DETERMINAREA PROTEINELOR - determinarea azotului Rolul proteinelor: - sursă de energie - sursă de aminoacizi esenţiali - menţinerea sănătăţii - component major al alimentelor - utliziat ca şi ingredient - conferă alimentelor proprietăţi speciale. 1. Determinarea cantitativă a proteinelor - informaţii nutriţionale - aspect legal 2. Identificarea proteinelor - analize de expertiză - depistarea falsurilor

Nt = Na + No = Na + Nnep + Np DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR Metode - chimice - fizice - fizico-chimice METODE CHIMICE - se bazează de determinarea conţinutului de azot. - mai multe tipuri de azot în alimente Nt = Na + No = Na + Nnep + Np - anorganică : NO3-, NH4+ - organică : proteică şi neproteică. (De regulă speciile anorganice sunt solubile în apă putând fi uşor de îndepărtat din aliment prin simpla dizolvare în apă)

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR 1. METODA KJELDAHL - elaborată în 1883 de către Johann Kjeldahl (berar) Principiu Alimentul este mineralizat în mediu acid puternic, azotul proteic fiind transformat în ion amoniu determinat ulterior prin titrare cu un acid tare. Metoda nu măsoară direct conţinutul de proteină - factor de conversie. Factorul de conversie F=6,25 (Proporţia de azot, in majoritatea proteinelor, este de aproximativ 16%). F variază în funcţie de secvenţa de aminoacizi specifică fiecărei proteine : - cereale (proteine cu conţinut ridicat în glutamină) F=5,7. - carne F=6,25 - lapte F= 6,38 - ouă F=6,68. - Aceasta presupune că proporţia de azot neproteic este nesemnificativă astfel încât determinarea azotului să reprezinte doar conţinutul total de proteine. - De regulă se determină azotul total

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR Analiza decurge în 3 etape: - mineralizarea/digestia - neutralizarea/distilarea - titrarea Mineralizarea/digestia - are loc la cald cu acid sulfuric când are loc reacţia : aliment + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 (1) - reacţia este însoţită de o degajare de SO2 şi SO3, conform reacţiilor: H2SO4  H2O + SO3 2SO3  2SO2 + O2 Amoniacul format în mediu acid nu este eliberat ca şi NH3 gazos, deoarece este captat în soluţie sub formă de (NH4)2SO4 .

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR Mineralizarea probei se face în majoritatea cazurilor cu H2SO4 şi diferite adaosuri menite să faciliteze acţiunea oxidantă a acestuia (apă oxigenată). Alegerea H2SO4 nu este făcută întâmplător, deoarece el beneficiază de avantajul unui punct de fierbere superior, care permite încălzirea prelungită la temperaturi relativ înalte, fără pierderi importante de soluţie. Pentru accelerarea procesului de mineralizare se adaugă de obicei săruri ale metalelor grele cu acţiune catalizantă, cum ar fi Ag+ , Cu2+ , Se3+ , Hg2+ . Adaosul sărurilor mercurice, creează însă inconvenientul formării combinaţiilor amidomercurice, ceea ce determină pierderi de NH3, ce trebuie ulterior surmontate prin adăugarea Na2S2O3 (acesta determină distrugerea combinaţiilor amidomercurice, în timpul distilării amoniacului). Se mai adaugă săruri ale metalelor alcaline, cum ar fi K2SO4 sau Na2SO4, în vederea creşterii temperaturii de fierbere, respectiv creşterea eficienţei procesului de mineralizare. Mineraizarea se realizează în baloane speciale, Kjeldahl, cu gât lung, încălzite în pozitie înclinată faţă de direcţia flăcării şi prevăzute cu o mică pâlnie, care funcţionează ca un refrigerent de aer, permiţând refluxarea permanentă a acidului sulfuric, eventual evaporat.

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR 1 - 5 g aliment, probă care conţine cca. 0,03 - 0,04 g N se cântăresc într-un balon Kjeldahl, se adaugă 20 mL acid sulfuric concentrat. Încălzirea se realizează lent, până la carbonizarea completă şi innegrirea puternică a soluţiei. Oxigenul rezultat oxidează treptat substanţele organice, fapt observat prin modificările de culoare care apar în soluţie. Culoarea neagră iniţială se atenuează şi se modifică treptat, ajungând până la decolorarea completă, sau la o slabă nuanţă galbenă (dacă există în probă cantităţi mari de fier), ceea ce indică terminarea procesului. Dacă proba conţine mult zahăr, spumează puternic la început, provocând astfel debordarea amestecului şi eventuale pierderi. Pentru evitarea acestui fenomen se utilizează fie adaosul a câtorva picături de alcool octilic, fie introducerea câtorva bile de sticlă, cu ajutorul cărora spuma se sparge mecanic. Uneori spumarea este evitată dacă se lasă proba cu acid peste noapte, înainte de încălzire.

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR Când există cantităţi mari de elemente ale grupei metalelor alcalino-pământoase, sulfaţii acestora precipită provocând pierderi prin coprecipitare. Operaţia durează de obicei mult, în funcţie de cantitatea şi de natura substanţei oxidate (mai ales în cazul probelor bogate în grăsimi). În cazul în care se urmăreşte determinarea azotului total trebuie remarcat faptul că în procesul de mineralizare nu se relizează trecerea în săruri de amoniu a combinaţiilor azotate oxigenate cum ar fi, nitraţii, nitriţii sau a unor combinaţii organice nitro, notrozo, nitril. Astfel se adaugă la proba de analizat acid sulfuric conc răcit la gheaţă, acid salicilic şi se agită bine balonul timp de 10 min. Se adaugă apoi Na2SO4 anh, Na2S2O3 sau granule de Zn, compuşi cu caracter reducător. Se mineralizează apoi proba în mod obişnuit.

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR Neutralizarea/distilarea După ce digestia s-a terminat (culoare alb-galbuie a soluţiei), balonul de mineralizare este conectat la un balon colector, prin intermediul unui tub. Soluţia din balonul de mineralizare este alcalinizată prin adiţie de NaOH şi supus încălzirii : (NH4)2SO4 + 2 NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4 Amoniacul gazos format este captat în balonul de captare, ce conţine o soluţie de acid boric, de concentraţie şi volum riguros cunoscut. Amoniacul este reţinut în soluţie sub formă de sare: NH3 + H3BO3 NH4+ + H2BO3-

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR Titrarea Conţinutul de azot este estimat prin titrarea boratului de amoniu format cu o soluţie titrimetrica de acid silfuric sau clorhidric, în prezenţa unui indicatpr potrivit pentru evidenţierea punctului final al titrării. NH4+ + H2BO3- + H+ + Cl- H3BO3 + NH4+ + Cl- Volumul soluţiei de acid necesar la titrare este echivalent cu cantitatea de amoniac eliberată în etapa anterioară. În general alături de proba de analizat se efectuează şi o probă blank pentru a putea fi luată în considerare orice cantitate de azot rezidual din reactivii utilizaţi pentru analiza.

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR Avantaje şi dezavantaje Avantaje: Metoda Kjeldahl este utilizată pe plan internaţional şi este încă metoda standard de comparaţie pentru alte metode de determinare a proteinelor. Faptul că poate fi aplicată pentru orice tip de proteină, datrorită preciziei şi reproductibilităţii înalte ii conferă poziţia de lider între metodele de determinare a proteinelor. Dezavantaje: Nu dă informaţii despre conţinutul de proteină reală, deoarece azotul din alimente nu provine numai de la proteine. Diferite proteine au factori de conversie diferiţi deoarece au secvenţe diferite de aminoacizi. Utilizarea atât acidului sulfuric la temperaturi înalte cât şi a sărurilor cu rol catalitic ridică factorul de risc al analizei. Este o tehnică care necesită mult timp, mineralizarea necesitând cel puţin 2-3 ore.

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR METODA DUMAS Este o tehnică automată instrumentală, capabilă să măsoare rapid conţinutul proteic. Se bazează pe metoda descrisă pentru prima dată de Dumas, acum un secol. Metoda concurează cu metoda Kjeldahl ca metodă standard pentru analiza proteinelor datorită rapidităţii ei. Principii generale O cantitate cunoscută de probă este arsă la temperaturi mari (900 oC) în prezenţă de oxigen. În urma arderii are loc eliberarea de CO2, H2O şi N2. CO2 şi H2O sunt înlăturate prin trecerea gazelor prin coloane speciale care le absorb. Conţinutul de azot este apoi determinat prin cromatografie de gaze. Coloana are ca scop separarea azotului de CO2 şi H2O rezidual, ca detector se utilizează detectorul de conductivitate termică. Instrumentul este calibrat prin analizarea unui material aflat în stare pură şi cu un conţinut binecunoscut de azot, cum ar fi EDTA ( 9.59%N). Astfel semnalul de la detector poate fi transformat în conţinut de azot. Ca şi în metoda Kjeldahl concentraţia de azot determinată este transformată în conţinut propteic utilizând factorul de conversie specific.

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR Avantaje şi dezavantaje Avantaje: Este mult mai rapidă decât metoda Kjeldahl (sub 4 min/determinare). Nu necesită reactivi toxici, măsurarea se poate face automat, este simplu de utilizat. Dezavantaje: Cost per analiză mare, nu dă o valoare adevărată a conţinutului proteic deoarece este analizat azotul total din aliment. Deasemenea proteine diferite necesită factori de conversie diferiti. Metoda necesitând cantităţi mici de probe ceea ce face dificilă etapa de obţinere a unei probe reprezentative.

MĂSURAREA ABSORBŢIEI RADIAŢIEI DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR MĂSURAREA ABSORBŢIEI RADIAŢIEI · UV-ViZ: concentraţia proteinelor poate fi determinată prin măsurarea absorbţiei radiaţiei din domeniul UV-VIZ. · IR: măsurarea absorbanţei în domeniu IR al spectrului poate fi utilizată pentru determinarea conţinutului proteic din alimente. În mod natural proteinele absorb radiaţia IR datorită vibraţiilor caracteristice a grupărilor chimice specifice scheletului polipeptidic. Analizele prin absorbţia în IR sunt utile în special pentru analizele on-line rapide. Sunt de asemenea avantajoase deoarece necesită o cantitate mică de probă şi sunt nedistructive. Dejavantajul major îl reprezintă costul ridicat al aparaturii şi calibrarea destul de laborioasă. · Rezonanţa magnetică nucleară: RMN poate fi utilizată la determinarea conţinutului total proteic. Acesta este determinat prin măsurarea ariei de sub picul corespunzător fracţiei proteice din spectrul RMN.

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR METODE SPECTROFOTOMETRICE UV-VIZ Aceste metode utilizează abilitatea proteinelor atât în stare naturală cât şi în stare chimic sau fizic modificată de a absorbi/împrăştia lumina din domeniul UV-VIZ a spectului electromagnetic. Principiul de bază a fiecărui astfel de test este similar. În primul rând este elaborată o curbă de calibrare absorbanţă (turbiditate) în funcţie de concentraţia de proteină, pe baza unor soluţii proteice de concentraţie cunoscută. Se măsoară apoi absorbanţa (turbiditatea) soluţiei de analizat la aceeaşi lungime de undă şi se determină concentraţia pe baza curbei de calibrare. Diferenţele principale dintre metode constau în grupele chimice care sunt responsabile de absorbţie/împrăştierea radiaţiei, cum ar fi legătura peptidică, grupările aromatIce din lantul lateral, grupările bazice sau agregatele proteicie.

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR Măsurarea directă la 280 nm Triptofanul şi tirozina absorb puternic lumina UV la 280 nm. Conţinutul de triptofan şi tirozină din multe proteine este aproape constant, deci absorbanţa soluţiilor proteice la 280 nm poate fi folosită pentru determinarea concentraţiei proteice. Avantajele acestei metode sunt: procedură simplă, nedistructivă, nu necesită reactivi speciali. Dezavantajul major este acela că acizii nucleici absorb deasemenea puternic la 280 nm şi pot astfel interfera în determinarea proteinelor dacă aceştia sunt în concentraţie suficient de mare. Chiar şi în această situaţie au fost dezvoltate metode pentru a preveni aceste probleme, de exemplu măsurarea absorbanţei la două lungimi de undă diferite.

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR Metoda biuretului În condiţii alcaline ionul cupric reacţionează cu grupările din legăturile peptidice rezultând un compus colorat violet-purpur. După amestecarea reactivului cu soluţia proteică se lasă să se dezvolte culoarea timp de 15-30 min după care se citeşte absorbanţa la 540 nm. Avantajul major al acestei tehnici este acela că nu există interferenţi proveniţi din chimicale care să absoară la această lungime de undă iar tehnica este mai puţin sensibilă la tipul de proteină deoarece utilizează absorbţia implicând legătura peptidică – comună tuturor proteinelor decât pe grupările laterale specifice. Reactivul – biuret care conţine toate chimicalele necesare analizei poate fi procurat din comerţ. Dezavantaje: sensibilitatea este mai mică decât metodele de absorbţie directă în UV-VIZ.

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR Metoda Lowry Metoda Lowry combină reactivul biuret cu un alt reactiv - Folin- Ciocalteau (reactiv specific pentru grupele fenolice) care reacţionează cu tirozina şi triptofanul. În urma reacţiei rezultă un compus albastru a cărui absorbanţă poate fi citită în intervalul 500 - 750 nm în funcţie de sensibilitatea necesară. Există un mic pic în jur de 500 nm care poate fi utilizat în cazul concentraţiilor mari de proteină şi un pic mai mare în jur de 750 nm care poate fi utilizat pentru determinarea concentraţiilor mai mici de proteină. Această metodă este mai sensibilă la concentraţii mai mici de proteină decât metoda biuretului.

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR Metoda cu coloranţi O cantitate cunoscută şi în exces de colorant anionic (încărcat negativ) se adaugă la soluţia proteică a cărui pH este ajustat astfel încăt proteina să fie încărcată pozitiv (mai mic decât punctul izoelectric). Proteina şi colorantul formează un complex insolubil în apă datorită interacţiunilor electrostatice. Colorantul anionic se leagă de grupările cationice a reziduurilor bazice ale aminoacizilor (histidină, arginină şi lisină) şi la grupările amino terminale libere. Colorantul nelegat rămâne în soluţie şi este determinat prin măsurarea absorbanţei, după separarea complexului insolubil prin centrifugare. Cantitatea de proteină din soluţia analizată este proporţională cu cantitatea de colorant legată care se calculează prin diferenţă. Colorantlegat = colorantiniţial - colorantliber

DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR Avantaje şi dezavantaje Avantaje: Tehnicile UV-VIZ sunt rapide şi simple şi sunt sensibile pentru concentraţii proteice mici. Dezavantaje: Pentru majoritatea tenicilor UV-VIZ sunt necesare utilizarea soluţiilor diluate şi transparente, care nu conţin substanţe contaminante care să absoarbă sau să imprăştie radiaţia la aceeaşi lungime de undă ca şi proteina analizată. Necesitatea soluţiilor transparente presupune faptul că majoritatea alimentelor trebuie să parcurgă o serie de etape de pregătire a probei înainte de analiză, cum ar fi: omogenizare, extracţie cu solvenţi, centrifugare, filtrare, operaţii care pot fi laborioase şi consumatoare de timp. În plus este extrem de dificilă extracţia cantitativă a proteinelor din câteva tipuri de alimente, mai ales după ce acestea au fost procesate astfel proteinele devenind agregate sau legate covalent de alte substanţe. În plus absorbanţa depinde de tipul proteinei analizate – proteine diferite având secvenţe diferite de aminoacizi.

DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor Analiza alimentelor este interesată şi de tipul proteinelor prezente, deoarece fiecare proteină are caracteristicile nutriţionale şi fizico- chimice unice. Tipul proteinei este de obicei determinat prin separarea şi izolarea proteinei individuale din amestecul complex de proteine, astfel încât să poată fi identificată şi caracterizată. Proteinele sunt separate pe baza diferenţelor dintre proprietăţile fizico- chimice, cum ar fi mărime, sarcină, solubilitate, stabilitaze termică şi parametrii de adsorbţie. Unul dintre factorii care trebuie luaţi în considerare în procesul de separare este posibilitatea alterării structurii tridimensionale a proteinei native.

DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor Există metode de separare la scală macro pentru izolarea proteinelor care se găsesc în cantitate mare, în timp ce pentru proteinele aflate în cantităţi mici sau sunt scumpe există metode la scală micro. Alegerea celei mai potrivite tehnici de separare depinde de o serie de factori, cum ar fi: cantitatea de probă disponibilă, echipamentul disponibil, tipul de proteină existent, costul de analiză, inclusiv motivul pentru care se efectuează analiza. Cunoaşterea apriori a efectelor condiţiilor de mediu asupra structurii proteinei şi a interacţiunilor acesteia cu mediul este foarte util pentru alegerea celei mai potrivite tehnici de separare. În primul rând pentru că ne ajută să determinăm condiţiile cele mai potrivite pentru izolarea unei anumite proteine dintr-un amestec (pH, forţă ionică, tip solvent, temperatură) şi în al doilea rând sunt importante condiţiile care nu au efect negativ asupra structurii proteice (protejare).

DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor Metode bazate de diferenţa de solubilitate Proteinele pot fi separate prin exploatarea diferenţelor de solubilitate în soluţii apoase. Solubilitatea unei molecule de proteină este determinată de : - mărime, - formă, - hidrofobicitate - sarcina electrică. Proteinele pot fi selectiv precipitate sau solubilizate prin modificarea pH-ului, forţei ionice, constantei dielectrice sau temperatura soluţiei. Aceste variabile, reflectări ale faptului că proteinele sunt electroliţi de masă moleculară mare, pot fi utilizate la separarea amestecurilor de proteine, deoarece fiecare proteină are compoziţia sa proprie de aminoacizi, care determină comportarea ca electrolit. Tehnicile de separare sunt simplu de utilizat când sunt implicate cantităţi mari de probă, deoarece ele sunt relativ rapide, ieftine şi nu sunt influenţate în mod particular de către ceilalţi componenţi alimentari. Sunt des utilizate ca un prim pas în procedurile de seaprare deoarece majoritatea componenţilor contaminanţi pot fi uşor înlăturaţi.

DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor Salefierea proteinelor Sărurile neutre au efecte puternice asupra solubilităţii proteinelor globulare. În concentraţii mici, sărurile cresc solubilitatea proteinelor, fenomen cunoscut ca salting-in. Sărurile ionilor divalenţi MgCl2 şi (NH4)2SO4 sunt mult mai eficiente în acest sens decât cele monovalente KCl, NaCl, NH4Cl. Capacitatea sărurilor neutre de a influenţa solubilitatea proteinelor este în funcţie de forţa ionică, mărime care măsoară atât concentraţia cât şi numărul de sarcini electrice. Pe măsură ce tăria ionică continuă să crească solubilitata proteinelor începe să scadă. La o tărie ionică suficient de mare, o proteină poate fi precipitată aproape complet din soluţie, fenomen cunoscut sub numele de salting-out. Principiile fizico-chimice care stau la baza acestui proces sunt complexe. Unul din factorii care intervin este îndepărtarea apei de hidratare din molecula proteinei de către concentraţia mare de sare, ceea ce duce la scăderea solubilităţii. Fiecare proteină răspunde diferite la concentraţia sărurilor neutre.

DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor Precipitarea izoelectrică Solubilitatea celor mai multe proteine globulare este puternic influenţată de pH-ul sistemului, indiferent de concentraţia NaCl. De ambele părţi ale pH-ului critic solubilitatea creşte forte brusc. Aproape toate proteinele globulare au un minim de solubilitate, pH-ul corespunzător diferind de la o proteină la alta. pH-ul la care o proteină este cel mai puţin solubilă este pH-ul său izoelectric, definit ca pH-ul la care molecula nu are încărcare electrică şi nu se deplasează în câmp electric. În aceste condiţii nu sxistă respingere electrostatică între molecule proteice învecinate, care tind să se aglomereze şi să precipite. La valori de pH deasupra sau sub pI toate moleculele de proteină au încărcare electrică netă de acelaş semn, deci ele se vor respinge prevenind aglomerarea, în agregate insolubile.

Proteină pH-izoelectric Proteină pH-izoelectric DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor Deoarece proteinele au valori deferite ale pH-ului izoelectric, datorită conţinutului lor diferit de aminoacizi cu grupări R ionizabile pot fi separate prin precipitare izoelectrică. Proteină pH-izoelectric Proteină pH-izoelectric Pepsină 1 γ1- globulină 6,6 Ovalbumină 4.6 Hemoglobină 6,8 Albumină serică 4,9 Mioglobină 7 β-lactoglobulină 5,2 Ribonuclează 9,6

DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor Fracţionarea cu solvenţi Solubilitatea proteinelor depinde de constanta dielectrică a soluţiei deoarece alterează amplitudinea interacţiunilor electrostatice dintre grupele cu sarcină. Pe măsură ce constanta dielectrică scade intensitatea interacţiunilor electrostatice creşte. Aceasta duce la scăderea solubilităţii proteinelor în soluţie deoarece ele sunt mai puţin ionizate, şi astfel repulsiile electrostatice dintre ele nu sunt suficient de mari pentru a preveni agregarea. Constanta dielectrică a soluţiilor apoase poate fi scăzută prin adăugare de solvenţi organici solubili, cum ar fi etanol şi acetonă. Cantitatea de solvent organic necesară precipitării depinde de tipul proteinei, şi prin urmare aceasta poate fi separată prin precipitare de restul proteinelor. Cantiatea optimă de solvent organic necesară precipitării proteinei variază între 5-60%. Operaţia se realizează de obicei sub 0oC pentru a preveni denaturarea proteinelor prin creşterea temperaturii la amestecarea solvetului organic cu apa.

DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor Separarea proteinelor prin cromatografie de adsorbtie Cromatografia de adsorbţie implică separarea compuşilor prin adsorbţia/desorbţia selelctivă a compuşilor pe suprafaţa unui adsorbant reţinut în interiorul unei coloane prin care proba şi faza mobilă trec. Separarea se bazează pe diferenţele de afinitate a proteinelor faţă de faza staţionară. În funcţie de tipul fazei staţionare există două tipuri de mecanisme de separare care se pot aplica în cazul separării proteinelor: - cromatografia prin schimb ionic - cromatografia de afinitate. Separarea si caracterizarea se poate realiza atat pe pe coloane deschise cat si inchise, de inalta performanta.

DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor Cromatografia prin schimb ionic Cromatografia prin schimb ionic se bazează pe fenomenele reversibile de adsorbţie/desorbţie respectiv schimb ionic a ionilor din soluţie şi grupările ionice ale unei matrici solide sau reţea polimerică. Această tehnică este cea mai utilizată tehnică cromatografică pentru separarea proteinelor. Un sorbent capabil sa schimbe anionii proprii cu cei ai probei se numeste anionit. Faza mobilă este formată dintr-un electrolit având o anumită forţă ionică şi un anunmit pH, astfel încât să favorizeze un număr maxim de legături între faza staţionară şi proteina de interes. Proteinele contaminante trebuie să se lege mai puţin puternic, astfel încât să treacă mai repede prin coloană. Proteina de interes este apoi eluată cu o altă soluţie tampon care să favorizeze desorbţia.

DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor Cromatografia de afinitate În cromatografia de afinitate, ca fază staţionară se utilizează suporţi solizi de care se leagă chimic-covalent un ligand. Ligandul este o moleculă care prezintă afinitate specifică pentru o proteină dată. Proba de analizat este trecută prin coloană, iar proteina de interes este reţinută pe suprafaţa sorbentului, în timp ce proteinele contaminante trec nereţinute. Proteina de interes este apoi eluată cu cu o soluţie tampon care favorizează desorbţia. Această tehnică este cea mai eficientă metodă de separare a proteinelor individuale dintr-un amestec de proteine, dar este şi cea mai scumpă metodă, deoarece necesită coloane cu faze staţionare specifice.

DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor Separări bazate pe diferenţele de masă Proteinele pot fi separate pe baza masei moleculare. Aceasta variază între 10.000 şi 1.000.000 daltoni. In practică, separarea depinde de raza Stokes a proteinei, mai degrabă decât masa moleculară. Raza Stokes reprezintă raza medie pe care molecula proteică o are în soluţie şi depinde de structura ei tridimensională. Dializa Dializa este folosită pentru separarea moleculelor din soluţie. Se bazează pe utilizarea unor membrane semipermeabile care permit trecerea moleculelor mai mici decât o anumită mărime dată. Soluţia proteică este plasată în tubul de dializă care este închis şi plasat într-un volum mare de apă sau tampon şi care este agitată uşor continuu. Moleculele mici trec prin pereţii tubului iar cele de proteină vor fi reţinute în interiorul lui. Dializa este o metodă lentă, necesitând până la 12 ore. Este utilizată frecvent în laborator pentru înlăturarea sărurilor după separarea prin salefiere.

DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor Ultrafiltrarea Soluţia proteică este plasată într-o celulă ce conţine o memdrană semipermeabilă şi apoi este aplicată o presiune sau este supusă centrifugării. Moleculele mici şi apa trec prin membrană, moleculele de proteină fiind reţinute. Principiul de separare este similar dializei, dar datorită aplicării presiunii separarea este mult mai rapidă. Sunt disponibile membrane semipermeabile cu dimensiunile critice cuprinse între 500 şi 300.000.

DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor Cromatografia prin excludere moleculară Această tehnică cunoscută şi sub numele de filtrare prin gel separă proteinele pe baza mărimii lor. Soluţia proteică este introdusă într-o coloană a cărei umplutură este formată dintr-un polimer reticulat (dextrină, agaroză). Moleculele mai mari decât porii polimerului sunt excluse şi ies rapid din coloană. Moleculele mai mici pot intra în pori, deci viteza lor de deplasare prin coloană este retardată. Astfel moleculele sunt eluate din coloană în ordinea scăderii dimensiunilor. Există faze staţionare care prezintă mărimi diferite ale porilor astfel încât permit seaprarea proteinelor cu diferite mase moleculare. Fabricantul acestor faze staţionare dau informaţii asupra domeniului de greutăţi moleculare pentru care acestea sunt cele mai potrivite. Masa moleculară a proteinelor necunoscute poate fi determinată prin compararea volumului de eluţie cu cel al unor molecule proteice cu masa cunoscută: reprezentare grafică a volumunlui de eluţie funcţie de logaritmul masei moleculare trebuie să fie o linie dreaptă. O problemă asociată acestei metode este că masa moleculară nu este direct corelată cu raza Stokes pentru diferite forme ale proteinelor.

ANALIZA AMINOACIZILOR Analiza aminoacizilor depinde de mulţi factori: - matricea probei, - concentraţia de aminoacizi, - sensibilitatea ceruta, - tipul analizei. In urma analizei se determina: - profil de aminoacizi liberi - profil total de aminoacizi (după hidroliză). ETAPE 1. Pregătirea probei Tratamentul probelor diferă, depinzând de scopul analizei. - Pentru determinarea aminoacizilor liberi este necesara obţinerea unui extract, purificare si derivatizare înainte de determinare. - Pentru determinarea conţinutului total de aminoacizi - etapa de hidroliză. Extracţia - se poate realiza in cazul matricilor insolubile (peste, carne, cereale, etc.) si de obicei se realizează prin omogenizarea probei mărunţite sau măcinate într-un solvent potrivit. Există aparate specializate (Polytron Stomacher) sau dispozitive mai simple care presupun agitarea cu sau fără încălzire. Aminoacizii sunt solubili în apă, cisteina şi tirozina având solubilitatea mai mică. De regula se utilizează apă sau o soluţii de acid sulfosalicilic 4%, acid tricloracetic 5%, HCl 0,1 N. Se pot utiliza de asemenea şi soluţii alcoolice (etanol, metanol) care prezintă avantajul de a nu extrage proteinele (nu mai este necesară purificarea ulterioara a extractului). Solidele solubile necesită doar dizolvare preliminară. In cazul probelor lichide nu se mai pune în discuţie extracţia.

ANALIZA AMINOACIZILOR 2. Purificarea probei - izolarea aminoacizilor de alţi compuşi extraşi (proteine, carbohidraţi, grăsimi) - este necesar pentru a evita probleme potenţiale cum ar fi colmatarea coloanei analitice şi/sau interacţiunea cu alţi compui extraşi cum ar fi proteinele. Prezenţa grăsimilor nu ridică probleme pentru extracţie dar trebuie îndepărtate pentru a preveni interferenţele sau deprecierea coloanei. Grăsimile sunt extrase din probe solide cu un amestec cloroform : acetona (1:3), sau extractul poate fi spălat succesiv cu acetat de etil şi dietileter. Extractul obţinut este centrifugat la rece (4 C) iar supernatantul filtrat prin vată de sticlă când se reţin materiile grase de pe suprafaţa supernatantului. Separarea de proteine şi polipeptide - deproteinizare. - chimică se realizează cu soluţii concentrate de acizi tari, acid sulfosalicilic, percloric, trifluoracetic, picric, fosfomolibdenic, soluţii concentrate saline, solvenţi organici (metanol, etanol, acetonitril). În aceste condiţii proteinele precipita prin denaturare în timp ce aminoacizii rămân în soluţie. - fizică presupune centrifugarea prin filtre membrane limitative (CUT-OFF) care permit trecerea aminoacizilor în timp ce compuşii cu masa moleculara mare sunt reţinuţi. Diferenţa dintre aceste metode consta in: - diferenţa între masa moleculara a moleculelor excluse, - grad de recuperare a aminoacizilor, - compatibilitatea cu condiţiile de derivatizare şi cele necesare separării analitice.

ANALIZA AMINOACIZILOR Exemple: - Acidul fosfomolibdenic este foarte eficient dar produce pierderi de aminoacizi cu caracter acid si/sau bazic în special lizină. Acizii tari scad foarte mult valoarea pH-ului în contextul în care derivatizarea se realizează în medii bazice pentru analizele prin derivatizare precoloană. Îndepărtarea acidului se realizează prin evaporare şi/sau ajustarea pH-ului. În cazul în care analiza se realizează prin cromatografie de schimb ionic şi derivatizare postcoloană nu mai apar probleme. Chiar dacă acidul sulfosalicilic este cel mai utilizat agent de deproteinizare s-au constatat unele interferenţe şi grade scăzute de recuperare. - Utilizarea solvenţilor organici prin amestecarea a 2-3 volume solvent organic cu un volum extract are rezultate foarte bune, gradul de recuperare fiind aproape de 100%. Prezintă avantajul că este uşor de îndepărtat prin evaporare. - Soluţiile saline concentrate nu sunt utilizate la deproteinizare deoarece interferă în procesul de derivatizare şi hidroliză. Purificarea probelor utilizând răşini schimbătoare de cationi (cationiţi) reţin aminoacizii din medii acide în timp ce alţi interferenţi cum ar fi carbohidraţii trec prin coloana nefiind reţinuţi. Ulterior aminoacizii sunt desorbiţi cu o bază volatilă care apoi este înlăturată prin evaporare. În cazul extracţiei pe fază solidă cu C18 compuşii cum ar fi grăsimile, proteinele şi peptidele sunt reţinute, în timp ce compuşii polari şi aminoacizii trec nereţinuţi. Metoda nu este foarte bună deoarece aminoacizii hidrofobi se pot reţine (grade mici de recuperare) iar compuşii hidrofili nu se reţin, impurificând extractul.

ANALIZA AMINOACIZILOR Hidroliza 1. Hidroliza acidă - proba este tratată cu HCl 6N la 110C timp de 20-96 h sau 145C timp de 4 h. În aceste condiţii dure poate avea loc degradarea unor aminoacizi. Digestia se realizează în recipiente închise în atmosferă inertă de azot, pentru a minimiza degradările. Hidroliza poate fi realizată atât cu metode în fază lichidă cât şi gazoasă. În metodele în fază lichidă HCl este în contact direct cu proba, fiind potrivită pentru probe complexe (cereale etc.). Hidrolizatul contine multi interferenti, de aceea analiza necesita metode cromatografice prin schimb ionic şi derivatizare postcoloană. Digestia în fază gazoasă reduce zgomotul de fond. În cazul cantităţilor limitate de probe se utilizează hidroliza în fază de vapori. În această metodă în tubul de hidroliză este plasată proba şi apoi totul într-un vas mare ce conţine HCl. Atmosfera oxidantă (oxigen) este înlocuită cu azot inert. În urma încălzirii numai vaporii de HCl vin în contact cu proba, fiind astfel exclusă contaminarea cu compuşi nevolatili. Această metodă este mai potrivită pentru determinările cu derivatizare precoloană. Hidroliza poate fi îmbunătăţită prin optimizarea temperaturii şi a timpului de hidroliza, sau prin adăugarea de compuşi protectori ai aminoacizi labili (tirosină, serină, treonină, metionină, triptofan-foarte sensibil în probele cu conţinut ridicat de carbohidraţi) cum ar fi: fenol, Na2SO3, triptamină, mercaptoetanol, acid mercaptoetenoic, acid tio- şi ditiodipropionic. De asemenea HCl poate fi înlocuit cu acid metansulfonic 4 N. Se utilizează agenţii de alchilare pentru a stabiliza aminoacidul (cisteina) rezultat în urma hidrolizei: acid brompropionic, acid iodoacetic bromopropilamina, vinilpiridina. Glutamina şi asparagina sunt dezaminate în timpul hidrolizei şi sunt codeterminate cu acidul glutamic şi aspartic. O altă problema de care trebuie ţinut cont este rămânerea intactă a unor peptide chiar după 24 de ore de hidroliză. Aceste polipeptide sunt formate în principal de către aminoacizii hidrofobi cum ar fi valina, leucina, isoleucina, şi fenilalanina. Aceste peptide sunt mult mai rezistente faţă de hidroliză şi necesită o perioadă mai lungă. Dar aceste condiţii ar duce la degradarea altor aminoacizi.

ANALIZA AMINOACIZILOR Aşa cum se observă nu există nici un set de condiţii experimentale care să îndeplinească toate condiţiile metodele utilizate reprezintă un compromis pentru obţinerea unui număr cât mai mare de aminoacizi. Se realizează o hidroliza la 110 C 22-24 h, de preferat în stare de vapori, în prezenţă de agenţi protectivi (fenol). Pentru analiza triptofanului şi cisteinei sunt necesare proceduri speciale. 2. Hidroliza alcalină – se realizeaza cu soluţii 4,2 M de NaOH, KOH, LiOH sau Ba(OH)2 cu sau fără adiţie de 1% (m/v) tioglicol timp de 18 h la 110 0C. 3. Hidroliza enzimatică - se realizează cu enzime proteolitice cum ar fi tripsina, chimotripsina, carboxipeptidază, papaină, thermolizină. Trebuie sa se tina cont de activitatea specifică a enzimei utilizate.

ANALIZA AMINOACIZILOR DETERMINAREA CANTITATII TOTALE DE AMINOACIZI Cea mai simpla sarcina este determinarea continutului total de aminoacizi, fara a face discriminare unii de altii. Sunt metode spectrofotometrice, care se bazeaza pe reactia gruparilor α-aminice cu reactivi: - o-ftaldialdehida, - ninhidrina - acid trinitro-benzen-sulfonic. Exista o corelatie liniara intre intensitatea absorbtiei/emisiei si concentratia gruparilor aminice. Se aplica pentru: - obtinerea indexului protelitic, - controlul gradului de hidroliza a proteinelor alimentare, - controlul procesului de eliminare a proteinelor din vin, - controlul proceselor de fabricatie (branza), - dezvoltarea aromei pe baza aminoacizilor care in urma transformarilor genereaza compusi ce comfera aroma, etc.

ANALIZA AMINOACIZILOR METODE DE DETERMINARE CARE IMPLICA TEHNICI DE SEPARARE Analiza aminoacizilor individuali necesită o separare prealabilă mai puţin cazul in care se utilizează metode selective de determinare. Separarea aminoacizilor din amestec necesita tehnici de separare foarte eficiente cum ar fi cromatografia (HPLC, CG) sau electroforeza capilara. Alegerea tehnicii de analiza depinde in principal de echipamentul disponibil şi de preferinţele personalului, deoarece fiecare metoda prezintă avantaje si dezavantaje. A) Cromatografia de lichide 1. Metode prin schimb cationic - se bazează pe faptul ca aminoacizii au sarcină electrică. Ca fază staţionară se utilizează polistirenul sulfonat cu soluţii apoase tampon de citrat de sodiu ca faze mobile. Elutia se realizează cu gradient, creşterea atât a pH-ului cât si a concentraţiei. In aceste condiţii aminoacizii cu caracterul cel mai acid vor ieşi primii iar cei cu doua sau mai multe grupări amino primare vor fi eluati mai târziu. După separare aminoacizii sunt derivatizaţi pentru detecţie fie in VIZ fie in fluorescenţă. Se pot utiliza de asemenea si detectori electrochimici. Avantajul metodei este ca da rezultate foarte precise pentru toate tipurile de probe cunoscute. Este considerată metoda de referintă. Fiecare metodă noua trebuie sa se raporteze la această metodă. Dezavantajul major constă in costul ridicat al aparaturii, a fazelor mobile complexe şi a timpului lung de analiză.

ANALIZA AMINOACIZILOR 2. Crompatografie de lichide cu fază inversă (RP-HPLC) - este foarte utilizata deoarece poate fi folosita şi pentru alte aplicaţii. În acest caz aminoacizii trebuie derivatizaţi înainte de separare pentru ai transforma în molecule hidrofobe, astfel încât să poată participa la procese de repartiţie între faza stationară şi cea mobilă. Totodată derivatizarea va permite o detectie mai bună. - Faza mobilă trebuie să dizolve proba pentru a fi transparentă pentru sistemul de detectie. Faza mobilă este o combinaţie de tampon apos cu un solvent organic ca metanol, acetonitril, tetrahidrofuran. Tamponul este format din soluţii cel mult 100mM de acetat sau fosfat. De regulă eluţia se realizează cu gradient. - Cele mai utilizate faze stationare sunt cele de silicagel chimic modificate cu grupări alchil, în principal C18. Selectivitatea obţinută cu coloane provenite de la producători diferiti este diferită datorită metodelor diferite de atasare a lantului alchil de suprafata suportului de silicagel, de densitatea acoperirii care comfera un grad mai mare sau mai mic de hidrofobicitate. Deasemenea grupările silanol nereactionate pot interacţiona cu moleculele aminoacidului ducând la aparitia picurilor cu cozi. Pentru a preveni acest inconvenient se poaze adăuga trietilamină.

Analiza aminoacizilor Derivatizarea - are ca scop îmbunătăţirea : - separarii, - detecţiei. Eficienţa agentului de derivatizare este evaluată pe baza următoarelor aspecte: - să reacţioneze atât cu aminoacizii primari cât şi cu cei secundari, - să dea un singur derivat cu fiecare aninoacid, - să reacţioneze cantitativ şi reproductibil, - produsul rezultat să fie stabil, - să nu existe interferenţe ale produşilor secundari sau a excesului de agent de derivatizare, - să necesite condiţii simple şi blânde de reacţie, - să prezinte posibilitate de automatizare.

Analiza aminoacizilor DERIVATIZARE ÎN VEDEREA ÎMBUNĂTĂŢIRII DETECŢIEI - sensibilitatea şi selectivitatea detecţiei sunt influentate de proprietăţile spectrale şi electrochimice a derivaţilor obţinuţi. Alegerea agentului de derivatizare este fosrte importantă. Detecţie spectroscopică - se bazeaza pe ataşarea de molecula aminoacidului grupări care conferă moleculei derivate proprietăţi absorbante (UV/Viz) sau fluorescente. Derivatizarea se poate realiza înaintea separării - derivatizare precoloană sau după separare - derivatizare postcoloană. Derivatizarea precoloană atât on-line cât şi off-line iar cea postcoloană se realizează on-line. 1. Derivatizarea precoloană: pe lângă îmbunătăţirea selectivităţii și sensibilităţii în urma derivatizării moleculele de aminoacid devin mai hidrofobe, făcându-le potrivite şi pentru separarea prin cromatografie de lichide pe fază inversă RP18. Ca reactivi de derivatizare se utilizează: a. Fenil-iso-tiocianat – reacţionează atât cu aminoacizii primari cât şi cu cei secundari, formând derivatul feniltiocarbamil, detectabil în UV la 245 nm. Derivatul rezistă la temperatura camerei 1 zi şi o durată mai lungă de timp în frigider, mai ales în absenta apei. Prepararea probei este laborioasa, necesită mediu bazic (trietilamina, pH 10,5) şi include câteva etape de uscare, ultima etapă fiind cea de înlăturare a excesului de reactiv, care poate distruge coloana. Derivatul apare în cel mult 10 min, deci un timp de reacţie de 20 de min este suficient pentru reacţia totală. Compoziţia reactivului de derivatizare este esenţială pentru determinarea acidului glutamic şi aspartic. Prezenţa cationilor mono şi bivalenţi (provenit din sticlărie în timpul hidrolizei) şi a sărurilor (NaCl) pot cauza insolubilizarea derivaţilor acidului aspartic şi glutamic. Pentru ceilalţi aminoacizi concentraţia NaCl nu prezintă importanţă C6H5-N=C=S + H2N-HCR-COOH C6H5-NH-CS-NH-HCR-COOH

Analiza aminoacizilor b. Clorura de 4-dimetil-aminobenzen-4-sulfonil (Dabsyl-Cl sau DBS) - detecţie în domeniul vizibil la 448-468 nm. Lungimea de unda mare de absorbţie face ca linia de bază a cromatogramei să fie stabilă pentru multe sisteme de solvenţi. Limita de detecţie în domeniul picomolilor. Derivaţii sunt foarte stabili (1 săptămână) şi pot fi formaţi atât de aminioacizii primari cât şi cei secundari. Timpul de reacţie este de aprox. 15 min la 70 C, are loc în mediu bazic cu exces de reactiv. Eficienţa reacţiei depinde foarte mult de matrice şi variază funcţie de tipul aminoacidului şi prezenţa clorurilor în concentraţie mare.

Analiza aminoacizilor c. Clorura de 1-dimetilamino-naftalen-5-sulfonil (Dansyl-Cl) - este mult folosit pentru determinarea azotului terminal din proteine şi peptide. Reacţionează cu aminoacizii primari şi secundari dând un derivat puternic fluorescent (detecţie prin excitare la 350 nm şi măsurarea emisiei la 510 nm sau detecţie la 250 nm). Derivatul este stabil 1 zi sau 7 zile la întuneric şi la -40 C. Derivatizarea este simplă, necesită mediu bazic pH-9,5 timp de reacţie 1 h la temperatura camerei la întuneric / 15 min la 60C sau 2 min la 100C. Poate forma derivaţi multiplii cu histidina, lisina şi tirosina, deci condiţiile de reacţie trebuie optimizate şi atent controlate.

Analiza aminoacizilor d. 5-5'-ditio-bis(nitrobenzoic acid) (DTNB) - utilizat pentru aminoacizii cu sulf e. 4-fluoro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-F) - da derivaţi stabili atât cu aminoacizii primari cât şi cu cei secundari, lungimea de excitare la 470 nm şi cea de emisie 530 nm. Timp de reacţie 1 min la 60 0C f. 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-Cl) - se utilizează la determinarea cantitativă a tiolilor şi aminelor reacţionează cu cisteina in mediu acid dând un produs verde cu maximul de absorbţie la 410 nm.

Analiza aminoacizilor g. 9-fluorenilmetil-cloroformate (F-MOC) - dă derivaţi fluorescenti atat cu aminele primare cat si cu cele secundare, lungimea de undă de excitare 265nm, emisie 315 nm. Dezavantajul cel mai mare este ca reactivul de derivatizare este fluorescent şi poate interfera in determinare. Este extras înainte de analiză. Reactioneaza cu amine puternic hidrofobe rezultând compuşi cu timp de retenţie mare. Timp de reacţie 45-90s fara incalzire. h. Aldehida o-ftalica (o-phthaldialdehyde – OPA) – reactioneaza cu aminoacizii primari in prezenta mercaptanului pentru a da un compus cu fluorescenta ridicata. Fluorescenta este măsurata la 455nm sau 470 nm după excitare la 230 respectiv 330 nm. Reactivul in sine nu este fluorescent. Derivaţii pot fi detectaţi si in absorbţie la 338 nm. Tipul mercaptanului utilizat influenteaza stabilitatea selectivitatea cromatografica si intensitatea fluorescentei. Dintre cei mai utilizati: 2-mercaptoetanol, etantiol, si acidul 3-mercaptopropionic. Derivatizarea este rapida (1-3 min) la temperatura camerei si in mediu alcalin (tampon pH=9,5). Dezavantajul major este ca aceşti derivaţi nu sunt stabili, problema fiind parţial rezolvata prin controlarea stricta a timpului dintre etapa de derivatizare si cea de injectie. Nu reactioneaza cu aminele secundare. Acest dezavantaj poate fi surmontat prin transformarea aminelor secundare in amine primare prin oxidare cu hipoclorit sau cloramina înainte de derivatizare.

Analiza aminoacizilor 2. Derivatizarea postcoloană - implică separarea aminoacizilor liberi prin cromatografie de lichide, introducerea în efluent a agentului de derivatizare potrivit, amestecarea şi trimiterea lor cu ajutorul unei pompe în camera de reacţie şi în final pomparea derivatului obţinut în detector. Principalul dezavantaj al acestui tip de derivatizare este că necesită echipament adiţional: o pompă pentru introducerea şi amestecarea agentului de derivatizare şi eventual un dispozitiv de încălzire. Un alt dezavantaj este lărgirea picului la bază produs de către volumul mort introdus după coloană. Ca şi reactivi de derivatizare se utilizează: ninhidrina, fluorescamina şi aldehida o-ftalică. a. fluorescamina – nu este fluorescenta, derivatul se masoara la 475 excitare la 390nm. Un dezavantaj major este acela că reacţia are loc în mediu bazic, în contextul în care separarea prin schimb ionic are loc în mediu acid. Aceasta face necesară adaugarea unei pompe suplimentare pentru a introduce un tampon bazic înainte de a reactia cu fluorescaina. Se foloseşte numai în cazul derivatizărilor speciale.

Analiza aminoacizilor b. ninhidrina - reacţionează cu toţi cei 20 de aminoacizi dând compuşi coloraţi fără a produce compuşi secundari sau mai mulţi compuşi de derivatizare. Derivaţii proveniţi de la amine primare dau un produs albastru cu maximul de absorbţie la 570 nm, iar cei proveniţi de la amine secundare dau un compus brun cu maximul de absorbţie în jur de 440 nm.

Analiza aminoacizilor DERIVATIZARI IN VEDEREA OBTINERII UNEI SEPRARI MAI BUNE Scopul acestor derivatizari este de a obtine compusi volatili si termostabili in vederea analizei GC. Derivatizarea se realizeaza in doua etape: - esterificare cu alcooli acidulati cu HCl 3M, de exemplu: metanol, i-propanol, i- butanol, n-propanol, n-butanol si alcool i-amilic (gruparea COOH). - N-acilare – cu o anhidrida acida in mediu anhidru : anhidrida trifluoracetica, anhidrida pentafluoropropionica, N-tert(butildimetilsilil)trifluoracetamida (gruparea NH2).