Μικροβιολογικά Κριτήρια και Μέθοδοι Δειγματοληπτικού Ελέγχου των τροφίμων Δρ. Παναγιώτης Ν. Σκανδάμης Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθήνας Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων Εργαστήριο Ποιοτικού Ελέγχου και Υγιεινής Τροφίμων και Ποτών

Μικροβιολογικά Κριτήρια των Τροφίμων Κριτήριο: Μια προυπόθεση στην οποία μπορεί να βασιστεί μια κρίση ή μια απόφαση (NACMCF) Μικροβιολογικό κριτήριο: Καθορίζει την αποδοχή ή απόρριψη ενός προϊόντος ή μιας παρτίδας προϊόντων βάση της απουσίας/παρουσίας ή της συγκέντρωσης μικ/ων ή τοξινών ανά μάζα όγκο ή επιφάνεια δείγματος (ICMSF)

Μικροβιολογικά Κριτήρια των Τροφίμων Ένα Μικροβιολογικό κριτήριο πρέπει να αποτελείται από: Αναφορά σε συγκεκριμένο κίνδυνο των τροφίμων Μέθοδο ανάλυσης προσδιορισμού του κινδύνου Σχέδιο δειγματοληψίας που περιλαμβάνει Αριθμό δειγμάτων προς ανάλυση Κατάλληλα μικροβιολογικά όρια Αριθμό δειγμάτων που πρέπει να είναι μέσα στα όρια Ένα Μικροβιολογικό κριτήριο πρέπει επίσης να αναφέρεται: Στο τρόφιμα στο οποίο βρίσκει εφαρμογή Στο σημείο της τροφικής αλυσίδας στο οποίο βρίσκει εφαρμογή Στις διορθωτικές ενέργειες οι οποίες πρέπει να εφαρμόζονται σε περίπτωση μη συμφωνίας Τα Μικροβιολογικά κριτήρια θα πρέπει να καθορίζονται μόνο στην περίπτωση που είναι αναγκαία και η εφαρμογή τους είναι εφικτή

Κ.Ε.Π: Κατάλληλο επίπεδο προστασίας Α.Σ.Α.Τ.: Αντικειμενικός στόχος ασφάλειας τροφίμων

Νομοθετικό πλαίσιο Ορισμοί Εκτίμηση κινδύνου Στόχος Ασφάλειας Τροφίμου (ΣΑΤ): Η μέγιστη συχνότητα ή/και συγκέντρωση ενός επικίνδυνου παράγοντα (hazard) σε ένα τρόφιμο τη στιγμή της κατανάλωσης, το οποίο παρέχει η συμβάλλει στο κατάλληλο επίπεδο προστασίας (ΚΕΠ). Στόχος επίδοσης (ΣΕ): Η μέγιστη συχνότητα ή/και συγκέντρωση ενός επικίνδυνου παράγοντα σε ένα συγκεκριμένο σημείο της αλυσίδας παραγωγής τροφίμων πριν την κατανάλωση, η οποία εξασφαλίζει ή συμβάλλει σε ένα εφικτό ΣΑΤ ή ΚΕΠ. Κριτήριο επίδοσης (ΚΕδ) : Η μεταβολή στη συχνότητα ή/και συγκέντρωση ενός επικίνδυνου παράγοντα στο τρόφιμο που πρέπει να επέλθει από την εφαρμογή ενός ή περισσότερων μέτρων ελέγχου για την εξασφάλιση ενός ΣΕ ή ΣΑΤ. Επικοινωνιακή πολιτική κινδύνου Διαχείριση κινδύνου Σταθερότυποι Σχέδια δειγμ/ψίας Εφαρμογές Λογισμικά

Νομοθετικό πλαίσιο Ορισμοί Εκτίμηση κινδύνου Κριτήριο επεξεργασίας (ΚΕξ): Οι συνθήκες επεξερασίας που απαιτούνται για την επίτευξη ενός στόχου επίδοσης/κριτηρίου επίδοσης. Κριτήριο προϊόντος (ΚΠ): Τα χαρακτηριστικά του τροφίμου που πρέπει να διαμορφωθούν για την επίτευξη ή/και τη διατήρηση ενός ΣΕ/ΚΕδ/ΣΑΤ. Μικροβιολογικό κριτήριο (ΜΚ): Το επίπεδο ή/και η συχνότητα ενός επικύνδυνου παράγοντα που εντοπίζεται με συγκεκριμένη μέθοδο και σχέδιο δειγματοληψίας και το οποίο ικανοποιεί ένα ΣΕ/ΚΕδ. Κριτήρια αποδοχής Πρότυπο (Standard): υποχρεωτικό κριτήριο από το νόμο Κατεύθυνση (Guidelines): συμβουλευτικό κριτήριο Προδιαγραφές (Specifications): μέρος συμφωνίας μεταξύ προμηθευτή/αγοραστή Επικοινωνιακή πολιτική κινδύνου Διαχείριση κινδύνου Σταθερότυποι Σχέδια δειγμ/ψίας Εφαρμογές Λογισμικά

ΣΤΟΧΟΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ (ΣΑΤ) Νομοθετικό πλαίσιο Ορισμοί ΣΤΟΧΟΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ (ΣΑΤ) Εκτίμηση κινδύνου Ηο – ΣR + ΣΙεπ/ανάπτ.  ΣΑΤ Επικοινωνιακή πολιτική κινδύνου Διαχείριση κινδύνου Ηο: Αρχική επιμόλυνση ΣR: Συνολική μείωση ΣI: Συνολική αύξηση συμπεριλαμβανομένης (α) Επιμόλυνσης (β) Ανάπτυξης επικίνδυνου παράγοντα Σταθερότυποι Σχέδια δειγμ/ψίας Εφαρμογές Λογισμικά

Παράγοντες που σχετίζονται με τη δειγματοληψία Αντιπροσωπευτικότητα του δείγματος Τυχαία επιλογή Συχνότητα δειγματοληψίας Αριθμός δειγμάτων προς ανάλυση Πηγή δείγματος: π.χ πρώτη ύλη, επεξεργασία, τελικό προϊόν Χαρακτηριστικά δείγματος: ομοιογένεια, μέγεθος, υγρό, στερεό κ.λ.π Σχέδιο δειγματοληψίας

ΠΡΟΣΟΧΗ κατά τη δειγματοληψία Το δείγμα είναι αντιπροσωπευτικό της παρτίδας Το μέρος του δείγματος που αναλύεται αντιπροσωπεύει το δείγμα Οι μετρήσεις (π.χ ζύγιση) είναι ακριβείς Το δείγμα δεν υφίσταται κακομεταχείριση κατά τη συλλογή, μεταφορά, αποθήκευση και ανάλυση Εφαρμογή ασηπτικών τεχνικών κατά τη συλλογή, μεταφορά, αποθήκευση και ανάλυση Χρήση της κατάλληλης μεθόδου ανάλυσης Εκπαιδευμένο προσωπικό

Χειρισμός δειγμάτων Συλλογή και παράδοση των δειγμάτων προς ανάλυση με τέτοιο τρόπο ώστε να αποδεικνύεται ότι τα αποτελέσματα της ανάλυσης αντιπροσωπεύουν την κατάσταση της παρτίδας κατά τη στιγμή της δειγματοληψίας Χειρισμός δειγμάτων με τέτοιο τρόπο ώστε: Να αποφεύγεται η επιμόλυνση Να μην επιτρέπεται η ανάπτυξη ή μείωση των μικ/ων Δηλαδή έλεγχος θερμοκρασίας και άλλων παραμέτρων που επηρεάζουν την συμπεριφορά των μικ/ων, αποφυγή έκθεσης του δείγματος, του εξοπλισμού δειγματοληψίας και αποθήκευσης

Προσδιορισμός και Καταμέτρηση Μικ/ων Επιλεκτικός Προσδιορισμός μικροβιακού φορτίου Σύσταση υποστρώματος Επιλεκτικά συστατικά (π.χ αντιβιοτικά) Κατάλληλα θρεπτικά συστατικά Συνθήκες επώασης Θερμοκρασία Χρόνος Ατμόσφαιρα Εμπλουτισμός (Enrichment) Ανάνηψη τραυματισμένων κυττάρων Αύξηση πληθυσμού Ορισμένοι μικ/οί μπορεί να είναι ζωντανοί αλλά να μην είναι δυνατόν να αναπτυχθούν σε θρεπτικά υποστρώματα (π.χ Vibrio)

Προσδιορισμός Παθογόνων Μικ/ων στα Τρόφιμα Βασικά βήματα μεθόδων καλλιέργειας (παράδειγμα: Salmonella): Προ-εμπλουτισμός: πλούσιο/μη επιλεκτικό υγρό υπόστρωμα (24 hr) Εμπλουτισμός: Επιλεκτικό υγρό υπόστρωμα (24 hr) Απομόνωση κυττάρων σε επιλεκτικό στερεό υπόστρωμα-Άγαρ (24-48 h) Ταυτοποίηση/βιοχημικός χαρακτηρισμός (24-48 hr) Ορολογική επιβεβαίωση των στελεχών (24-72 hr)

Μέθοδοι Δειγματοληψίας Σχέδια δειγματοληψίας Η κατανομή των μικ/ων στα τρόφιμα δεν είναι ομοιογενή Η επιμόλυνση είναι μη προβλέψιμη Δεν είναι εφικτό να εξεταστεί όλη η ποσότητα μιας παρτίδας Απαιτείται μια στατιστική βάση για την αποδοχή ή την απόρριψη μιας παρτίδας Σχέδια δειγματοληψίας

DISTRIBUTION OF MICROORGANISMS J DISTRIBUTION OF MICROORGANISMS SOURCE: ICMSF/Flowers, 1999 Ομοιογενή Κατανομή Ανομοιογενή Κατανομή A B C

Καμία μεταβολή παράγοντα 15 Τάξεις κινδύνου ICMSF Επίπεδο επικίνδυνου παράγοντα Μείωση παράγοντα Καμία μεταβολή παράγοντα Αύξηση παράγοντα Πολύ μικρό (αλλοίωση) Τάξη 1 Τάξη 2 Τάξη 3 Δείκτης (Indicator) Τάξη 4 Τάξη 5 Τάξη 6 Μεσαίο (Moderate) Τάξη 7 Τάξη 8 Τάξη 9 Σοβαρό (serious) Τάξη 10 Τάξη 11 Τάξη 12 Πολύ σοβαρό (Severe) Τάξη 13 Τάξη 14 Τάξη 15

Σχέδια Δειγματοληψίας Σχέδια στηριζόμενα σε χαρακτηριστικές παραμέτρους-κριτήρια (attribute plans) Ποιοτικά (qualitative) αναλυτικά δεδομένα: Παρουσία/απουσία επικίνδυνου παράγοντα Ποσοτικά (quantitative) δεδομένα που έχουν ομαδοποιηθεί: <10 CFU/g, 10-100 CFU/g, >100 CFU/g (2) Σχέδια στηριζόμενα σε μεταβλητές (variables plans) Μη ομαδοποιημένα αναλυτικά δεδομένα Στηρίζονται σε υποθέσεις κατανομής του επικίνδυνου παράγοντα

Σχέδια Δειγματοληψίας Σχέδιο 2ης Τάξης Σχέδιο 3ης Τάξης

Σχέδια Δειγματοληψίας Σχέδιο 2ης Τάξης n = Αριθμός ανεξάρτητων και τυχαίων δειγμάτων προς ανάλυση m = οριακή τιμή (π.χ. CFU/g): ένα δείγμα χαρακτηρίζεται θετικό, αν το μικροβιολογικό του περιεχόμενο υπερβαίνει τη συγκεκριμένη τιμή c = Μέγιστος αποδεκτός αριθμός θετικών δειγμάτων (>m): (δειγμάτων με παρουσία επικίνδυνου παράγοντα ή δειγμάτων που υπερβαίνουν την τιμή m). Παράδειγμα: n = 5, m = 100, c = 2 Πρέπει να εξεταστούν 5 δείγματα για τον έλεγχο μιας παρτίδας Σε 5 δείγματα που εξετάζονται αν μέχρι 2 είναι θετικά (>100 CFU/g) η παρτίδα είναι αποδεκτή αν περισσότερα από 2 είναι θετικά η παρτίδα απορρίπτεται

Σχέδια Δειγματοληψίας Σχέδιο 3ης Τάξης n = Αριθμός δειγμάτων προς ανάλυση m = οριακή τιμή (π.χ. CFU/g): ένα δείγμα χαρακτηρίζεται θετικό, αν το μικροβιολογικό του περιεχόμενο υπερβαίνει τη συγκεκριμένη τιμή M = Μη αποδεκτό επίπεδο μικ/ων c = Μέγιστος αποδεκτός αριθμός δειγμάτων μεταξύ m και Μ Παράδειγμα: n = 10, c = 3, m = 10 CFU/g, M = 100 CFU/g Όλα τα δείματα 10 CFU/g = Αποδοχή παρτίδας 1 δείγμα 100 CFU/g = Απόρριψη παρτίδας 3 δείγματα 10 but 100 CFU/g = Αποδοχή παρτίδας 3 δείγματα 10 but 100 CFU/g = Απόρριψη παρτίδας

Σχέδια Δειγματοληψίας Τύπος Ανάλυσης = Παρουσία/Απουσία: Σχέδιο 2ης Τάξης Επιτρέπεται η παρουσία του παθογόνου στο τρόφιμο? Όχι: c = 0; n επιλέγεται βάση της επιθυμητής πιθανότητας Ναι: c  0; c και n επιλέγεται βάση της επιθυμητής πιθανότητας Τύπος Ανάλυσης = Καταμέτρηση Μικ/ων: Σχέδιο 3ης Τάξης m: επιτρεπτό επίπεδο μικ/ων M: μη επιτρεπτό επίπεδο μικ/ων c και n επιλέγεται βάση της επιθυμητής πιθανότητας

Η Χαρακτηριστική Καμπύλη Λειτουργίας Υπολογισμός πιθανότητας αποδοχής μίας παρτίδας για συγκεκριμένο ποσοστό ελαττωματικών δειγμάτων Έλεγχος αποτελεσματικότητας του σχεδίου δειγματοληψίας

Η Χαρακτηριστική Καμπύλη Λειτουργίας Σχέδια 2ης τάξης Η Πιθανότητα εξαρτάται από τα n και c. ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ n Σχέδια 3ης τάξης Η Πιθανότητα εξαρτάται από δύο ποσοτά: Οριακά αποδεκτά δείγματα m < X < M Ελαττωματικά δείγματα Χ > Μ ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ n, c

Η Χαρακτηριστική Καμπύλη Λειτουργίας 2η τάξη Η Χαρακτηριστική Καμπύλη Λειτουργίας 2η τάξη Σχέδιο 2ης τάξης 1.0 n = 10, c = 2 0.0 0.8 Pr = 0.32 0.2 0.6 0.4 Pr = Πιθανότητα απόρριψης παρτίδας Pa = Πιθανότητα αποδοχής παρτίδας 0.4 0.6 Pa = 0.68 0.2 0.8 0.0 1.0 10 20 30 40 50 60 p = % θετικά δείγματα στην παρτίδα J SOURCE: ICMSF W

Η Χαρακτηριστική Καμπύλη Λειτουργίας 2η τάξη Η Χαρακτηριστική Καμπύλη Λειτουργίας 2η τάξη Σχέδιο 2ης τάξης c = 0 1.0 0.0 0.8 0.2 0.6 0.4 n = 5 Pr = Πιθανότητα απόρριψης παρτίδας Pa = Πιθανότητα αποδοχής παρτίδας 0.4 0.6 n = 10 0.2 0.8 n = 30 0.0 1.0 10 20 30 40 50 60 p = % θετικά δείγματα στην παρτίδα J SOURCE: ICMSF W

Σχέδια δειγματοληψίας 2η τάξη

Σχέδια Δειγματοληψίας 2η τάξη Επιλογή του αριθμού των δειγμάτων προς ανάλυση n Η επιλογή του n γίνεται με βάση την αναμενόμενη παρουσία του κινδύνου στο τρόφιμο Υπολογισμός αριθμού δειγμάτων που απαιτούνται για τον προσδιοορισμό της παρουσίας μικ/ων με πιθανότητα 0.95 και 0.99* σε σχέση με την αναμενόμενη παρουσία Αναμενόμενο επίπεδο παρουσίας = 0.1% n = -ln (0.05)/(0.001) = 2,996 δείγματα n = -ln (0.01)/(0.001) = 4,605 δείγματα Αναμενόμενο επίπεδο παρουσίας = 1.0% n = -ln (0.05)/(0.01) = 300 δείγματα n = -ln (0.01)/(0.01) = 461 δείγματα Αναμενόμενο επίπεδο παρουσίας = 7.5% n = -ln (0.05)/(0.075) = 40 δείγματα n = -ln (0.01)/(0.075) = 61 δείγματα

Σχέδια Δειγματοληψίας 2η τάξη Δείγματα προς ανάλυση ανά παρτίδα Πιθανότητα αποδοχής μιας μη αποδεκτής παρτίδας: Δείγματα προς ανάλυση ανά παρτίδα Παρουσία Παθογόνου (%) 15 30 60 100 0.1 0.99 0.97 0.94 0.90 0.5 0.93 0.86 0.74 0.61 1 0.86 0.74 0.55 0.37 2 0.74 0.55 0.30 0.13 5 0.46 0.21 0.05 0.01

Σχέδια Δειγματοληψίας 3η τάξη

Σχέδια Δειγματοληψίας 3η τάξη

Σχέδια Δειγματοληψίας 3η τάξη

Πιθανότητα αποδοχής παρτίδας (Pa)– O ρόλος του c n=5, c=0 n=5, c=3 Σχέδια Δειγματοληψίας 3η τάξη Πιθανότητα αποδοχής παρτίδας (Pa)– O ρόλος του c 1 Pd = ελαττωματικών pm = οριακά αποδεκτών δειγμάτων n=5, c=0 1 Pd = ελαττωματικών pm = οριακά αποδεκτών δειγμάτων n=5, c=3 0.3 0.2 0.1 0.1 0.9 0.5

Σχέδια Δειγματοληψίας 3η τάξη 95% Αποδοχή 95% Απόρριψη

Σχέδια Δειγματοληψίας 3η τάξη Πιθανότητα αποδοχής παρτίδας (Pa)– Ο ρόλος του n 95% Αποδοχή 95% Απόρριψη

Σχέδια Δειγματοληψίας 3η τάξη Πιθανότητα αποδοχής (Pa) Pm % (οριακά αποδεκτά) m < X < M Pd % ελατ/κά 10 30 70 n=5 c=3 50 0.03 0.02 - n=10 40 0.01 20 0.33 0.31 0.04 0.1 0.05 1 0.97 0.47 0.99 0.65 c=1 0.29 0.13 0.07 0.92 0.53 0.74 0.15

Καμία μεταβολή παράγοντα 15 Τάξεις κινδύνου ICMSF Επίπεδο επικίνδυνου παράγοντα Μείωση παράγοντα Καμία μεταβολή παράγοντα Αύξηση παράγοντα Πολύ μικρό (αλλοίωση) Τάξη 1 Τάξη 2 Τάξη 3 Δείκτης (Indicator) Τάξη 4 Τάξη 5 Τάξη 6 Μεσαίο (Moderate) Τάξη 7 Τάξη 8 Τάξη 9 Σοβαρό (serious) Τάξη 10 Τάξη 11 Τάξη 12 Πολύ σοβαρό (Severe) Τάξη 13 Τάξη 14 Τάξη 15

Υποθετικά παραδείγματα απόρριψης με βάση την σοβαρότητα του επικίνδυνου παράγοντα – 2η τάξη

Υποθετικά παραδείγματα αποδοχής με βάση την σοβαρότητα του επικίνδυνου παράγοντα – 2η τάξη

Υποθετικά παραδείγματα απόρριψης με βάση την σοβαρότητα του επικίνδυνου παράγοντα – 3η τάξη

Υποθετικά παραδείγματα αποδοχής με βάση την σοβαρότητα του επικίνδυνου παράγοντα – 3η τάξη

2.Αποξηρα-μένα μανιτάρια Salmonella 2 - ΠΙΝΑΚΑΣ: Σχέδιο δειγματοληψίας με συντήρηση υπό κατάψυξη και παρουσίαση των μικροβιολογικών ορίων ΠΡΩΤΕΣ ΥΛΕΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΤΑΞΗ n c m M 1.Ακατέργα-στα υλικά E. coli 4 3 5 <3 10 2.Αποξηρα-μένα μανιτάρια Salmonella 2 - 3.Μαλακό τυρί L. monocytogenes S. aureus 13 7 15 03 100

2.Αποξηρα-μένα μανιτάρια Salmonella 12 2 20 - ΠΙΝΑΚΑΣ : Σχέδιο δειγματοληψίας για το προϊόν με συντήρηση υπό ψύξη (με αυξημένο βαθμό ανησυχίας) και παρουσίαση των μικροβιολογικών ορίων. ΠΡΩΤΕΣ ΥΛΕΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΚΑΤΗΓΟΡΙΑ ΤΑΞΗ n c m M 1.Ακατέργα-στα υλικά E. coli 6 3 5 1 <3 10 2.Αποξηρα-μένα μανιτάρια Salmonella 12 2 20 - 3.Μαλακό τυρί L. monocytogenes S. aureus 15 9 60 01 100

Κανονισμός 2073/2005 Μικροβιολογικά κριτήρια στα τρόφιμα Κατάλληλο επίπεδο προστασίας (Appropriate Level of Protection) Αντικειμενικοί στόχοι ασφάλειας τροφίμων (Food Safety Objectives)

Κ.Ε.Π: Κατάλληλο επίπεδο προστασίας Α.Σ.Α.Τ.: Αντικειμενικός στόχος ασφάλειας τροφίμων

Βιβλιογραφία ΙCMSF (1986) Microorganisms in Food 2: Sampling for microbiological analysis: Principles and specific applications ICMSF (1988) Microorganisms in Food 4: Applications of the HACCP system to ensure microbiological safety and quality ICMSF (1996) Microorganisms in Food 5: Characteristics of Microbial Pathogens Bad Bug Book: http/vm.cfsan.fda.goc/-mow/intro.htlm Δρ. Ιωάννης Τσιλφίδης