METODE ZA ISPITIVANJE FUNKCIJA ĆELIJA PRIRODNOG I ADAPTIVNOG IMUNITETA

Παρουσίαση με θέμα: "METODE ZA ISPITIVANJE FUNKCIJA ĆELIJA PRIRODNOG I ADAPTIVNOG IMUNITETA"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 METODE ZA ISPITIVANJE FUNKCIJA ĆELIJA PRIRODNOG I ADAPTIVNOG IMUNITETA

2 MTT TEST Vijabilnost ćelija odgovara aktivnosti mitohondrija
Kolorimetrijski test: MTT žute boje se u živim ćelijama redukuje u crveno mrki nesolubilni formazan; rastvaranje kristala formazana→ oslobađanje boje, merenje apsorbance

3 ODREĐIVANJE BROJA I VIJABILNOSTI ĆELIJA
Brojanje ćelija na hemocitometru/ elektronski brojač Tripan plavo Metilensko plavo Kristal-violet test Propidijum jodid MTT test

4 Dobijanje i kultivacija dendritskih ćelija poreklom od monocita
(10%FCS/RPMI + GM-CSF i IL-4) (kultivacija, 6 dana) stimulacija različitim Imunomodulatorima, kultivacija -Ekspresija površinskih markera (protočna citometrija) -Procena alostimulatorne sposobnosti MoDC -Produkcija citokina od strane MoDC -Produkcija citokina od strane T-limfocita u ko-kulturi Ispitivanje fenotpiskih i funkcionalnih karakteristika MoDC

5 METODE ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA PRIRODNOG IMUNITETA
FAGOCITI (MAKROFAGI i NEUTROFILI) NK ĆELIJE

6 FAGOCITI MAKROFAGI NEUTROFILI Produkcija citokina (IL-12, TNFα...)
Fagocitoza Produkcija NO i ROS NEUTROFILI Produkti granula (MPO, elastaza, katepsin G...) - Fagocitoza - Produkcija NO, ROS - Produkcija citokina (IL-1, IL-6...)

7 1. ODREĐIVANJE SPOSOBNOSTI ADHEZIJE
Ispitivanje adhezije makrofaga sa i bez prisustva PMA Kratak opsi procedure: - kultivisati ćelije u mikrotitarskoj ploči (5x106 ćelija/bunariću) u četveroplikatima - dodati PMA (samo u polovinu bunarića) ostaviti da se inkubira 60 minuta pa potom ispranjem toplim PBSom ukloniti neadherentne ćelije - fiksirati adherentne ćelije metil-alkoholom (5-7 min) - obojiti ćelije rastvorom metilenskog plavog (10 min) - isprati boju 3x česmenskom vodom - dodati HCl (200μl, 0,1N HCl) - očitati apsorbancu na 650nm

8 3.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE CITOKINA
2.TEST FAGOCITOZE čestice obeležene fluorohromom, fagocitoza se detektuje fluorescentnim mikroskopom/FACS 3.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE CITOKINA Vanjćelijska/unutarćelijska detekcija citokina; ELISA testovi, ELISPOT...

9 4.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE ROS-NBT test
NADPH oksidaza NBT (oksidovana forma žuta) FORMAZAN (redukovana forma, plav→ sivo-crn) Kolorimetrijski test Intenzitet redukcije NBT-a srazmeran produkciji ROS

10 5. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE NO
Griess-ova reakcija (merenje neorganskog nitrita koji je krajnji produkt oksidacije kratkoživećeg NO) 6. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE MIJELOPEROKSIDAZE

11 7. ODREĐIVANJE MIGRACIJE NEUTROFILA (Transwell sistem)

12 NK ĆELIJE 2. Produkcija citokina (INF-γ) ELISA, ELISPOT
Testovi za funkcionalno ispitivanje NK ćelija: 1. Citotoksičnost ( korišćenje tumorskih ćelijskih linija npr. K562 i radioaktivnog 51Cr) 2. Produkcija citokina (INF-γ) ELISA, ELISPOT

13 METODE ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA ADAPTIVNOG IMUNITETA
T limfociti test proliferacije T limfocita in vitro detekcija produkcije citokina test citotoksičnosti B limfociti test proliferacije B limfocita in vitro detekcija produkcije antitela

14 T LIMFOCITI Test proliferacije
Proliferacija stimulisana različitim poliklonskim aktivatorima ili mitogenima limfocita (con A, fitohemaglutimin-PHA,anti-CD3, PMA...) ili specifinim antigenom Proliferativni odgovor se može meriti MTT testom, na osnovu inkorporacije 3H timidina u DNK...

15 -Izolacija mononuklearnih ćelija
-Kultivacija ćelija sa stimulatorom/antigenom 3-5 dana -Pred kraj kultivacije dodavanje radioaktivnog 3H timidina -Merenje radioaktivnosti na sintilacionom brojaču β zračenja

16 MEŠANA LEUKOCITNA REAKCIJA (MLR)
Transplantaciona reakcija Limfociti donora i recipijenta Dvosmerna i jednosmerna MLR

17 Produkcija citokina (ELISA, RIA, PCR...)
ELISPOT

18 Određivanje citotoksične aktivnosti T limfocita
Kokultivacija citotoksičnih T ly sa ciljnim ćelijama (tumorske ćelije,ćelije inficirane virusom itd) koje su obeležene radioizotopom (npr. 51Cr) Nivo oslobođenog radioizotopa je srazmeran citotoksičnom potencijalu ćelija

19 B LIMFOCITI Test proliferacije Produkcija antitela
Isti kao i kod T limfocita (kao mitogen se može koristiti stafilokokni protein A) Produkcija antitela ELISA, RIA, ELISPOT