Polyklonové a monoklonové protilátky Polyklonové (konvenčné) a monoklonové protilátky. Lymfocytové hybridómy. Príprava monoklonových protilátok. Vlastnosti a význam monoklonových protilátok. Imunotoxíny. Možnosti génového inžinierstva protilátok. Chimérové, humanizované, heterobišpecifické, jednoreťazcové a katalytické protilátky. Izolácia a príprava čistých Ig. Terapeutické preparáty Ig. Základy imunologickej tolerancie a vznik tolerancie na vlastné antigény

Polyklonové protilátky HETEROGÉNNA POPULÁCIA BUNIEK produkty niekoľkých klonov B-lymfocytov zmes niekoľkých typov molekúl s rôznou afinitou a špecifickosťou väzobného miesta Vznik IMUNIZÁCIA jedinca imunogénom (náhodná, cielená, experimentálna)

Monoklonové protilátky HOMOGÉNNA POPULÁCIA BUNIEK produkty 1 klonu plazmatických buniek odvodených od B-lymfocytov identické kópie Ig s rovnakou primárnou štruktúrou a špecifickosťou VM a rovnakými výkonnými funkciami Vznik SPONTÁNNE pri nádorovom raste plazmatických buniek (gamapatiach) VIACNÁSOBNÝ MYELÓM – IgG, IgA, IgD, IgE BENCE-JONESOVE PROTEÍNY – diméry L-reťazcov (λ alebo κ) WALDENSTRÖMOVA MAKROGLOBULINÉMIA – IgM CHOROBA ŤAŽKÝCH REŤAZCOV- nekompletné reťazce γ, α, μ UMELO pomocou lymfocytových hybridómov v lab. podmienkach HYBRIDÓMOVÁ TECHNOLÓGIA - Köhler a Milstein 1975 (Nobelova cena 1984) FÚZIA: B-LYMFOCYT + MYELÓMOVÁ BUNKA = HYBRIDNÁ BUNKA = HYBRID-MYELÓM = HYBRIDÓM

Pricíp vzniku protilátok

Hybridómová technológia

Hybridómová technológia

Fúzia buniek FÚZIA BUNIEK ŽIADNA (nefúzované bunky) HYBRIDNÉ BUNKY (B-lymfocyt + myelómová bunka) DVE ROVNAKÉ BUNKY (lymfocyt-lymfocyt, myelómová bunka-myelómová bunka) fúzogény – látky, ktoré urýchľujú spojenie buniek inaktivovaný vírus Sendai iné vírusy polyetylénglykol (Mr = 2000 – 6000) Výsledok získanie buniek, ktoré majú trvalý rast in vitro a in vivo nesmú produkovať myelómové protilátky diferencované tak, aby produkovali protilátky aj po fúzii

Selekcia hybridných buniek METÓDA založená na ENZÝMOVÝCH DEFEKTOCH v bunkách in vitro možno navodiť enzýmové defekty (myelómové bunky) bunky s enzýmovými defektami nerastú v selekčných médiách hybridné bunky môžu neprítomnosť enzýmu v jednej bunke kompenzovať stratu jeho prítomnosťou v partnerskej bunke Defekty v syntéze nukleotidov hlavná (de novo pathway) – z aminokyselín, sacharidov blokuje ho aminopterín vedľajšia (salvage pathway) – z purínových báz a nukleozidov HGPRT (hypoxantín guanín fosforibozyltransferáza) - mutanty sa získajú kultiváciou s 8-azaguanínom TK (tymidínkináza) - mutanty sa získajú kultiváciou s 5-brómdeoxyuridínom

Selekcia hybridných buniek Hypoxantín IMP PRPP PP tymidín TMP ATP ADP

Selekcia hybridných buniek Selekčné médium HAT H – hypoxantín A – aminopterín T – tymidín prídavok inzulínu do HAT média zvýši tvorbu hybridómov nefúzované a fúzované lymfocyty – hynú po 7-10 dňoch nefúzované a fúzované myelómy – neprežijú v HAT médiu hybridné bunky – prežívajú v HAT médiu dlhodobo

Vlastnosti monoklonových protilátok CHEMICKÉ INDIVÍDUÁ MONOŠPECIFICKÉ (len proti jednému epitopu) ÚČINNÉ V NIŽŠÍCH KONCENTRÁCIÁCH PRÍPRAVA V NEOBMEDZENÝCH MNOŽSTVÁCH (aj proti neprečisteným antigénom) NEPRECIPITUJÚCE PROTILÁTKY

Využitie monoklonových protilátok ANALYTICKÉ A IZOLAČNÉ IMUNOCHEMICKÉ METÓDY izolácie enzýmov, proteohormónov, cytokínov a iných diagnosticky dôležitých látok riešenie problémov biochémie a molekulovej biológie MAPOVANIE EPITOPOV výskum štruktúry zložitých biopolymérov a subcelulárnych štruktúr MAPOVANIE POVRCHOVÝCH ZNAKOV (ANTIGÉNOV) BUNIEK kvantifikácia jednotlivých bunkových populácií a subpopulácií určenie diferenciačných štádií buniek DIAGNOSTIKA INFEKČNÝCH CHORÔB určenie patogénu (vírus, baktéria, parazit), ktorý vyvolal ochorenie

Využitie monoklonových protilátok DIAGNOSTIKA A EXPERIMENTÁLNA LIEČBA NÁDOROV lokalizácia nádorov v organizme rádioimunoscintigrafiou príprava imunotoxínov na cielenú liečbu nádorov karcinoembryový antigén (CEA), α-fetoproteín (AFP), β2-mikroglobulín, choriónový gonadotropín, feritín, kyslá prostatová fosfatáza IMUNOTOXÍNY – konjugáty s toxínmi Toxíny: ricín, abrín, difterický toxín, Shigella toxín Cytostatiká: adriamycín, daunomycín, metotrexát Rádionuklidy EXPERIMENTÁLNA LIEČBA AUTOIMUNITNÝCH CHORÔB antiidiotypové monoklonové protilátky proti autoprotilátkam choroby: myasthenia gravis, Gravesova choroba, diabetes mellitus a iné

Génové inžinierstvo protilátok

Génové inžinierstvo protilátok CHIMÉROVÉ MONOKLONOVÉ PROTILÁTKY prvá generácia humanizovaných protilátok obsahujú myšacie variabilné domény (modré) a ľudské konštantné domény (šedé) ZLOŽENÉ PROTILÁTKY druhá generácia humanizovaných protilátok chimérové monoklonové protilátky obsahujúce hypervariabilné úseky CDR myšacieho pôvodu (modré) vsunuté do ľudských FR-oblastí (šedé) HYBRIDNÉ PROTILÁTKY chimérové monoklonové protilátky, v ktorých je koncová Fc doména nahradená toxínom (biele) okrem väzby antigénu (VM) majú aj iné aktivity (katalytické, imuno-diagnostické, imunoterapeutické, imunotoxické) HETEROBIŠPECIFICKÉ PROTILÁTKY hybridné protilátky, ktoré majú dve rôzne väzbové miesta s odlišnými špecifickosťami: napr. jedno pre antigén spojený s nádormi, druhé pre TCR

Príprava heterobišpecifických protilátok fúzia dvoch hybridómov QUADRÓMOVÁ TECHNOLÓGIA fúzia hybridómu a buniek sleziny TRIÓMOVÁ TECHNOLÓGIA fúzia dvoch variabilných génov GÉNOVÉ INŽINIERSTVO

Metódy génového inžinierstva VYUŽITIE IMUNOKOMPATIBILNÉ – CHIMÉROVÉ PROTILÁTKY ZLOŽENÉ PROTILÁTKY ZMENA BIOLOGICKÉHO POLČASU PROTILÁTKY PREPNUTIE PRODUKCIE NA INÝ IZOTYP (napr. z IgM na IgG) ZVÝŠENIE AFINITY ALEBO AVIDITY ZMENA EFEKTOROVÝCH FUNKCIÍ (napr. väzba na Fc-receptory) HYBRIDNÉ PROTILÁTKY – fúzia Ig génov s inými génmi HETEROBIŠPECIFICKÉ PROTILÁTKY - fúzia dvoch rôznych V-génov

Metódy génového inžinierstva NEVÝHODY použitia monoklonových protilátok hlodavcov u ľudí KRÁTKY POLČAS EXISTENCIE v krvnom sére NENAHRÁDZAJÚ EFEKTOROVÉ FUNKCIE ľudských Ig (len niektoré triedy myšacích Ig) VYVOLANIE NEŽIADÚCEJ IMUNITNEJ ODPOVEDE u pacientov (izotypovo odlišné protilátky) VZNIK ĽUDSKÝCH ANTI-MYŠACÍCH PROTILÁTOK (HAMA – human anti-mouse antibodies) zvyšujú katabolizmus aplikovaných protilátok blokujú ich terapeutický účinok vyvolávajú alergické reakcie (anafylaxia, tvorba imunokomplexov)

Metódy génového inžinierstva HUMANIZÁCIA monoklonových protilátok hlodavcov CHIMÉROVÉ (1. generácia) ZLOŽENÉ (2. generácia) = CDR-štepové protilátky HYBRIDNÉ (3. generácia) ĽUDSKÉ MONOKLONOVÉ PROTILÁTKY IMUNIZÁCIA ĽUDSKÝCH LYMFOCYTOV in vitro SCID MYŠI s ťažkou kombinovanou imunodeficienciou (severe combined immunodeficiency) – takmer úplne chýba bunková a humorálna imunita MOŽNOSŤ KLONOVANIA VEĽKÝCH FRAGMENTOV DNA v umelých kvasinkových chromozómoch

Jednoreťazcové protilátky vznikajú kovalentnou väzbou fragmentu Fv (VL a VH) s rozličnými efektorovými molekulami (enzýmy, hormóny, liečivá)

Katalytické protilátky katalytické protilátky majú Fc domény alebo ich časť nahradenú kovalenne nadviazaným enzýmom abzýmy majú katalytické miesto zhodné s väzbovým miestom a špecificky viažu nízkomolekulovú látku (haptén) účinné katalyzátory reakcií organických látok (hydrolýza esterov, amidov a karbonátov, stereošpecifické Claisenove reakcie, transacylačné reakcie)

Metódy izolácie protilátok NEŠPECIFICKÉ FRAKCIONOVANÁ PRECIPITÁCIA neutrálne soli (síran amónny – IgG 33%, síran sodný – IgG 18%) organické rozpúšťadlá (etanol – Cohnova frakcionácia, acetón) ióny kovov (Zn2+) organické katióny (rivanol, kyselina kaprylová) polyméry (PEG 6000 – IgM 7%, IgG a IgA 14%)

Metódy izolácie protilátok ELEKTROFORÉZA rozdelenie podľa veľkosti náboja vo voľnom roztoku (kyveta) na nosiči (papier, agar, polyakrylamid) + dodecylsíran sodný (SDS) IZOELEKTRICKÁ FOKUSÁCIA rozdelenie podľa izoelektrických bodov (pH amfolytu, kedy počet katiónov = počtu aniónov) IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIA ANEX = matrica (+) + anióny (-) KATEX = matrica (-) + katióny (+) GÉLOVÁ FILTRAČNÁ CHROMATOGRAFIA pri styku s kvapalinou napučia za tvorby gélu (veľkosť pórov) HYDROFÓBNA CHROMATOGRAFIA (IgA Octyl- a Fenyl-Sepharose) CHROMATOFOKUSÁCIA

Metódy izolácie protilátok ŠPECIFICKÉ IMUNOAFINITNÁ CHROMATOGRAFIA imobilizácia ligandu na nerozpustný nosič (imunoadsorbent) ligand (Ag, Ig, proteín A) nosič (gély - agaróza, polyakrylamid, polymetakrylát, dextrán), elučný roztok (kyseliny, vysoká koncentrácia ligandu)

Terapeutické preparáty TRI GENERÁCIE PREPARÁTOV IMÚNNY SÉROVÝ GAMAGLOBULÍN – E.F. COHN (1945) 16% roztok (70-80% mIgG), intramuskulárna aplikácia NORGA (IMUNA) NORMÁLNY ĽUDSKÝ IMUNOGLOBULÍN enzýmovo degradovaný – odstránenie Fc-domén pepsínom, plazmínom chemicky modifikovaný - β-propiolaktón - hydrolýza -S-S- redukciou a alkyláciou 3-5% roztok (min. 95% mIgG), intravenózna aplikácia IVEGA (IMUNA), SANDOGLOBULÍN (NOVARTIS), GAMIMMUNE (CUTTER), VEINOGLOBULINE, GAMMA-VENIN NORMÁLNY ĽUDSKÝ IMUNOGLOBULÍN s nezmenenou štruktúrou nezapríčiňuje anafylaktoidné reakcie (uvoľnenie histamínu a iných mediátorov anafylaxie zo žírnych buniek a bazofilov)

Použitie preparátov PROFYLAXIA (ochrana pred niektorými chorobami) tetanový toxín, diftériový toxín, vírus vyvolávajúci hepatitídu B, besnota SUBSTITUČNÁ (NÁHRADNÁ) LIEČBA primárne imunodeficiencie: agamaglobulinémia viazaná na chromozóm X, bežná variabilná imunodeficiencia, selektívna deficiencia IgG, ťažká kombinovaná imunodeficiencia - SCID sekundárne imunodeficiencie: príjemcovia transplantátov, pediatrický AIDS, chronická lymfocytová leukémia, rizikoví novorodenci iné choroby: Kawasakiho choroba, hemofília, idiopatická trombocyto-péniová purpura LIEČBA niektorých infekcií

Imunologická tolerancia stav špecifickej neodpovedavosti na určitý antigén, ktorý by normálne vyvolal odpoveď reaktívnosť klonu lymfocytov je znížená, potlačená alebo je klon eliminovaný jedinec je schopný odpovedať na iné antigény prirodzená (autotolerancia) alebo sekundárna (na cudzie antigény) Dôkazy erytrocyty dvojvaječných dvojčiat dobytka sa znášajú kvôli spoločnej placente po imunizácii novonarodenej myši slezinovými lymfocytmi inej myši bola v dospelosti schopná prijať štep kože

Tolerancia T lymfocytov Centrálna tolerancia klonová delécia - priama delécia tých klonov lymfocytov, ktoré majú schopnosť rozpoznať a reagovať na vlastné autoantigény Periférna tolerancia klonová anergia - nedostatok kostimulácie po rozpoznaní antigénu na MHC ak druhý signál chýba (B80–CD28), bunka spácha „samovraždu“ apoptózou ak druhý signál je neznámy, bunka sa zmení na regulačnú/supresorovú bunku znemožnenie stretnutia sa s autoantigénom (vnútro oka, semenníky, mozog) prijatie smrtiaceho signálu cez FasL bunky vnútra oka v prípade preniknutia T-lymfocytov makrofágy infikované HIV kontrola regulačnými/supresorovými T-lymfocytmi rozdiel v cirkulácii naivných a pamäťových T-lymfocytov

Tolerancia B lymfocytov Centrálna tolerancia receptor editing - ďalšia rekombinácia ľahkých reťazcov klonová delécia - priama delécia tých klonov lymfocytov, ktoré majú schopnosť rozpoznať a reagovať na vlastné autoantigény Periférna tolerancia neprítomnosť signálu z TH lymfocytov udržiava autoreaktívne B lymfocyty pod kontrolou Tolerancia T lymfocytov je najdôležitejší mechanizmus udržiavania tolerancie B lymfocytov

Vývoj T-lymfocytov a súvis s toleranciou

Pozitívna a negatívna selekcia