραπευτικός έλεγχος φαρμάκων ή τοξικών ουσιών στον ορό, στο πλάσμα, στο αίμα, στους ιστούς και τα όργανα Πλεονεκτήματα: Απλοί, γρήγοροι, ευαίσθητοι προσδιορισμοί Εύκολα αυτοματοποιούμενοι για να εφαρμοστούν σε αναλύσεις ρουτίνας στα κλινικά εργαστήρια Απαιτείται μικρός όγκος δειγμάτων. Χωρίς ιδιαίτερη επεξεργασία δειγμάτων

Αρχή μεθόδων Για την ανίχνευση του ανοσοσυμπλόκου Ag-Ab μπορεί να χρησιμοποιηθούν είτε μη επισημασμένα αντιδρώντα ή ένα επισημασμένο αντιδραστήριο. Κατά την σύνδεση του ιχνηθέτη με το ανοσοσύμπλοκο παράγεται ένα σήμα που μετράται από έναν ειδικό ανιχνευτή. Ανοσοχημικοί προσδιορισμοί Ανταγωνιστικές Μη ανταγωνιστικές ανάλογα με τον αριθμό των αντισωμάτων που συμμετέχουν στις ανοσοχημικές αντιδράσεις Ισοτοπικές Μη ισοτοπικές ανάλογα με τον τύπο του σήματος που μετράται Ανοσοχημικοί προσδιορισμοί άμεσες έμμεσες ανάλογα με την προσθήκη ή όχι δευτερογενούς αντισώματος Ομογενείς Ετερογενείς ανάλογα με το αν κατά την διαδικασία του προσδιορισμού γίνεται διαχωρισμός των σχηματιζόμενων ανοσοσυμπλόκων Ανοσοχημικοί προσδιορισμοί

Ανοσοενζυμικές τεχνικές Χημικές ενώσεις φωταύγειας Ανοσοχημικές τεχνικές Ανοσοενζυμικές τεχνικές Ενζυμα Χημειοφωταύγεια Χημικές ενώσεις φωταύγειας Ραδιοανοσοενζυμικές τεχνικές Ραδιοϊσότοπα Μέθοδοι που χρησιμοποιούν τουλάχιστον μία φορά αντισώματα. Δεδομένου ότι τα αντισώματα συνδέονται μόνο με πρωτεΐνες, είναι προφανές ότι οι μέθοδοι αυτοί χρησιμοποιούνται μόνο για τον ποσοτικό ή ποιοτικό προσδιορισμό πρωτεϊνών και όχι άλλης οργανικής ή ανόργανης ένωσης.

Ομογενείς και Ετερογενείς Ανοσοχημικές μέθοδοι Στις ετερογενείς μεθόδους τα αντισώματα είναι προσκολλημένα πάνω σε στερεή επιφάνεια. Τέτοιες συνηθισμένες επιφάνειες είναι ο πλαστικός πυθμένας των κοιλωμάτων (wells) μιας πλάκας μικρο-τιτλοδότησης, ο πυθμένας γυάλινων ή συνηθέστερα πλαστικών σωληναρίων και η επιφάνεια σφαιριδίων latex ή μαγνητικών σφαιριδίων. Η ένωση αντισώματος με πλαστική επιφάνεια και μαγνητικά σφαιρίδια γίνεται με ηλεκτροστατικές και κυρίως υδρόφοβες δυνάμεις. Στις ομογενείς ανοσοχημικές μεθόδους τα ανοσοσύμπλοκα παραμένουν σε διαλυτή μορφή μέσα στο διάλυμα αντίδρασης. Στις ομογενείς μεθόδους τα ενωμένα με τα αντισώματα αντιγόνα έχουν διαφορετική συμπεριφορά από τα μη συνδεδεμένα. Έτσι, είναι δυνατή η μέτρησή τους, χωρίς να χρειάζεται να απομακρυνθούν τα μη συνδεδεμένα.

Ανοσοενζυμικοί προσδιορισμοί Εισαγωγικά στοιχεία- Ιστορική αναδρομή 1966: Εμφανίστηκαν οι πρώτες μέθοδοι που χρησιμοποιούσαν συζευγμένο ένζυμο με αντίσωμα ή αντιγόνο . Οι Nakane και Pierce στην Καλιφόρνια, πρότειναν ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν ένζυμα αντί των φθοριοχρωμάτων για την δημιουργία επισημασμένων αντισωμάτων που θα χρησιμοποιηθούν σε ανοσοϊστολογικές εφαρμογές στις οποίες παράγεταιένα έντονα χρωματισμένο προϊόν το οποίο μπορεί να αναλυθεί με ένα συνηθισμένο μικροσκόπιο φωτός ή με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. 1967: Οι Avrameas και Uriel, στο ινστιτούτο Pasteur στην Γαλλία, δημοσίευσαν τη σύζευξη αντιγόνων ή αντισωμάτων με ένζυμα. Η βασική ιδέα ήταν ότι το σύμπλοκο ένζυμο-αντίσωμα διατηρεί την ικανότητα του να αναγνωρίζει το Ag αλλά επίσης μπορεί να διατηρεί την ικανότητα κατάλυσης του υποστρώματος του ενζύμου. 1972: Περιγράφηκαν ομοιογενείς ανοσοενζυμικοί προσδιορισμοί για τον προσδιορισμό φάρμακων στα ούρα 1973: EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique)

Ανοσοενζυμικοι προσδιορισμοί ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) Το αντίσωμα πρόσδεσης πρέπει να είναι ειδικό για το αντιγόνο στόχο και χρησιμοποιείται κυρίως σε ειδικό τύπο ELISA που ονομάζεται ELISA sandwich. Μετά την ακινητοποίηση, προστίθεται ένα αντίσωμα ανίχνευσης, το οποίο προσδένεται στο προσροφημένο αντιγόνο οδηγώντας έτσι στο σχηματισμό ενός συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος. Το αντίσωμα ανίχνευσης είναι είτε απευθείας συζευγμένο με ένα ένζυμο, όπως η υπεροξειδάση αγριοραπανίδας (HRP), είτε παρέχει μια θέση πρόσδεσης για ένα επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα. Γενικά, οι ομάδες ELISA μπορούν να ομαδοποιηθούν στις τέσσερις κύριες κατηγορίες: άμεσες, έμμεσες, sandwich και ανταγωνιστικές ELISA

Τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται κυρίως στην ELISA είναι η αλκαλική φωσφατάση ,η υπεροξειδάση της ραπανίδας (Horseadish peroxidase) και η οξειδάση της γλυκόζης . Ένα χρωμογόνο υπόστρωμα για το ένζυμο αποδίδει μια ορατή αλλαγή χρώματος ή φθορισμό, οπότε φανερώνεται η παρουσία του αντιγόνου. Με τον χρωματομετρικό προσδιορισμό μπορεί γίνει ποσοτική ή ποιοτική αξιολόγηση του δείγματος. Τα φθορίζοντα υποστρώματα έχουν μεγαλύτερη ευαισθησία και μπορούν να μετρήσουν με ακρίβεια τα επίπεδα των συγκεντρώσεων αντιγόνου στο δείγμα Η μέτρηση της έντασης του φωτός ή του χρώματος γίνεται με ειδικά όργανα (φωτόμετρα ή λουμινόμετρα). Από αυτή την μέτρηση παίρνουμε πληροφορίες για την ποσότητα των σχηματισμένων ανοσοσυμπλόκων και συνεπώς για την συγκέντρωση του αντιγόνου ή του αντισώματος που αναζητούμε στο δείγμα , η οποία και θα προσδιοριστεί με την χρήση πρότυπων καμπυλών αναφοράς

Τα ένζυμα και τα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται στους ανοσοενζυμικούς προσδιορισμούς Τα χρωμογόνα υποστρώματα οδηγούν στη παραγωγή έγχρωμου διαφανούς διαλύματος, το οποίο μπορεί να απορροφήσει φως συγκεκριμένου μήκους κύματος. Η απορρόφηση του φωτός μετράται σε κατάλληλο φωτόμετρο που μετατρέπει την απορρόφηση σε συγκέντρωση χρησιμοποιώντας συγκεκριμένη καμπύλη αναφοράς. Αντίθετα, τα φθορίζοντα υποστρώματα παράγουν φθορισμό ύστερα από τη διέγερση τους με φως συγκεκριμένου μήκους κύματος. Η ένταση του φθορισμού μετατρέπεται σε συγκέντρωση, βάση καμπύλης αναφοράς, κατά κανόνα σε ειδικό αναλυτή. Γενικά τα φθορίζοντα υποστρώματα αποτελούν τη βασική επιλογή στις αυτοματοποιημένες ανοσοενζυμικές μεθόδους. Η επιλογή κάθε ενζύμου και υποστρώματος γίνεται με βάση την προσδοκώμενη ευαισθησία, επαναληψιμότητα, ταχύτητα αντίδρασης, τυχόν παρεμβολές στην αναλυτική μέθοδο και άλλα κ.α. Για παράδειγμα τα φθορίζοντα υποστρώματα εξασφαλίζουν μεγαλύτερη ευαισθησία από τα χρωμογόνα. Η υπεροξειδάση απαιτεί μικρότερη επώαση από τα άλλα δύο ένζυμα, ενώ η αλκαλική φωσφατάση και η β-γαλακτοσιδάση εξασφαλίζουν καλύτερη επαναληψιμότητα, μετά από μεγάλο χρόνο επώασης.

Τα ένζυμα και τα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται στους ανοσοενζυμικούς προσδιορισμούς

Η ένωση ενζύμου-υποστρώματος Η ένωση ενζύμου - υποστρώματος απαιτεί συγκεκριμένες χημικές συζεύξεις, δηλαδή χημικές γέφυρες. Οι συζεύξεις αυτές άλλοτε εξασφαλίζουν απλά τη σταθερή ένωση ενζύμου και αντισώματος και άλλοτε ενισχύουν σημαντικά το παραγόμενο σήμα. Αυτές οι συζεύξεις γίνονται με :  Υπεριωδικό νάτριο. Χρησιμοποιείται αποκλειστικά για τη σύζευξη της υπεροξειδάσης με αντισώματα μέσω της υδατανθρακικής περιοχής του αντισώματος και της υπεροξειδάσης. Επειδή η υδατανθρακική περιοχή δεν συμμετέχει συνήθως στην ένωση ενζύμου και αντισώματος δεν επηρεάζεται η ενζυμική δραστικότητα.  Γλουταλδεύδη. Εξασφαλίζει τη διασταυρούμενη αντίδραση μεταξύ ενζύμου και αντισώματος μέσω των ελεύθερων ε-αμινομάδων της λυσίνης.  Σύμπλεγμα αβιδίνης – βιοτίνης και στρεπταβιδίνης - βιοτίνης. Η βιοτίνη είναι μία μικρή πρωτεΐνη (ΜΒ = 244 D) που ανήκει στη κατηγορία των βιταμινών (βιταμίνες Η, Β7). Βρίσκεται σε όλα τα κύτταρα και παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές μεταβολικές διαδικασίες. Η βιοτίνη μπορεί να ενωθεί με πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες μεταξύ των οποίων ένζυμα και αντισώματα, δημιουργώντας μεταξύ τους μία γέφυρα ανάμεσα στο ένζυμο και το αντίσωμα. Λόγω μεγέθους όμως, μπορεί να ενωθεί είτε με το ένα, είτε με το άλλο. Για να επιτελέσει επομένως τον ρόλο της χρειάζεται ένα ακόμα ενδιά-μεσο μόριο. Αυτό μπορεί να είναι είτε η αβιδίνη, είτε η στρεπταβιδίνη. Η αβιδίνη είναι ένα μόριο με 4 ενεργά κέντρα (ΜΒ περίπου 65000 D) με τα οποία μπορεί να αντιδράσει με τη βιοτίνη, αλλά και πολλές άλλες πρωτεΐνες με μη ειδικό τρόπο. Βρίσκεται σε πολλά κύτταρα και παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές μεταβολικές διαδικασίες. Πλεονεκτεί από τη στρεπταβιδίνη στο ότι παράγεται εύκολα από αυγά κότας. Η στρεπταβιδίνη παρόμοια με την αβιδίνη είναι ένα τετραμερές μόριο μοριακού βάρους 60.000 D. Σε αντίθεση με την αβιδίνη επιτυγχάνει ειδική σύνδεση με τη βιοτίνη λόγω της διαφορετικής αμινοξικής της ακολουθίας. Η παραγωγή της όμως, είναι δυσκολότερη και μεγαλύτερου κόστους, αφού προέρχεται από τον Streptomyces avidinii.

ΑΜΕΣΗ ELISA Η άμεση ανίχνευση ELISA είναι πολύ πιο γρήγορη από άλλες τεχνικές ELISA καθώς απαιτούνται λιγότερα βήματα. Η δοκιμασία είναι επίσης λιγότερο επιρρεπής στο σφάλμα δεδομένου διότι απαιτούνται λιγότερα αντιδραστήρια και βήματα, δηλαδή δεν χρειάζονται δευτερεύοντα αντισώματα. Παρ΄όλα αυτά υπάρχουν ορισμένα μειονεκτήματα αυτής της μεθόδου. Καθώς η ακινητοποίηση του αντιγόνου δεν είναι ειδική για το συγκεκριμένο αντιγονο, μπορεί να παρατηρηθεί υψηλότερη μη ειδική σύνδεση ( background) σε σύγκριση με την έμμεση ELISA . Αυτό συμβαίνει κυρίως επειδή δεσμεύονται στην πλάκα όλες οι πρωτεΐνες στο δείγμα, συμπεριλαμβανομένης της πρωτεΐνης στόχου. Η άμεση ELISA είναι λιγότερο ευέλικτη δεδομένου διότι απαιτείται ένα ειδικό συζευγμένο πρωτογενές αντίσωμα για κάθε πρωτεΐνη-στόχο. Καθώς δεν χρησιμοποιείται δευτερογενές αντίσωμα, δεν υπάρχει ενίσχυση σήματος, η οποία μειώνει την ευαισθησία της δοκιμασίας. Τέλος, η τεχνική άμεσης ELISA χρησιμοποιείται συνήθως όταν πρέπει να αναλυθεί η ανοσολογική απόκριση σε ένα αντιγόνο

ΑΜΕΣΗ ELISA ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Λιγότερο ευέλικτη Λιγότερο επιρρεπής σε σφάλμα διότι απαιτούνται λιγότερα αντιδραστήρια και λιγότερα βήματα Κάθε πρωτεΐνη-στόχος χρειάζεται ένα ειδικό συζευγμένο πρωτογενές αντίσωμα Χωρίς ενίσχυση σήματος - μειωμένη ευαισθησία της ανάλυσης Καλύτερη όταν αναλύεται η ανοσολογική απόκριση έναντι ενός αντιγόνου. Η ακινητοποίηση του αντιγόνου δεν είναι συγκεκριμένη - μπορεί να προκαλέσει υψηλότερο background από ό,τι η έμμεση ELISA.

ΕΜΜΕΣΗ ELISA Το ανωτέρω σχήμα δείχνει πώς πραγματοποιείται μια έμμεση δοκιμασία ELISA. Το αντιγόνο προσροφάται σε φρεάτιο σε πλάκα μικροτιτλοποίησης ELISA. Η ανίχνευση είναι μια διαδικασία δύο σταδίων. Πρώτον, ένα μη επισημασμένο πρωτεύον αντίσωμα συνδέεται με το συγκεκριμένο αντιγόνο. Δεύτερον, εφαρμόζεται ένα συζευγμένο με ένζυμο δευτερογενές αντι-ισοτυπικό αντίσωμα το οποίο κατευθύνεται εναντίον του ξενιστικού είδους του πρωτογενούς αντισώματος.Η έμμεση δοκιμασία ELISA έχει υψηλή ευαισθησία δεδομένου ότι περισσότερα από ένα επισημασμένα αντι-ισοτυπικά αντισώματα μπορούν να δεσμεύσουν το πρωτογενές αντίσωμα. Είναι πιο οικονομική από την άμεση ELISA διότι απαιτούνται λιγότερα επισημασμένα αντισώματα. Η έμμεση ELISA παρέχει μεγαλύτερη ευελιξία δεδομένου ότι διαφορετικά πρωτογενή αντισώματα μπορούν να ελεγχθούν χρησιμοποιώντας ένα μόνο επισημασμένο δευτερεύον αντίσωμα. Μεταξύ των μειονεκτημάτων του είναι η πιθανότητα διασταυρούμενης αντιδραστικότητας του δευτερογενούς αντισώματος στο προσροφημένο αντιγόνο, η οποία θα μπορούσε να αυξήσει την μη ειδική σύνδεση. Επίσης, οι έμμεσοι προσδιορισμοί ELISA διαρκούν περισσότερο χρόνο από ό, τι οι άμεσες ELISA, αφού απαιτείται ένα επιπλέον στάδιο επώασης για το δευτερογενές αντίσωμα..

ΕΜΜΕΣΗ ELISA ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Υψηλή ευαισθησία - περισσότερα από ένα επισημασμένα δευτερεύοντα αντισώματα μπορούν να δεσμεύσουν το πρωτογενές αντίσωμα Πιθανότητα αυξημένης μη ειδικής σύνδεσης (background) – τo δευτερογενές αντίσωμα μπορεί να είναι διασταυρούμενα αντιδραστικό (cross-reactive) Οικονομική διαδικασία - απαιτούνται λιγότερα επισημασμένα αντισώματα Μεγαλύτερη διαδικασία από την άμεση δοκιμασία ELISA - απαιτείται επιπλέον στάδιο επώασης για τα δευτερογενή αντισώματα Μεγαλύτερη ευελιξία - διάφορα πρωτογενή αντισώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν με ένα μόνο επισημασμένο δευτερεύον αντι-ισοτυπικό αντίσωμα Καλύτερη για: προσδιορισμό της ολικής συγκέντρωσης αντισωμάτων σε δείγματα.

Μη Ανταγωνιστικές μέθοδοι ELISA Όταν το αντιγόνο έχει δύο επιτόπους μπορεί να συνδεθεί με δύο αντισώματα η μέθοδος που εφαρμόζεται ονομάζεται μη ανταγωνιστική ή αλλιώς Sandwitch. Οι μέθοδοι ELISA Sandwich απαιτούν τη χρήση αντιστοίχων ζευγών αντισωμάτων (αντισώματα δέσμευσης και ανίχνευσης) όπως φαίνεται στο παρακάτω σχήμα. Κάθε αντίσωμα είναι συνεπώς ειδικό για μια διαφορετική και μη επικαλυπτόμενη περιοχή ή επίτοπο του αντιγόνου. Σε αυτή την περίπτωση το αντιγόνο ακινητοποιείται μεταξύ δύο αντισωμάτων. Το πρώτο αντίσωμα είναι σταθερά ενωμένο πάνω σε στερεή φάση και το δεύτερο φέρει τη σήμανση (άμεση ELISA sandwich). Εάν το χρησιμοποιούμενο αντίσωμα ανίχνευσης δεν είναι επισημασμένο, απαιτείται ένα δευτερεύον αντίσωμα ανίχνευσης συζευγμένο με ένζυμο. Αυτό είναι γνωστό ως έμμεση ELISA sandwich. Στη δοκιμασία sandwich το σήμα είναι ανάλογο της συγκέντρωσης του αντιγόνου και αυξάνεται, όσο αυξάνεται η συγκέντρωσή του.

Μη Ανταγωνιστικές μέθοδοι ELISA ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Υψηλή ευαισθησία - 2-5 φορές πιο ευαίσθητη από την άμεση ή έμμεση ELISA Η βελτιστοποίηση αντισωμάτων μπορεί να είναι δύσκολη - μπορεί να εμφανιστεί διασταυρούμενη αντιδραστικότητα μεταξύ των αντισωμάτων δέσμευσης και ανίχνευσης. Χρειάζεται ένα τυποποιημένο κιτ ELISA ή ζεύγος αντισωμάτων. Υψηλή εξειδίκευση - δύο αντισώματα εμπλέκονται στη σύλληψη και ανίχνευση Ευελιξία - μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο για άμεση όσο και έμμεση ανίχνευση Καλύτερη για: ανάλυση σύνθετων δειγμάτων, δεδομένου ότι το αντιγόνο δεν χρειάζεται να καθαριστεί πριν από τη μέτρηση.

Ανταγωνιστικές μέθοδοι ELISA Επίσης γνωστές ως ELISA αναστολής. Με αυτές τις δοκιμασίες μετράται η συγκέντρωση ενός αντιγόνου με ανίχνευση της αναστολής σύνδεσης του αντισώματος. Κάθε είδος ΕLISA μπορεί να προσαρμοστεί στην ανταγωνιστική μορφή. Το αντιγόνο δείγματος ανταγωνίζεται με ένα αντιγόνο αναφοράς για σύνδεση με μια συγκεκριμένη ποσότητα σημασμένου αντισώματος. Το αντιγόνο αναφοράς είναι επιστρωμένο σε πλάκα μικροτιτλοποίησης. Το δείγμα που περιέχει το προς ανίχνευση αντιγόνο προ-επωάζεται με συγκεκριμένη ποσότητα επισημασμένου αντίσωματος και προστίθεται στα φρεάτια. Ανάλογα με την ποσότητα αντιγόνου στο δείγμα, περισσότερα ή λιγότερο ελεύθερα αντισώματα θα είναι διαθέσιμα για τη δέσμευση του αντιγόνου αναφοράς. Αυτό σημαίνει ότι όσο περισσότερο αντιγόνο υπάρχει στο δείγμα, τόσο λιγότερο αντιγόνο αναφοράς θα ανιχνευθεί και τόσο ασθενέστερο θα είναι το σήμα.Ορισμένα ανταγωνιστικά κιτ ELISA χρησιμοποιούν επισημασμένο αντιγόνο αντί για σημασμένο αντίσωμα. Το σημασμένο αντιγόνο και το αντιγόνο δείγματος (μη επισημασμένο) ανταγωνίζονται για σύνδεση με το πρωτογενές αντίσωμα. Όσο χαμηλότερη είναι η ποσότητα αντιγόνου στο δείγμα, τόσο ισχυρότερο είναι το σήμα που οφείλεται σε περισσότερο επισημασμένο αντιγόνο στο φρεάτιο.

Ανταγωνιστικές μέθοδοι ELISA ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Κύριο πλεονέκτημα - δεν απαιτείται επεξεργασία δείγματος και μπορούν να χρησιμοποιηθούν ακατέργαστα ή ακάθαρτα δείγματα αντιγόνου Ίδιοι περιορισμοί με τις προηγούμενες δοκιμασίες ELISA - καθώς κάθε τεχνική ELISA μπορεί να προσαρμοστεί σε ανταγωνιστική μορφή Περισσότερο αξιόπιστη - μικρότερη μεταβλητότητα στα αποτελέσματα των διπλών θέσεων εξέτασης (duplicate) των δειγμάτων Μέγιστη ευελιξία - μπορεί να βασίζεται σε άμεση, έμμεση ή sandwich ELISA Καλύτερη για να χρησιμοποιείται συνήθως όταν μόνο ένα αντίσωμα είναι διαθέσιμο για το αντιγόνο που μας ενδιαφέρει. Είναι επίσης κατάλληλο για ανίχνευση μικρών αντιγόνων που δεν μπορούν να συνδεθούν με δύο διαφορετικά αντισώματα όπως στην τεχνική ELISA sandwich

Ανοσοενζυμική Ενισχυμένη μέθοδος (Enzyme Multiplied Immunoassay Τechnique ή EMIT) Η ανοσοενζυμική ενισχυμένη μέθοδος (Enzyme Multiplied Immunoassay Τechnique ή EMIT χρησιμοποιείται ευρέως για τη μέτρηση ναρκωτικών και φαρμακευτικών ουσιών. Ο ιχνηθέτης της μεθόδου είναι το ένζυμο αφυδρογονάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης (G6- PD). D-γλυκόζη-6-φωσφορική + NAD(P) ⇔ D-γλυκονο-δ-λακτόνη-6-φωσφορική + NAD(P)H2 Το ένζυμο αυτό όταν προστίθεται σε διάλυμα που περιέχει το αντιγόνο, δηλ. το φάρμακο ή τη ναρκωτική ουσία, ενώνεται μαζί του και σχηματίζει σύμπλοκο. Στο σύμπλοκο αυτό το ένζυμο είναι ενεργό, αλλά η ενεργότητα του μειώνεται, μόλις το σύμπλοκο ενζύμου- φαρμάκου ενωθεί με το ειδικό για το αντιγόνο αντίσωμα. Η μείωση της ενεργότητας οφείλεται στο γεγονός ότι το αντίσωμα δεσμεύει το ενεργό κέντρο του ενζύμου και έτσι εμποδίζεται η σύνδεση του ενζύμου με το υπόστρωμα του, την 6-φωσφορική γλυκόζη μειώνοντας την ποσότητα ανάπτυξης χρώματος. Η μέθοδος είναι ανταγωνιστικού τύπου. Όσο περισσότερο φάρμακο υπάρχει στον ορό του ασθενούς τόσο περισσότερο από αυτό θα συνδεθεί με τα αντισώματα και άρα τόσο περισσότερο αντιγόνο επισημασμένο με ένζυμα παραμένει ελεύθερο να αντιδράσει με το χρωμογόνο.Η ανάπτυξη χρώματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αντιγόνου. Το φωτόμετρο του αναλυτή μετρά την απορρόφηση του NADH της οποίας η μέγιστη τιμή εμφανίζεται σε διαφορετικό μήκος κύματος από το συνένζυμο NAD+.

Ραδιοανοσοανάλυση (Radioimmunoassay, RIA) Στηρίζεται στην αρχή των ανταγωνιστικών ανοσοχημικών μεθόδων και είναι μόνο ετερογενής, δηλαδή το αντιγόνο του ασθενούς ανταγωνίζεται το ραδιοεπισημασμένο αντιγόνο δηλαδή το αντιγόνο του αντιδραστηρίου που φέρει και ιχνηθέτη. Σαν ιχνηθέτης για τον αναλύτη χρησιμοποιείται ο ίδιος ο αναλύτης (φάρμακο, ορμόνη, βιταμίνη κλπ.) ή κάποιο άλλο μόριο ανάλογης δομής μετά όμως από την σύνδεση του με κάποιο ραδιοϊσότοπο όπως 3Η , 14C , 131I , 125I , 75Se . Ισότοπα ονομάζονται οι ατομικοί πυρήνες του ίδιου στοιχείου που έχουν τον ίδιο ατομικό αριθμό δηλαδή αριθμό πρωτονίων αλλά διαφορετικό αριθμό νετρονίων. Προκειμένου να αποκτήσουν σταθερότητα στον πυρήνα τους ακτινοβολούν. Ακτινοβολία β: Ηλεκτρόνια ή ποζιτρόνια Ακτινοβολία γ: Ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία 131I (χρόνος ημίσειας ζωής 8 ημέρες) 125I (χρόνος ημίσειας ζωής 60 ημέρες)

Ραδιοανοσοανάλυση (Radioimmunoassay, RIA) Η περίσσεια των Αg* και Ag που δεν συμμετέχουν στην αντίδραση απομακρύνονται μετά από πλύση. Η απομάκρυνση του ελεύθερου Ag* έχει ως αποτέλεσμα η ακτινοβολία του αντιδρώντος μίγματος να προέρχεται εξ’ολοκλήρου από το ακινητοποιημένο Ag*Ab. Η μέτρηση της ακτινοβολίας γίνεται με μετρητή σπινθηρισμού (Scintillation counter) ή με μετρητή γ – ακτινοβολίας (gamma – counter). Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε κρούσεις ανά λεπτό (cpm) Τα φωτόνια από το ισότοπο απορροφόνται από τον κρύσταλλο ΝaI του αναλυτή και παράγεται σπινθηρισμός. Η μέτρηση της ακτινοβολίας θα χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της ποσότητας του αντιγόνου στο δείγμα με τη βοήθεια καμπύλης αναφοράς , που θα δημιουργηθεί με πρότυπα δείγματα γνωστών συγκεντρώσεων για το συγκεκριμένο αντιγόνο

Εφαρμογές και χαρακτηριστικά της RIA Πλεονεκτήματα Μεγάλη ευαισθησία (10-8 έως 10-10 Μ) Απλή διαδικασία Χαμηλό κόστος Μικρό σφάλμα μεταξύ των μετρήσεων Επανάληψη των μετρήσεων στα δείγματα Μειονεκτήματα Μεγάλη επικινδυνότητα για την υγεία Παρουσία εξειδικευμένου προσωπικού (με ειδική άδεια για τη διαχείριση ισοτόπων) αφού πρέπει να χειριστούν ραδιενεργοί ιχνηθέτες τόσο κατά την παρασκευή της όσο και την αποθήκευση και χρήση τους όπως και κατά την απόρριψη τους μετά την δοκιμασία Εφαρμογές: Ανίχνευση ναρκωτικών ουσιών, φαρμακευτικών ουσιών, μέτρηση στεροειδών και πεπτιδικών ορμόνων και ανοσοσφαιρίνων, μέτρηση των επιπέδων της αυξητικής ορμόνης, καθώς και για την έρευνα των χημικών ουσιών του εγκεφάλου ,τους νευροδιαβιβαστές. Το σημαντικότερο πλεονέκτημα της RIA στη μέτρηση των ενώσεων σε βιολογικά υγρά είναι η ακρίβεια και η εξαιρετική ευαισθησία, που δεν μπορούν να επιτευχθούν με άλλες αναλυτικές τεχνικές

Ανοσοραδιομετρική ανάλυση (Immunoradiometric Assay , IRMA) Σε αυτού του τύπου τους ανοσοχημικούς προσδιορισμούς το αντίσωμα είναι αυτό που έχει σημανθεί με ραδιενεργό ισότοπο και προστίθεται στο δείγμα σε περίσσεια . Όλα τα μόρια του αντιγόνου του δείγματος που μετράται θα ενωθούν με το ραδιενεργό αντίσωμα , στην συνέχεια θα διαχωριστεί το σύμπλοκο αντιγόνου – αντισώματος από το ελεύθερο αντίσωμα όπως και την τεχνική της RIA και θα μετρηθεί η ακτινοβολία του ανοσοσυμπλόκου. Στην τεχνική αυτή η συγκέντρωση του αντιγόνου που θα μετρηθεί είναι ανάλογη με την ένταση της ακτινοβολίας που θα καταγραφεί από τον κατάλληλο ανιχνευτή. H ανοσοραδιομετρική μέθοδος έχει εφαρμοστεί σε ευρύ φάσμα πρωτεϊνών, όπως η ινσουλίνη , η ανθρώπινη αυξητική ορμόνη, η ορμόνη διέγερσης ωοθυλακίων και ωχρινοτρόπος ορμόνη, παραθυρεοειδής ορμόνη, IgG, καλσιτονίνες χοίρου και ανθρώπου, και φερριτίνη.

Ραδιοαλλεργιολογική απορρόφηση (Radioallergosorbent technique, RAST) Το 1967, οι Wide ,Bennich και Johansson εισήγαγαν την τεχνική της ραδιοαλλεργιολογικής απορρόφησης (RAST) που χρησιμεύει στην ανίχνευση της ποσότητας των IgE που αντιδρά ειδικά με τα υπο εξέταση αλλεργιογόνα τα οποία είναι συζευγμένα ομοιοπολικά σε έναν ανοσοπροσροφητικό δίσκο χαρτιού. Πρόκειται για μια μέθοδο στερεής φάσης που περιλαμβάνει τη σύνδεση του αλλεργιογόνου-αντιγόνου σε ένα αδιάλυτο υπόστρωμα όπως σωματίδια δεξτράνης ή Sepharose. Ο ορός του ασθενούς διαβιβάζεται πάνω από το ακινητοποιημένο αλλεργιογόνο με αποτέλεσμα τη δέσμευση των ειδικών IgE αντισωμάτων του ορού με το αλλεργιογόνο. Ακολουθεί έκπλυση για να απομακρυνθεί το μη δεσμευμένο αντίσωμα, και στη συνέχεια προστίθεται ραδιοεπισημασμένο αντι-IgΕ αντίσωμα ανθρώπου ,που αντιδρά με το δεσμευμένο αντίσωμα IgE. Για να είναι ακριβής η δοκιμασία πρέπει το αλλεργιογόνο αλλά και το αντίσωμα κατά της IgΕ να είναι σε περίσσεια. Η ποσότητα της ραδιενέργειας στα πλακίδια είναι ανάλογη με την ποσότητα του αντισώματος στον ορό του ασθενούς.

Χημειοφωταύγεια Η χημειοφωταύγεια (CIA, ICMA) είναι το φυσικό φαινόμενο της παραγωγής φωτεινής ακτινοβολίας από μία εξώθερμη χημική αντίδραση (A+B). Η οξειδοαναγωγική αυτή αντίδραση παρέχει την ενέργεια σε προϊόν της, ώστε αυτό να διεγερθεί (C*). Καθώς αμέσως αποδιεγείρεται για να επιστρέψει σε σταθερή ενεργειακή κατά-σταση (C), εκπέμπει χαρακτηριστική φωτεινή ακτινοβολία (hv). Η συνολική αντίδραση περιγράφεται απλο-ποιημένα από την εξίσωση: A + B → C* → C + hν Η απόδοση της αντίδρασης σε φωτεινή ακτινοβολία, δηλαδή ο αριθμός των φωτονίων ανά μόριο αντιδρώντος, εκφράζεται από τον «λόγο απόδοσης» που ισούνται με το κλάσμα: αριθμός εκπεμπόμενων φω-τονίων / αριθμός μορίων Α ή Β. Η μέγιστη τιμή του λόγου είναι η μονάδα, προς την οποία πλησιάζει η εκπο-μπή του φωτός, που παράγει το έντομο της πυγολαμπίδας κατά την οξείδωση του μορίου της λουσιφερόλης. Στην εργαστηριακή πάντως τεχνολογία το σήμα της χημειοφωταύγειας ονομάζεται «σχετική μονάδα φωτός» (Relative Light Unit). Τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα σήμερα μόρια παραγωγής φωταύγειας είναι οι κυκλικές υδρα- ζίδες (λουμινόλη, ισολουμινόλη, αμινικά παράγωγα της ισολουμινόλης), οι εστέρες της ακριδίνης, τα διοξετάνια και τα άλατα του ρουθηνίου. Η χημειοφωταύγεια αποτελεί τη νεώτερη ανοσοχημική μέθοδο και την πλέον αυτοματοποιημένη. Είναι ταχύτατη, προσεγγίζει την ευαισθησία των ραδιοανοσολογικών μεθόδων, αλλά παράλληλα είναι ασφα-λέστερη από αυτές. Οι μέθοδοι της χημειοφωταύγειας έχουν όμως μεγάλο κόστος, δεδομένου ότι παρέχονται πλήρως αυτοματοποιημένες.

Διεξαγωγή της εργαστηριακής άσκησης Βασικά αντιδραστήρια και αναλώσιμα που περιέχονται στα kits της ELISA Πηγαδάκια μικροτιτλοδότησης: Πρόκειται για πλαστική πλάκα που περιέχει 96 μικροπηγαδάκια (microwells) και είναι επικαλυμμένα με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης που θέλουμε να μετρήσουμε. Ο όγκος των αντιδραστηρίων που μπορούν να χωρέσουν, είναι περίπου 300 μL Βαθμονομητές (standards ή calibrators). Για τους ποσοτικούς προσδιορισμούς χρησιμοποιούνται πολλά standards, συνήθως 1 έως 6. Πρόκειται για μικρά φιαλίδια του 1 mL έτοιμα προς χρήση. Χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία της καμπύλης αναφοράς (calibration). Διαλύματα ελέγχου (control samples). Πρόκειται για μικρά φιαλίδια συνήθως των 0,5 mL με διαφορετικού χρώματος καπάκια για να ξεχωρίζουν. Σύζευγμα ενζύμου (conjugate). Περιέχει αντίσωμα ενωμένο με ένζυμο. Eίναι έτοιμο προς χρήση. Υπόστρωμα (substrate). Είναι η ουσία που θα αντιδράσει με το ένζυμο του conjugate. Αυτή η χημική αντίδραση θα παράγει χρώμα του οποίου η ένταση θα μετρηθεί στο φωτόμετρο. Διάλυμα τερματισμού της αντίδρασης (stop solution). Πρόκειται για ένα ισχυρό οξύ (H2SO4), που χρησιμεύει για τη διακοπή της αντίδρασης ενζύμου και υποστρώματος. Αμέσως μετά μπορεί να γίνει η φωτομέτρηση. Διάλυμα πλύσης (wash solution). Πρόκειται για ένα συμπυκνωμένο διάλυμα (π.χ. 40Χ), το οποίο πρέπει να αραιωθεί πριν τη χρήση του με απεσταγμένο νερό.