Οροδιαγνωστική των λοιμώξεων ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΚΟΥΜΑΚΗ-ΚΩΣΤΑΚΗ MD PhD ΛEκτοραΣ Μικροβιολογιας ΕΚΠΑ

Η διάγνωση μιας λοίμωξης επιτυγχάνεται με: Απομόνωση του παθογόνου μικροβίου από τον οργανισμό του ασθενούς Απομόνωση σε κλινικό υλικό από τον οργανισμό του ασθενούς ειδικών μεταβολικών προϊόντων του μικροβίου που παράγονται, μόνο εφόσον ο μικροοργανισμός είναι παρών στον οργανισμό του ασθενούς και πολλαπλασιάζεται Ανίχνευση στον ορό του αίματος του ασθενούς προϊόντων ανταπόκρισης έναντι του παθογόνου μικροβίου (έμμεση ή ορολογική διάγνωση)

1. Απομόνωση του παθογόνου μικροβίου από τον οργανισμό του ασθενούς Άμεση ανίχνευση των μικροβιακών κυττάρων σε κλινικό υλικό Καλλιέργεια του μικροβιακού παράγοντα σε τεχνητά θρεπτικά υλικά ή πειραματόζωα Ανίχνευση αντιγόνων ή γενετικού υλικού του μικροβίου

2. Απομόνωση σε κλινικό υλικό από τον οργανισμό του ασθενούς ειδικών μεταβολικών προϊόντων του μικροβίου που παράγονται, μόνο εφόσον ο μικροοργανισμός είναι παρών στον οργανισμό του ασθενούς και πολλαπλασιάζεται Π.χ. Τοξίνη Α – Clostridium difficile

3. Ανίχνευση στον ορό του αίματος του ασθενούς προϊόντων ανταπόκρισης έναντι του παθογόνου μικροβίου (έμμεση ή ορολογική διάγνωση) Για πρακτικούς λόγους ενδιαφέρουν κυρίως τα προϊόντα της χυμικής ανοσίας δηλ. τα αντισώματα Σε ξενιστή με φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα σχεδόν κάθε λοίμωξη οδηγεί σε παραγωγή ΕΙΔΙΚΩΝ αντισωμάτων έναντι συγκεκριμένων αντιγόνων του μικροβίου αιτίου Κυρίως ενδιαφέρουν και προσδιορίζονται τα ΕΙΔΙΚΑ αντισώματα IgM και IgG

Ορολογικές και ανοσοδιαγνωστικές μέθοδοι Στόχος όλων των μεθόδων είναι να καταστήσουν το ΑΟΡΑΤΟ (αντιγόνο, αντίσωμα, ανοσοσύμπλεγμα, λειτουργικότητα ανοσοαρμόδιου κυττάρου ή χημικής ουσίας) ΟΡΑΤΟ Με τον τρόπο αυτό μπορούν να μελετηθούν: Η ανοσολογική ανταπόκριση του μεγαλοοργανισμού σε μια οξεία ή χρόνια μικροβιακή λοίμωξη Η παρουσία μικροβιακών αντιγόνων ή/και προϊόντων της ανοσολογικής ανταπόκρισης στους ιστούς του μεγαλοοργανισμού Με την εφαρμογή των μεθόδων αυτών επιτυγχάνεται ΕΜΜΕΣΗ εργαστηριακή διάγνωση των λοιμώξεων (το μικροβιακό αίτιο δεν απεικονίζεται άμεσα είτε ως κύτταρο είτε ως μικροβιακή αποικία)

Ορολόγικες δοκιμασίες Όταν το δείγμα που χρησιμοποιούμε είναι ορός του ασθενούς Ανοσοδιαγνωστικές δοκιμασίες Όταν το δείγμα που χρησιμοποιούμε είναι οποιοδήποτε άλλο βιολογικό υλικό

Αντιγόνα- Αντισώματα/Ανοσοσφαιρίνες Τα αντιγόνα είναι είτε πρωτεΐνες είτε μεγάλοι πολυσακχαρίτες, που μπορούν να προκαλέσουν ανοσολογική απάντηση Συνήθως είναι συστατικά των μικροβίων εισβολέων όπως έλυτρα, κυτταρικό τοίχωμα, μαστίγια, ινίδια, τοξίνες μικροβίων, φάκελοι ιών Οι ανοσοσφαιρίνες ή αντισώματα είναι γλυκοπρωτεϊνες με παρόμοια δομή, ενεργά και ειδικά έναντι των αντιγόνου που επάγει το σχηματισμό τους.

Ανοσοσφαιρίνες Ανοσοσύμπλεγμα αντιγόνο και αντίσωμα Οι ανοσοσφαιρίνες παράγονται από τα Β λεμφοκύτταρα είτε ως μεμβρανικές πρωτεΐνες που λειτουργούν ως υποδοχείς του λεμφοκυττάρου για τα αντιγόνα στη φάση αναγνώρισης της χυμικής ανοσίας είτε εκκρίνονται ως διαλυτές πρωτεΐνες του πλάσματος ή ορισμένων εκκρίσεων από τα πλασματοκύτταρα Ανοσοσύμπλεγμα αντιγόνο και αντίσωμα

IgM αντισώματα Βρίσκονται σε πενταμερή μορφή Εμφανίζουν χαμηλή συγγένεια προς το αντιγόνο Είναι η τάξη που ανιχνεύεται πρώτη σε μια λοίμωξη (η ορολογική διάγνωση μιας πρόσφατης λοίμωξης βασίζεται στον προσδιορισμό ειδικών IgM αντισωμάτων) Δεν διέρχονται τον πλακούντα (η ορολογική διάγνωση μιας συγγενούς λοίμωξης βασίζεται στον προσδιορισμό ειδικών IgM αντισωμάτων στον ορό του νεογνού) Είναι δραστικά έναντι πολυσακχαριδικών (θυμοανεξάρτητων) αντιγόνων Δεν ανιχνεύονται σε περίπτωση εμβολιασμού

Ορολογική διάγνωση συμβάλλει Στη διάγνωση μιας πρόσφατης λοίμωξης Στη διάγνωση λοιμώξεων στις οποίες η απομόνωση του αιτιολογικού παράγοντα είναι δύσκολη ή πρακτικά αδύνατη (ιοί, παράσιτα) Στην παρακολούθηση της ανοσολογικής απόκρισης σε περίπτωση εμβολιασμού Στην παρακολούθηση του θεραπευτικού αποτελέσματος

Τίτλος ειδικών αντισωμάτων (Abs) Στην εργαστηριακή πράξη χρησιμοποιούνται υποδιπλάσιες αραιώσεις του ορού σε φυσιολογικό ορό , δηλ 1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 κ.ο.κ. Ο τίτλος των Abs είναι συνάρτηση της ευαισθησίας της μεθόδου Ο τίτλος των Abs μεταβάλλεται συναρτήσει του χρόνου της λοίμωξης και της εφαρμογής αντιμικροβιακής θεραπείας

Αναζήτηση αντιγόνων μικροβίων με σύγχρονες μεθόδους Αναζήτηση αντιγόνων μικροβίων με σύγχρονες μεθόδους Ιζηματινοαντιδράσεις Συγκολλητινοαντιδράσεις - Δοκιμασίες άμεσης συγκολλήσεις -Δοκιμασίες έμμεσης (παθητικής) συγκόλλησης -Αιμοσυγκόλληση Αντιδράσεις εξουδετέρωσης Αντιδράσεις σύνδεσης του συμπληρώματος Ανοσοφθορισμός Ανοσοενζυμικές μέθοδοι - Άμεση ELISA - Εμμεση ELISA

Ιζηματινοαντιδράσεις Αντιδράσεις αντιγόνων σε διάλυση, με IgG ή ΙIgM αντισώματα, με αποτέλεσμα το σχηματισμό μεγάλων, μοριακών συσσωματωμάτων, υπό μορφή τρισδιάστατου δικτύου Σε υγρό , σχηματισμός ορατής γραμμής δακτυλίου στην περιοχή άριστης αναλογίας Ag-Ab Αντιδράσεις ανοσοδιάχυσης σε άγαρ, σε τρυβλίο Petri, σε αντικειμενοφόρο πλάκα ανοσοηλεκτροφόρηση

Ιζηματινοαντιδράσεις Το pH της αντίδρασης (8.2>pH>6.5) και η θερμοκρασία (αρίστη 0ºC- 4ºC) επηρεάζουν το σχηματισμό του ιζήματος Ο σχηματισμός και η σύσταση του ιζήματος εξαρτώνται από τη συγκέντρωση τόσο του αντιγόνου όσο και του αντισώματος («ζώνη ισορροπίας» - συγκεκριμένη αναλογία Ag/Ab) Τα ομόλογα αντισώματα καλούνται και ιζηματίνες Στην εργαστηριακή ρουτίνα οι μέθοδοι χρησιμοποιούνται και για τον ποσοτικό έλεγχο πρωτεϊνών του ανοσολογικού συστήματος

Οι κλασσικές ιζηματινοαντιδράσεις γίνονται σε πλακίδια αγαρόζης Οι κλασσικές ιζηματινοαντιδράσεις γίνονται σε πλακίδια αγαρόζης. Το ίζημα είναι μακροσκοπικά ορατό σαν μια διαφανής «γραμμή» στο ενδιάμεσο των δυο οπών

Ιζηματινοαντιδράσεις Κροκυδωτικές αντιδράσεις Ανοσοδιάχυση (ID) Ανοσοηλεκτροφόρηση, Ανάστροφη ανοσοηλεκτροφόρηση (CIE) και παραλλαγές

1. Κροκυδωτικές αντιδράσεις Αρχή : παραλλαγή της ιζηματινοαντίδρασης. Το ίζημα έχει τη μορφή συσσωμάτων και διακρίνεται μικροσκοπικά ή μακροσκοπικά Μη ειδικές μη τρεπονηματικές κροκυδωτικές αντιδράσεις (διάγνωση σύφιλης) VDRL RPR Κροκυδωτικές αντιδράσεις για τη διάγνωση της τριχινέλλωσης

2. Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση (ID) για τη διάγνωση αντιμυκητιασικών αντισωμάτων Μυκητιασικές λοιμώξεις : Abs έναντι Coccidiodes, Histoplasma, Blastomyces

3. Ανάστροφη ανοσοηλεκτροφόρηση (CIE) Αρχή : είναι συνδυασμός ηλεκτροφόρησης και διπλής διάχυσης προς μια κατεύθυνση. Στην οπή της καθόδου (-) τοποθετείται το αντιγόνο και στην οπή της ανόδου (+) το αντίσωμα. Κάτω από την επίδραση του ηλεκτρικού ρεύματος το αντιγόνο κινείται και διαχέεται προς την άνοδο και το αντίσωμα αντίθετα. Στο σημείο συνάντησης σχηματίζεται γραμμή καθίζησης. Διάγνωση εξωεντερικών εντοπίσεων της αμοιβάδωσης Διάγνωση βακτηριακής ή ιογενούς μηνιγγίτιδας

Συγκολλητινοαντιδράσεις Είναι η αντίδραση ενός σωματιδιακού αντιγόνου με το ομόλογό του αντίσωμα και ο σχηματισμός κροκίδων που γίνονται ορατές με το μικροσκόπιο, με τη βοήθεια μεγεθυντικού φακού ή με γυμνό μάτι Φαινόμενο προζώνης: η συγκόλληση παρατηρείται μόνο σε μεγάλες αραιώσεις του ορού Οφείλεται σε πολύ μεγάλο αριθμό αντισωμάτων ή σε «ατελή» αντισώματα (IgG, IgA) Παρατηρείται σε χρόνια βρουκέλλωση

Συγκολλητινοαντιδράσεις Το αντιγόνο βρίσκεται υπό μορφή σωματιδίων (είτε αντιγόνα στην επιφάνεια των κυττάρων είτε διαλυτά αντιγόνα προσροφημένα στην επιφάνεια σωματιδίων)

Συγκολλητινοαντιδράσεις Άμεση συγκολλητινοαντίδραση Έμμεση ή παθητική αιμοσυγκόλληση Αναστολή της αιμοσυγκόλλησης

1. Άμεση βακτηριακή συγκολλητινοαντίδραση Αρχή : σε πυκνό διάλυμα τα αντισώματα συνδέονται με επιφανειακά μικροβιακά αντιγόνα και συγκολλούν τα μικρόβια σε μακροσκοπικά ορατούς σωρούς Συγκολλητινοαντίδραση Wright → βρουκέλλωση (μελιταίος πυρετός) Συγκολλητινοαντίδραση Weil-Felix → ρικετσιώσεις Συγκολλητινοαντίδραση Widal → τυφοειδής πυρετός (Σαλμονέλλες) Συγκολλητινοαντιδράσεις για → τουλαραιμία, λεπτοσπείρωση, γερσινίωση, τέτανο

Δοκιμασίες άμεσης συγκόλλησης Οποιαδήποτε δοκιμασία, η οποία χρησδιμοποιεί ολόκληρους οργανισμούς ή κύτταρα για την ανίχνευση αντισωμάτων στον ορό Ανιχνεύουν αντισώματα έναντι σχετικά μεγάλων κυτταρικών αντιγόνων, όπως εκείνα που υπάρχουν στα ερυθρά αιμοσφαίρια, στα βακτήρια και στους μύκητες Η τελευταία αραίωση του ορού όπου παρατηρείται αντίδραση αντιγόνου- αντισώματος αποτελεί τον τίτλο του αντισώματος στον ορό

2. Συγκολλητινοαντίδραση Latex Έμμεση (παθητική) συγκόλληση Αρχή : σε πυκνό διάλυμα τα αντισώματα συνδέονται με μικροβιακά αντιγόνα που έχουν συνδεθεί τεχνητά στην επιφάνεια σωματιδίων και συγκολλούν τα σωματίδια σε μακροσκοπικά ορατούς σωρούς Είναι οι ευρύτερα χρησιμοποιούμενες συγκολλητινοαντιδράσεις

3. Έμμεση ή παθητική αιμοσυγκόλληση Αρχή : σε πυκνό διάλυμα τα αντισώματα συνδέονται με μικροβιακά αντιγόνα που έχουν συνδεθεί τεχνητά στην επιφάνεια ερυθρών αιμοσφαιρίων και συγκολλούν τα ερυθρά σε μακροσκοπικά ορατούς σωρούς Διάγνωση της σύφιλης Διάγνωση της ερυθράς

Δοκιμασίες έμμεσης συγκόλλησης Ανίχνευση έναντι διαλυτών αντιγόνων ανιχνεύονται με δοκιμασίες συγκόλλησης, τα αντιγόνα είναι προσροφημένα πάνω σε σωματίδια ή συχνότερα latex

4. Αναστολή της αιμοσυγκόλλησης Αρχή : ορός ασθενούς που περιέχει αντισώματα έναντι συγκεκριμένου ιού αφήνεται να αντιδράσει με σωματίδια του ιού. Η πραγματοποιούμενη σύνδεση αντιγόνου- αντισώματος παρεμποδίζει τη συγκόλληση ερυθρών αιμοσφαιρίων – που προστίθενται σε δεύτερο χρόνο στο διάλυμα - από τα σωματίδια του ιού Οι διάφοροι ιοί συγκολλούν ερυθρά διαφορετικών ειδών: Ο ιός της ερυθράς συγκολλά ανθρώπινα ερυθρά ομάδας Ο, ερυθρά χήνας και ερυθρά κότας Οι αδενοϊοί συγκολλούν ερυθρά πιθήκου rhesus

Αιμοσυγκόλληση Συγκολλητινοαντιδράσεις , στις οποίες πραγματοποιείται συγκόλληση ερυθρών αιμοσφαιρίων π.χ. ιική αιμοσυγκόλληση

Αντιδράσεις εξουδετέρωσης Εξουδετέρωση είναι η αντίδραση αντιγόνου- αντισώματος, κατά την οποία οι βλαβερές επιπτώσεις μιας βακτηριακής εξωτοξίνης ή ενός ιού εξουδετερώνονται από ειδικά αντισώματα

Αντιδράσεις εξουδετέρωσης Αντιτοξίνη είναι η εξουδετερωτική ουσία, η οποία αποτελεί ειδικό αντίσωμα ,που παράγεται από ένα ξενιστή, ως απάντηση στη βακτηριακή εξωτοξίνη ή την αντίστοιχη ανατοξίνη (αδρανοποιημένη τοξίνη). Η αντιτοξίνη συνδέεται με την εξωτοξίνη και την εξουδετερώνει.

Το σύστημα του συμπληρώματος Αμυντικό σύστημα αποτελούμενο από περισσότερες από 30 πρωτεΐνες, οι οποιες παράγονται στο ήπαρ και κυκλοφορούν στον ορό του αίματος. Οι πρωτείνες του συμπληρώματος έχουν κλασσικό τρόπο ενεργοποιήσης τη σύνδεση αντιγόνου –αντισώματος. Ακολούθως, ενεργοποιούνται αλληλοδιαδόχως (σαν καταρράκτης), δηλαδή η μια ενεργοποιεί την άλλη με τελικό στόχο την λύση του κυττάρου

Αντιδράσεις σύνδεσης συμπληρώματος Το συμπλήρωμα, στις περισσότερες αντιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος, συνδέεται με το σύμπλεγμα αντιγόνου- αντισώματος και καταναλώνεται Χρησιμοποιείται για ανίχνευση αντισωμάτων που δεν προκαλούν ορατές αντιδράσεις, όπως καθίζηση (ίζημα) ή συγκόλληση Α)Σύνδεση συμπληρώματος και Β)διαπίστωση της σύνδεσης με αιμολυτικό σύστημα

Ανοσοφθορισμός Χρησιμοποιείται για την ανίχνευση μικροοργανισμών σε κλινικά δείγματα (άμεσος) και ειδικών αντισωμάτων στον ορό (έμμεσος). Γίνεται σύζευξη φθοριζουσών χρωστικών με αντισώματα, τα οποία φθορίζουν, όταν εκτεθούν στο υπεριώδες φως

Ανοσοφθορισμός Εφαρμογή : κυτταρομετρητής ροής που χρησιμοποιεί ανοσοφθορισμό

Ανοσοενζυμικές μέθοδοι -ELISA Αυτομα τοποιημένες μέθοδοι που πραγματοποίούνται σε πλάκες μικροτιτλοποίησης και τα αποτελέσματα διαβάζονται από σαρωτές Α)Αρχική σύνδεση αντιγόνου αντισώματος Β)Προκειμένου να γίνει ορατή η θετική δοκιμασία, προστίθεται στο βύθισμα αντιανθρώπειος ανοσοσφαιρίνη, (συνδέεται με οποιαδήποτε ανθρώπινο αντίσωμα) σημασμένη με ένζυμο. Γ) Προστίθεται το υπόστρωμα του ενζύμου Δ) Η θετική δοκιμασία ανιχνεύεται με μεταβολή χρώματος

Άμεση ELISA Ανίχνευση αντιγόνου π.χ. φαρμάκου σε κλινικό δείγμα

Έμμεση ELISA Ανιχνεύει αντισώματα στον ορό των ασθενών

Western Blot