DNS, RNS un proteīnu biosintēze

Παρουσίαση με θέμα: "DNS, RNS un proteīnu biosintēze"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 DNS, RNS un proteīnu biosintēze

2 Trīs galvenie procesi šūnā
Replikācija (DNS-DNS) Transkripcija (DNS-RNS) Translācija (RNS-proteīni)

3 Kurš process ir visnepieciešamākais dzīvībai?
Translācija ? Transkripcija ? Replikācija ? DNS RNS Proteīni Informācijas plūsma Informācijas nesēja replikācija

4 Galvenās atšķirības starp eikariotu un prokariotu šūnām
Eikariotos kodolam un citām organellām ir sava membrāna Prokariotiem nav citoskeleta Genoma organizācija ir ļoti atšķirīga Vērojamas lielas atšķirības bioķīmiskajos procesos, replikācijā, transkripcijā un translācijā

5 Kas notiek replikācijā?
1. DNS dubultspirāle atritinās 2. Pēc komplementaritātes principa uz abiem esošajiem DNS pavedieniem veidojas jauni

6 Replikācijas ķīmija 5' gals H20 + + Saites veidošanās 3' gals OH O P
CH2 Base CH2 Base O O OH O P OH O P CH2 Base CH2 Base O O H20 + OH P O OH OH O P 3' OH O P OH OH O P + Saites veidošanās CH2 OH O P O Base 5' CH2 Base O OH 3' 3' gals OH

7 Kas ir nepieciešams replikācijai ?
1) dsDNS 2) Oriģins – DNS rajons, kuru atpazīst replikācijas mašinērija 3) Replicējošie enzīmi 4) Nukleotīdi

8 Polimerāžu enzimātiskās aktivitātes
5’-3’ polimerāzes aktivitāte 5’-AAGTCACC-3’ ’-AAGTCACCG-3’ 3’-TTCAGTGGCAA-5’ 3’-TTCAGTGGCAA-5’ NEKAD nav 3’-5’ polimerāzes aktivitāte! +G 5’-3’ polimerāzes aktivitāte piemīt visām DNS un RNS polimerāzēm

9 Polimerāžu enzimātiskās aktivitātes
3’-5’ eksonukleāzes (editēšanas) aktivitāte 5’-AAGTCAC -3’ ’-AAGTCAC-3’ 3’-TTCAGTGGCAA-5’ 3’-TTCAGTGGCAA-5’ A -A Normālos apstākļos, tiek aizvākts viens nepareizi pievienots nukleotīds (t.i., izlabota kļūda) 3’-5’ eksonukleāzes aktivitāte piemīt lielākajai daļai (bet ne visām) DNS un RNS polimerāžu Dažām polimerāzēm piemīt arī 5’-3’ eksonukleāzes aktivitāte (piemēram, DNS polimerāzei I)

10 Polimerāzes un praimeri
DNS polimerāzes spēj tikai pagarināt esošu DNS vai RNS fragmentu (praimeri), bet nespēj uzsākt fragmenta sintēzi RNS polimerāzēm ir nepieciešams tikai komplimentārais pavediens Tādēļ, replikācijas procesu uzsāk RNS polimerāze (t.i., uzsintezē praimeri), bet turpina DNS polimerāze

11 Praimeris Komplimentārais pavediens (matrica)

12 DNS replikācija (E.coli)
Pol III sintezē vadošo pavedienu 4 2 1 Helikāze atvij spirāli 3 Primāze sintezē RNS praimeri Topoizomerāze sašķeļ vienu DNS pavedienu, lai noņemtu mehānisko spriegumu Pol I aizvieto RNS praimeri ar DNS 5 6 7 SSB proteīni aizkavē dubultspirāles veidošanos Pol III pagarina praimeri, producē Okazaki fragmentu DNS ligāze savieno Okazaki fragmentus

13 DNS Replikācija (Eikarioti)
RPA proteīni aizkavē dubultspirāles veidošanos Pol d sintezē vadošo pavedienu 5 2 1 Helikāze atvij spirāli Primāze sintezē RNS praimeri 3 4 Topizomerāze sašķeļ vienu DNS pavedienu, lai noņemtu mehānisko spriegumu RNāze H izšķeļ RNS praimeri Pol a nedaudz pagarina RNS praimeri 5 6 7 Pol d aizvieto Pol a; producē Okazaki fragmentu DNS ligāze savieno Okazaki fragmentus

14 Atšķirības eikariotu un prokariotu replikācijas dakšā
Eikariotos RNS praimeri vispirms pagarina Pol α un tad Pol δ. Prokariotos praimeri pagarina tikai PolIII Eikariotos RNS praimeri izšķeļ RNāze, kamēr prokariotos – DNS PolI, kura vienlaicīgi arī aizpilda spraugu ar DNS Prokariotos Okazaki fragmenti ir aptuveni 2000 bp gari, bet eikariotos – aptuveni 200bp gari (nevis otrādi...)

15 Citas atšķirības eikariotu un prokariotu replikācijā
Cēloņi: 1. Eikariotiskās hromosomas ir daudz garākas par prokariotiskajām 2. Eikariotiskās hromosomas ir lineāras, nevis cirkulāras 3. Eikariotiskās hromosomas ir sapakotas un uztītas uz histoniem

16 Hromosomu multiplie oriģini
Baktērijas Eikarioti

17 DNS sintēzes ātrumi un nepieciešamība pēc vairākiem oriģiniem
Genoms Repl. ātrums Repl. laiks Oriģini Komentāri E. coli 4.6 Mbp 30 kb/min 40 min 1 1 l kultūrā = šūnu --> km sintezētas DNS Raugs 14 Mbp (1 cm) 3 kb/min 20 min 330 Repl. ilgtu 80st ja būtu 1 ori Dzīves laikā (1016 šūnu dalīšanās) sintezēti 2x1013 km DNA (2 gaismas gadi) Cilvēks 3 Gbp (2 m) 3 kb/min 7 h > ? Repl. ilgtu 1 gadu, ja būtu 1 ori

18 Lineāras DNS replicēšanai vajag īpašus līdzekļus:
Telomēras un telomerāze Telomēras: īsu sekvenču atkārtojumi hromosomu galos Telomerāze: polimerāze, kas veido telomēras Kam noder telomēras un telomerāze?

19 Telomerāze darbībā Telomerāze satur savu RNS fragmentu, kas darbojas kā matrica DNS galu sintēzei RNS fragments satur divus tiešos atkārtojumus (parādīts aaaacccc 2x atkārtojums dažos vienšūņos, mugurkaulniekiem tas ir cccctaa) Pēc viena nukleotīdu pievienošanas cikla, telomerāze translocējas līdz nākošajam ttttgggg atkārtojumam Realitātē process ir ievērojami komplicētāks...

20 Vai telomerāze vienmer ir aktīva?
Aktīva bērniem un pieaugušo dzimumšūnās un cilmes šūnās Neaktīva lielā daļā somatisko šūnu pieaugušajiem Tātad hromosomas patiešām ar laiku paliek īsākas – viens no iemesliem, kāpēc mēs novecojam Tā paša iemesla dēļ kultivētas primārās zīdītāju šūnas dalās ierobežotu reižu skaitu Telomerāzes aktivācija pieaugušās pelēs paildzina to mūžu Telomerāze ir aktīva lielākajā daļā audzēju

21 Transkripcija

22 Kas ir nepieciešams transkripcijai?
dsDNS matrica promoters = transkripcijas uzsākšanas vieta ribonukleotīdi RNS polimerāze un transkripcijas faktori

23 Eksoni, introni un sekvences gēnu galos
Introni –nekodējošās sekvences eikariotu gēnu vidus daļā Eksoni – gēnu kodējošās sekvences Introni bieži tiek uzlūkoti kā “nederīga” DNS, bet tie var saturēt regulatoras sekvences vai funkcionālas nekodējošās RNS Parasti introni ir daudz garāki par eksoniem Gēnu 5’un 3’ gali satur t.s. netranslētos reģionus (UTR), kuri satur regulējošas sekvences Eksoni 5’ UTR (Untranslated region) 3’UTR Introni

24 Eikariotiskie promoteri TATA bokss
Vislabāk izpētītā promoteru sekvence Atrodas daudzu, bet ne visu gēnu 5’ UTR sastāvā nukleotīdus pirms transkripcijas sākuma vietas Piesaista t.s. TATA boksa piesaistīšanās proteīnu TBP, kas ir transkripcijas faktora TFIID sastāvdaļa

25 Citi eikariotisko promoteru elementi
-100 līdz -1 -37 līdz -32 -31 līdz -26 -2 līdz +4 +28 līdz +32 CpG BRE TATA Inr DPE GGG CCA A T T A G A C A G AC TT CGCG TATA AA PyPyAN PyPy G CpG salas – CG bagātas sekvences, piedalās transkripcijas regulācijā, C nukleotīds var būt metilēts BRE (TFII B recognition element) – tieši piesaista transkripcijas faktoru IIB Iniciatora elements (Inr) darbojas līdzīgi TATA boksam un arī piesaista TBP DPE elements (Downstream promoter element) piesaista citas TFIID subvienības- TAF9 un TAF5 Eikariotisko promoteru sastāvā var būt viens vai vairāki no minētajiem elementiem

26 Enhānseri Transkripciju regulējošie elementi tālu (līdz 50,000 bp) no transkripcijas sākuma vietas Var atrasties pirms gēna, pēc gēna vai intronā Kalpo kā regulatoro proteīnu piesaistes vieta

27 Transkripcijas iniciācija eikariotos - pārskats
Enhancer

28 Vispārējie transkripcijas faktori (GTFi, General transcription factors)
Nepieciešami RNS polimerāzes piesaistei un transkripcijas uzsākšanai no lielākās daļas promoteru Prokariotos ir tikai viens GTF – sigma faktors Eikariotos ir vismaz 6 GTFi – TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF un TFIIH

29 GTFu funkcijas A (A) TFIID (kura sastāvdaļa ir TBP) atpazīst TATA boksu (B) TFIIA un B stabilizē kompleksu, rada vietu RNS polimerāzes piesaistei (C) TFIIF piesaista brīvu RNS polimerāzi un kopā ar TFIIE un H piesaistās esošajam kompleksam TFIIE un TFIIH ir iesaistīti dsDNS pavedienu atdalīšanā (D) Pēc visu faktoru un RNS polimerāzes piesasitīšanās sākas transkripcija Pēc transkripcijas uzsākšanas, GTFi no kompleksa disociē B C D

30 Transkripcijas trīs fāzes
Start Stop Iniciācija Iniciācijā pie promotera piesaistas GTFi un RNS polimerāze un izveidojas transkripcijas burbulis Elongācijā notiek RNS ķēdes pagarināšana Terminācijā polimerāze sasniedz transkripcijas «stop» sekvenci (terminatoru) un RNS ir gatava movie Transkripcijas burbulis Elongācija DNS-RNS hibrīds Augošā RNS Terminācija

31 Pēc transkripcijas... Prokariotos RNS ir gatava translācijai uzreiz pēc transkripcijas vai pat vienlaicīgi ar to Eikariotos vispirms ir jāveic RNS procesēšana un transports uz citoplazmu

32 pre-mRNS procesēšana 1) Kepings 2) Poliadenilēšana 3) Splasings (1)
(2) (3)

33 Keps (angl. cap) Īpaša struktūra mRNS 5’- galā
7-metil guanilāts Īpaša struktūra mRNS 5’- galā Nepieciešams translācijai eikariotos Pievieno kepinga enzīms un metiltransfreāzes Norisinās vienlaicīgi ar transkripciju Apzīmējums: m7Gppp 5’- 5’ saite ar 3 fosfātu grupām Pirmo 2 nukleotīdu metilēšana

34 Poliadenilēšana Gēnu 3’ galos ir t.s. poly-A signālsekvence: AAUAAA(N)50(G/U)bagāts rajons Sasniedzot poly-A signālu : 1. Transkripcija tiek terminēta 2. RNS tiek sašķelta nukleotīdus pēc AAUAAA sekvences 3. Poly-A polimerāze pie RNS pievieno aptuveni 200 adenilātus Poliadenilēšana ir nepieciešama: 1) transkripcijas terminācijai 2) mRNS transportam uz citoplazmu 3) translācijai 4) mRNS aizsardzībai pret eksonukleāzēm

35 Splaisings: intronu izšķelšana Konsensus sekvence splaisa saita tuvumā
YYYY

36 Splaisinga molekulārais mehānisms
Splaisings notiek ar divu transesterifikācijas reakciju palīdzību Rezultātā izšķeļas «P» veida lariāta introns Reakciju katalizē splaisosoma – liels proteīnu un RNS komplekss

37 mRNS nukleārais transports
Process, kurā mRNS tiek transportēta uz citoplazmu m7Gppp mRNS A AA mRNS eksporteris Nukleoplazma Kodola membrāna Nukleārā pora Citoplazma

38 Translācija

39 Ģenētiskais kods

40 Translācijas fāze Gēna sekvence: AGGTCATGTCTAGGTATGCCC 1. fāze:
Arg Ser Cys Leu Gly Met Pro 2. fāze: A GGT CAT GTC TAG GTA TGC CC Gly His Val Val Cys Pro 3. fāze: AG GTC ATG TCT AGG TAT GCC C Val Met Ser Arg Tyr Ala Vēl 3 fāzes ir uz otrā dsDNA pavediena

41 Trīs galvenie RNS veidi
mRNS – translācijas matrica rRNS – ribosomu sastāvdaļa tRNS – nolasa mRNS kodu

42 tRNS tRNS satur atbilstošās aminoskābes antikodonu – t.i. kodonam komplimentāru sekvenci

43 Aminoacil-tRNS sintēze
Augstas enerģijas estera saite Aminoskābe (Phe) Phe un tRNSPhe savienošana Phe aminoacil-tRNS sintetāze Phe tRNS (tRNSPhe) Aminoacil-tRNS

44 Ģenētiskā koda nolasīšanas mehānisms
tRNSPhe saistās ar Phe kodonu UUU Kopējais rezultāts: Phe atpazīst savu kodonu Aminoacil-tRNS mRNS

45 Ribosoma Proteīnu biosintēzes mašinērija 65% RNS, 35% proteīns
4 dažādas RNS, 83 proteīni (eikariotiem) Katalītisko aktivitāti veic RNS daļa

46 Translācijas faktori Proteīni, kuri nav ribosomu sastāvā, bet kuri ir nepieciešami dažādos translācijas etapos – iniciācijā, elongācijā un terminācijā Iniciācijas faktori (eIF1, eIF2...) Elongācijas faktori (eEF1, eEF2) Atbrīvošanas (angl. «release») faktori (eRF1, eRF3), nepieciešami translācijas terminācijai

47 Eikariotiskās ribosomas subvienības
eIF6 un eIF3 neļauj 60S un 40S subvienībām priekšlaicīgi apvienoties

48 Iniciācija Pirmās aminoacil tRNS piesaistīšana
Preiniciācijas komplekss

49 Preiniciācijas komplekss
mRNS piesasitīšana Iniciācijas komplekss

50 Iniciācijas komplekss
mRNS skanēšana un starta kodona atpazīsana

51 Lielās subvienības piesaistīšana

52 Elongācija Ribosomā ir 3 centri (E, P, A), kuros var atrasties tRNS:
A – Aminoacil-tRNS piesasitīšanās P – Peptīda E- tRNS izejas (Eject) Nākošās aminoskābes piesaistīšana A centrā

53 Peptīda saites izveidošana

54 Ribosomas translokācija

55 Terminācija Terminācijas kodonu neatpazīst tRNS, bet atbrīvošanas faktoru eRF1-eRF3 komplekss Rezultātā tiek atšķelta pēdējā tRNS P saitā un atbrīvota ribosoma un proteīns Movie

56 Ribosomas atkārtota izmantošana