Primena imunoloških tehnika u kliničkim ispitivanjima i kliničkoj praksi

Imunoglobulini i drugi serumski proteini Komplement i imunski kompleksi Autoimunska serologija Fenotipizacija ćelija i funkcionalni testovi Citokini, inflamtorni pokazatelji i tumorski markeri Imunohistologija Alergije i hipersenzitivnost

Testovi za procenu humoralnog imuniteta u kliničkoj praksi Mehanizmi molekulskih interakcija značajne za ostvarivanje funkcija humoralnog imunskog odgovora: kvantitativno određivanje koncentracija imunološka identifikacija karakterizacija Određivanje ukupnih proteina Biuretska, tanin turbidimetrijska, metoda taloženja trihlorsirćetnom kiselinom i dr Elektroforetske tehnike Metoda po Grabar-Williams-u ili mikrozonska elektroforeza po Shidigger-u, na acetatnoj celulozi ili agaroznom gelu

I) Imunoglobulini i drugi serumski proteini Abnormalnosti serumskih imunoglobulina pojavljuju se u autoimunskim infektivnim imunodeficijentnim i limfoproliferativnim poremećajima Kvalitativne, kvantitativne i funkcionalne procene serumskih imunoglobulina

Kvantifikacija imunoglobulina i drugih proteina Radijalna imunodifuzija (RID) Nefelometrija Serumske elektorforeze (jednostavna, jeftina, brza tehnika) obezbeđuje informacije o povećanju i smanjenju ukupnih serumskih imunoglobulina i prisustvu monoklonskih traka Zonska elektroforeza (semikvantitativna) Kvantifikacija IgG klasa: RID, ELISA, nefelometrija Kvantifikacija paraproteina – kvatifikacijom imunoglobulina, denzitometrijom (Bence-Jones proteini)

Karakterizacija imunoglobulina i drugih proteina Karakterizacija – imunofiksacija Funkcionalna aktivnost – merenje izoaglutinina (IgM) Karakterizacija paraproteina (patološki proteini) – imunoelektroforeza i imunofiksacija

II) Komplement i imunski kompleksi Rekurentne bakterijske infekcije Autoimunske bolesti sa prominentnim imunski kompleks interakcijama Test titracije komplementa (hemolitički test-CH50/100) C3, C4 i properdin kvantifikacija C3 nefrotski faktor C1 esteraze inhibitor C1q vezujući metod za imunske komplekse cirkulišući imunski kompleksi

III) Citokini, inflamatorni pokazatelji i tumorski markeri Citokini i solubilni citokinski receptori ELISA Bioeseji ELISA –spot Merenje mRNK Inflamtorni pokazatelji Serumska elektroforeza CRP SE Kvantifikacija serumskog β2-mikroglobulina (RID, ELISA) Tumorski markeri RIA, ELISA, imunofluorescenca (tkiva)

IV) Autoimunska serologija AUTOIMUNSKE IMUNOPATOLOŠKE BOLESTI * rezultat gubitka autotolerance * inflamacija * organ specifične * organ nespecifične (sistemske)

AUTOANTITELA * prisustvo autoantitela je uobičajeno povazano sa imunopotologijom * intezitet oštećenja je povezana sa količinom autoantitela * autoantitela su najčešće specifična za imunodominantne epitope

MOLEKULARNI CILJEVI ZA REUMATOIDNI FAKTOR V domeni -S-S- -S-S- -S-S- -S-S- -S-S- -S-S- -S-S- -S-S- -S-S- -S-S- C1 -S-S- -S-S- Vezujuća mesta za RF Agal IgG C2 Asn 297 C domeni -S-S- -S-S- C3 His 435 -S-S- -S-S- GA – specific RF

Problemi: * zdrave osobe sa prisutnim autoantitelima * Osobe sa manifestacijama imunopatoloških bolesti, kod kojih očekivana autoantitela nisu detektabilna * nizak nivo autoantitela (IgM) može da bude povezan sa infekcijom * krosreaktivnost

Autoantitela u serumu ili tkivima Određivanje autoantitela je: * kvalitativno * kvantitativno: * titar * arbitrarne jedinice * koncentracija (standard) Tehnike za određivanje autoantitela: * aglutinacija (tiroidna antitela, RF) * precipitacija (ENA-At specifična za ekstraktabilni nuklearni Ag, At specifična za ds DNK i nuklearne Ag) * RIA (anti-ds DNK antitela) * ELISA * turbidimetrija * imunobloting * imunofluorescenca (ANA, tkivna At i anti-neutrofilna citoplazmatska At-ANCA)

IMUNOFLUORESCENTNO ODREĐIVANJE AUTOANTITELA detekcija autoantitela koja reaguju sa tkivnim (intracelularnim) antigenima Upotreba : * tkivnih preseka (organ-specifična autoantitela) * ćelijske suspenzije: * Hep-2 ćelijska linija (ANF) * granulociti (ANCA)

Indirektna imunofluorescenca ANA – sistemske reumatske bolesti (SLE, polimozitis, skleroderma, Sjogren-ov sindrom), rekcije na lekove, hronične infekcije, RA i druge autoimunske bolesti ANCA-Wegener-ova granulamatoza Antitela specifična za ACH receptor (Miastenija gravis) Anti-fosfolipidna antitela – anti-fosfolipidni sindrom RF (IgM, IgA ili IgG)

ANA ANTINUKLEARNA AUTOANTITELA: * autoantitela reaguju sa jedarnim aparatom * prisutna kod pacijenata sa sistemskim bolestima vezivnog tkiva * njihov nivo je povezan sa intezitetom inflamacije mitotički aparat centromera ANA ENA: ekstraktabilni jedarni antigeni

klinička povezanost sa: SLE, RA, sistemskom sklerozom HOMOGENA NUKLEARNA antigen: DNK, histoni klinička povezanost sa: SLE, RA, sistemskom sklerozom

antigeni: heterogeni ribonukleoproteini (hnRNP) NUKLEARNI MATRIKS (velike mrlje) antigeni: heterogeni ribonukleoproteini (hnRNP) klinička povezanost sa: bolestima vezivnog tkiva, SLE

antigeni: nuklearni proteini (SS-A/Ro, SS-B/La, RNK polimeraza) FINO MRLJASTA FLUORESCENCA antigeni: nuklearni proteini (SS-A/Ro, SS-B/La, RNK polimeraza) klinička povezanost sa: SLE, Sjőgren-ov sindrom, skleroderma

antigen: kinetohore hromozoma, centromerni antigeni (CENP-A,B,C,D,E) CENTROMERNA FLUORESCENCA (40-60 tačaka) Ćelije u telofazi (metafaza): Tačke su u ekvatorijalnoj ravni antigen: kinetohore hromozoma, centromerni antigeni (CENP-A,B,C,D,E) klinička povezanost sa: CREST sindrom, progresivna sistemska skleroza

antigeni: PM-Scl kompleks od polipeptida sličnih Ku antigenu NUKLEOLARNA FLUORESCENCA antigeni: PM-Scl kompleks od polipeptida sličnih Ku antigenu klinička povezanost sa: preklapajućim sindromom

dsDNK (nativna DNK) . antigen: nativna dsDNK Substrat je protoza Crithidia luciliae, sa kinetoplastima formiranim od dsDNK. . antigen: nativna dsDNK klinička povezanost sa: značajno (95%) povazano sa SLE i povezano sa aktivnošću bolesti

ANTINUKLEARNA ANTITELA sistemski lupus eritematodes (SLE) dsDNA 90 % pacijenata ssDNA 70-95 % pacijenata Sm 20-40 % pacijenata dsDNA+ Sm patognomična za SLE SSA/Ro 20-60 % pacijenata histoni 95% pacijenata (lekovima-indukovan SLE) Mixed Conective Tissue Disease (MCTD) U-RNP 95-100 % pacijenata

Scl-70 (DNA topoizomeraza-1) 50-70% pacijanata skleroderma Scl-70 (DNA topoizomeraza-1) 50-70% pacijanata CREST sindrom centromere 80-95 % pacijanata polimiozitis, dermatomiozitis antisyntetase syndrom Jo-1 (histidil-tRNA sintetáza) 25-30 % pacijanata Sjögren-ov sindrom (SS) SSA/Ro 40-95 % pacijanata SSB/La 45-95 % pacijanata

PRECIZNO ODREĐIVANJE NUKLEARNIH FAKTORA * molekulska karakterizacija antigena * ciljevi su stvoreni biotehnologijom * ELISA testovi * imunobloting

METODE ELISA imunoblot rekombinantni ili purifikovani antigeni

ANCA ANTITELA * ANCA= antineutrofil citoplazmatski antigeni * Substrat su etanolom fiksirani humani granulociti * prisutna u naglašenim tipovima vaskulitisa

ANCA AUTOANTITELA I VASKULITISI Antigen - proteinaza-3 u primarni granulama Antigen – mijeloperoksidaza Wegener granulomatoza Cistična fibroza (90%), Hronični hepatitis (80%), SLE, RA

cANCA antigen: proteinaza 3 u primarnim granulama klinička povezanost sa: Wegener granulomatoza

pANCA antigen: mijeloperoksidaza (MPO). klinička povezanost sa: cistična fibroza (90%), hronični hepatitis (80%), SLE, RA

Organ specifična antitela Anti-mitohondrijalna antitela (AMA) – primarna bilijarna ciroza Anti-glomerularna bazalna membrana antitela (AGBM)– Goodpastre-ov sindrom Anti-parijtelna ćelijska antitela (APCA) – hronični atrofijski gastritis, perniciozna anemija Anti-tiroidna antitela (tireoglobulin i tiroidni mikrozomalni antigeni) – Hashimoto tireoiditis, Graves-ova bolest i primerni autoimunski hipotiroidizam Anti-AcH antitela – Mijastenija gravis Anti-koža bazalna membrana antitela (hemidezmozomalne komponente bazalne membrane kože) – Bulozni pemfigoid Anti-koža intracelularna supstanca antitela (dezmozomalne komponente na površini epidermalnih ćelija u skvamoznom epitelu kože) - pemphigus vulgaris Anti-citoskeletna antitela – hronični aktivni hepatitis, akutne virusne infekcije Anti-retikulin antitela - celijakija, Kron-ova bolest, dermatitis herpetiformis Anti-adrenalna antitela - idiopatska Addison-ova bolest Anti-ovarijlna antitela

AUTOANTITELA SPECIFIČNA ZA PARIJETALNE ĆELIJE (APCA) antigen: antigen H+/K+/ATP-aza klinička povezanost sa: pernicioznom anemijom (80-90%), autoimunske endokrine bolesti

antigen: citohrom monooksigenaza P-450IID6 LKM-1 antigen: citohrom monooksigenaza P-450IID6 klinička povezanost sa: marker autoimunskog hepatitisa

klinička povezanost sa: celijakija AUTOANTITELA SPECIFIČNA ZA RETIKULIN (R1) antigen: retikulin R1 klinička povezanost sa: celijakija

AUTOANTITELA SPECIFIČNA ZA ENDOMIMZIUM (EMA) antigen: tkivna transglutaminaza klinička povezanost sa: celijakija

AUTOANTITELA SPECIFIČNA ZA GLATKE MIŠIĆE (ASMA) antigen: citoskeletni antigeni klinička povezanost sa: marker autoimunskog hepatitisa i inflamatorne bolesti

V) Fenotipizacija ćelija i funkcionalni testovi Imunski sistem je kontrolisan velikim brojem ćelija i u dobro balansiranom imunskom sistemu ove ćelije međusobno efikasno interaguju U imunološkim bolestima taj odnos je poremećen Identifikacija ćelija – fenotipska analiza Određivanje njihove funkcije ili funkcionalnog potencijala – in vitro funkcionalni testovi

Imunohistohemija – mikorskopija - tkiva Ime Ćelije Specifičnost Osnovni panel CD3 Sve T ćelije TCR kompleks CD4 Pomoćnićke T ćelije Interaguje sa MHC II CD8 Citotoksične T ćelije Interaguje sa MHC I CD19 Sve B ćelije P95 asociran sa površinskim Ig CD14 Monociti LPS receptor CD45 Svi leukociti Leukocitni zajednički Ag Dodatni markeri CD15 polimorfonukleari X-hapten na različitim glikoproteinima/glikolipidima CD2 Sve T ćelije i LGL Adhezivni/signalni molekul CD20 33kD fosfoprotein CD5 Sve T, B podtipovi P67, vezuje se za CD72 CD38 Aktivirani T, difer B, plazmociti gp45 CD23 B ćelijski podtipovi IgE receptor (nisko afinitetni CD22 Zrele B ćelije 135 kD fosfoglikoportein Fenotipizaija ćelija Imunofuorescenca upotrebom monoklonskih antitela – FACS – periferna krv, ostale biološke tečnosti (izolacija mononuklearnih ćelija) Imunohistohemija – mikorskopija - tkiva Fenotipska analiza ćelija periferne krvi panelom antitela

Funkcija ćelija Proliferativni odgovor T ly – CD3 at, ConA, Mešana leukocitna reakcija (MLR) In vivo kožni testovi Ćelijska citotoksičnost - MLR Produkcija citokina Proliferativni odgovor B ly – protein A stafilokoka Produkcija Ig – ELISA Neutrofil i monocit funkcionalni testovi – fagocitozna aktivnost, respiratorni prasak, hemotaksa, adhezija Transplantacija – cross match

VI) Imunohistologija Za identifikaciju ćelijskih antigena i produkata na presecima tkiva Svetlosni, elektronski ili florescentni mikroskop Direktna Indirektna Pozitivne i negativne kontrole

VII) Alergije i hipersenzitivnost Reakcije preosetljivosti Tip I ukupni IgE (RIST) alergen specifični IgE (RAST) in vivo intradermalni test Reakcije preosetljivosti Tip II Coombs-ov test Reakcije preosetljivosti Tip III Autoantitela Reakcije preosetljivosti Tip IV Mantoux kožni test Funkcije T ćelija – proliferacija i produkcija citokina