Ilgdzīvotības molekulāri ģenētisko pamatu izpēte Latvijas populācijā (Projekts LU 2006/1-229722, 2006.g.) Projekta vadītājs: Prof. V.Baumanis - LU Bioloģijas fakultāte Izpildītāji: L. Pliss PhD stud. biol. R.Ranka Dr.biol. A.Bormane PhD stud.biol. A.Zeltiņa M. Sc. pharm. E. Zandberga PhD stud. biol. A. Brakmanis stud.med. M. Baušķenieks stud. biol. mag. V. Čapligina M. Sc. biol. A. Puzuka PhD stud. biol. L. Berezina PhD stud. biol. Konsultante: A. Krūmiņa - Prof. , Dr. habil. biol., RSU

Bioloģiskais pulkstenis strādā, bet kas un kā to darbina? From Erik H. Erikson, Childhood and Society (New York: W.W. Norton, 1963).

Mitohondriālā bioenerģētika Pulksteņa darbināšanai vajag enerģiju. Mitohondriji ir šūnu spēkstacijas. Vai bioloģiskā pulksteņa defekti meklējami mitohondrijos? Mitohondriālā bioenerģētika Wallace, 2005 1) Oksidatīvā fosforilēšana (OXPHOS) 2) Krebsa cikls 3) Taukskābju β – oksidācija 4) Apoptoze (citohroms C)

Mitohondriālais genoms nav liels - 16. 569 bāzu pāru un satur 37 gēnus Mitohondriālais genoms nav liels - 16.569 bāzu pāru un satur 37 gēnus. Mutācijas var būt gan gēnos , gan ārpus tiem. Mutācijas var būt dažādas: regulatorās adaptīvās slimību izraisošās

Adaptīvās mutācijas Adaptīvās mutācijas bieži notiek mtDNS kodona trešajā nukleotīdā (AGA), neizraisot aminoskābju nomaiņu Adaptīvās mutācijas ir populāciju specifiskas un nostabilizējas mtDNS evolūcijas laikā, populācijai pielāgojoties apkārtējas vides apstākļiem Iedzimtais mtDNS genotips: Haplotips – konkrēts mtDNS sekvences tips, kas var būt unikāls vai arī atrasts vairākos indivīdos Haplogrupa – līdzīgu haplotipu kopums, kuriem ir viena vai vairākas kopīgas alēles

Mutācijas nosaka haplogrupas Mutācijas nosaka haplogrupas. Dažādu haplogrupu pārstāvji atšķiras ar ilgdzīvotāju īpatsvaru Japānas ilgdzīvotājiem ir raksturīga biežāka D haplogrupas sastopamība (Tanaka et al., 2002) Starp Itālijas un Somijas ilgdzīvotājiem ir konstatēta palielināta J haplogrupas sastopamība (De Benedictis et al., 1999; Niemi et al., 2003) Starp Īrijas un Francijas ilgdzīvotājiem ir konstatēts paaugstināts K haplogrupas biežums (Ross et al., 2001; Ivanova et al., 1998)

“Novecošanās pulkstenis” (“Ageing Clock”) Wallace, 2005 Mutāciju uzkrāšanās mitohondriālajā DNS ir saistīta ar “novecošanās pulksteņa” mehānismu

Darba mērķis un uzdevumi Noteikt, vai Latvijas populācijā pastāv saistība starp mtDNS haplogrupām un novecošanās procesa gaitu Noteikt mtDNS hipervariablo segmentu (HVS-I un HVS-II) mutācijas un mtDNS haplogrupas indivīdiem vecumā no 74 līdz 89 gadiem Salīdzināt iegūtos rezultātus ar kontroles grupas (indivīdi vecumā no 18 līdz 40 gadiem) datiem Noteikt mtDNS heteroplazmijas biežumu un tās saistību ar novecošanos Latvijas populācijā Noteikt mtDNS heteroplazmijas sastopamību HVS-I segmentā indivīdiem vecumā no 74 līdz 89 gadiem

Paraugi 98 vecāko indivīdu grupas paraugi (no Latvijas cilvēka Genoma projekta DNS kolekcijas) 299 kontroles grupas paraugi (no RSU medicīniskās bioloģijas un ģenētikas katedras DNS kolekcijas)

Metodes mutāciju analīzei un haplogrupu noteikšanai HVS-I un HVS-II segmentu tieša nukleotīdu sekvenēšana mtDNS kodējošā rajona RFLP analīze Datu statistiskā apstrāde

mtDNS heteroplazmija Heteroplazmija ir divu vai vairāku ģenētiski atšķirīgu mtDNS sekvenču klātbūtne vienā indivīdā Heteroplazmija var būt pārmantota vai radusies somatisku mutāciju rezultātā Somatiskajos audos notikušās mutācijas traucē enerģijas produkciju šūnās, bet mirst kopā ar indivīdu, kurā radušās Mutācijas, kas radušās sievietes dzimumšūnās, tiek nodotas nākamajai paaudzei (jauni mtDNS polimorfismi vai slimība)

Heteroplazmijas sastopamība Pēc literatūras datiem heteroplazmijas sastopamība dažādos audos ir atšķirīga, un tās biežums pieaug, palielinoties indivīda vecumam Calloway et al. (2000) : heteroplazmiju atrada 11,6% pētāmo indivīdu ar atšķirīgu biežumu dažādās vecuma grupās homoplazmisko indivīdu vidējais vecums – 39.2 gadi heteroplazmisko indivīdu vidējais vecums – 69 gadi muskuļaudos heteroplazmija tika konstatēta biežāk nekā asinīs, sirds un smadzeņu audos

Metodes heteroplazmijas noteikšanai Hipervariablā segmenta I (HVS-I heteroplazmijas detektēšana ar denaturējošā gradienta gēla elektroforēzes (DGGE) metodi HVS-I segmenta tieša nukleotīdu sekvenēšana Datu statistiskā apstrāde

mtDNS kontroles rajons, kuru analizējot nosaka heteroplazmiju 7% mtDNS ir nekodējoša – tas ir kontroles rajons Kontroles rajonā ietilpst divi hipervariablie segmenti (HVS-I un HVS-II) Kontroles rajonā atrodas smagās ķēdes replikācijas sākuma vieta (OH) un abu ķēžu transkripcijas sākuma vietas (PH un PL)

Heteroplazmijas noteikšana ar DGGE metodi HVS-I segments tika analizēts no 15989 līdz 16258 pozīcijai un no 16144 līdz 16410 pozīcijai Praimeru R16258 un F16144 5’ galā ir pievienota 40 nt gara GC-virkne (CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G) Denaturējošās vielas – formamīds un urīnviela; denaturējošo vielu gradients 40%  50% Poliakrilamīda gēla gradients 5%  10% Elektroforēzes režīms: 100V, 40mA, 60˚C, 10 stundas

Rezultāti I Latvijas populācijas mtDNS haplogrupas Vecāko indivīdu grupā tika konstatēta paaugstināta J haplogrupas sastopamība (13%) salīdzinājumā ar kontroles grupu (6,4%) (χ2 = 3.92; p ≤ 0,05) Vecāko indivīdu grupā tika atrasts arī palielināts U haplogrupas biežums (29,6% versus 25,4%) Turpretim H haplogrupas sastopamība izrādījās augstāka kontroles grupā (44,5% versus 34,7%) H J U

Rezultāti II Adaptīvo mutāciju lokalizācija mtDNS: J haplogrupa: NADH dehidrogenāzes 6 subvienības (N6) gēnā 13074. pozīcijā U haplogrupa: tRNSLeu gēnā 12308. pozīcijā H haplogrupa: Citohroma C oksidāzes I subvienības (CO I) gēnā 7028. pozīcijā

Rezultāti III Heteroplazmijas apstiprināšana

Rezultāti IV Heteroplazmija un novecošanās

Secinājumi Latvijai raksturīgie mitohondrialās DNS haplotipi raksturīgi Eiropas populācijai un saskan ar literatūrā atspoguļotajiem datiem (piemēram, Somijas un Ziemeļitālijas populācijas; J, U un H haplogrupas) Novērotas nelielas atšķirības, kas norāda, ka mtDNS polimorfismu saistība ar novecošanos ir populāciju specifiska un ir atkarīga gan no vides faktoru ietekmes, gan no konkrētās populācijas genofonda Konstatēts mtDNS HVS-I segmenta heteroplazmijas biežuma pieaugums vecākās grupas indivīdiem (23%) salīdzinājumā ar kontroles grupu (15%) Palielinoties pētāmo indivīdu vecumam, pieaug arī pozīciju skaits, kurās heteroplazmija tiek detektēta, kas akcentē mutāciju uzkrāšanos

Turpmākie plāni Izveidot ilgdzīvotāju mtDNS kolekciju un noteikt haplogrupu un haplotipu sastopamību šo indivīdu starpā Atrast mtDNS mutāciju korelāciju ar noteiktiem bioķīmiskiem un bioenerģiskiem rādītājiem (fenotipisko īpašību raksturošana) Noteikt ilgdzīvotājiem heteroplazmijas biežumu mtDNS nekodējošā rajonā (HVS-I un HVS-II) Atrast populācijai specifisko mtDNS polimorfismu saistību ar novecošanos/ilgdzīvotību, ņemot vērā Latvijas etnoģenēzes ģenētisko daudzveidību Izpētīt ilgdzīvotājiem raksturīgo mtDNS “klusējošo” jeb sinonīmo mutāciju ietekmi uz mitohondriālā genoma stabilitāti, gēnu ekspresiju un OXPHOS komponentu sintēzi Noteikt iespējamo saistību starp mtDNS polimorfismiem citohroma C oksidāzes I, II un III subvienību gēnos un apoptozi (citohroma C izdalīšanos no mitohondrijiem).