ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ NUCKS ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΕΜΒΡΥÏΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΟΥ ΑΡΟΥΡΑΙΟΥ Παύλου Μ1, Δρόσος Γ1, Γεωργούλης Αν2, Χαβάκη Σ2, Østvold AC3, Παταργιάς Θ1, Κίττας Χρ2, Μαρίνος Ε2, Κουλούκουσα Μ2, Κόλλια Π1, Αλεπόρου-Μαρίνου B1 1Πανεπιστήμιο Αθηνών, Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Γενετικής και Βιοτεχνολογίας, 2Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ιατρική Σχολή, Εργαστήριο Ιστολογίας και Εμβρυολογίας , 3University of Oslo, Norway, Department of Medical Biochemistry, Institute Group of Basic Medical Science Εισαγωγή Η NUCKS είναι μία πυρηνική πρωτεΐνη που προσδένεται στο DNA και αποτελεί υπόστρωμα για πολλές κινάσες του κυτταρικού κύκλου Ο ακριβής ρόλος της NUCKS δεν είναι γνωστός, αλλά πολλά δεδομένα υποστηρίζουν ότι εμπλέκεται στη διαδικασία της κυτταρικής διαίρεσης Το γονίδιό της εμφανίζει τα χαρακτηριστικά ενός γονιδίου αναφοράς και εκφράζεται σε όλους τους ιστούς των σπονδυλοζώων Έχει κοινά χαρακτηριστικά με κάποιες από τις οικογένειες των HMGs πρωτεϊνών χωρίς να κατατάσσεται σε κάποια από αυτές Ενώ δεν ανιχνεύεται στα αγονιμοποίητα και γονιμοποιημένα ωάρια, η έκφρασή της ξεκινάει από το στάδιο των 2-κυττάρων στον ποντικό (Mus musculus) Υπάρχουν ενδείξεις αυξημένης έκφρασης της NUCKS στην απόπτωση που επάγεται από βλάβες στο DNA

Σκοπός της εργασίας ήταν η μελέτη των επιπέδων της NUCKS κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και διαφοροποίηση και η πιθανή συσχέτιση της έκφρασής της με την απόπτωση που συμβαίνει στα πλαίσια του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Υλικά και Μέθοδοι Απομονώθηκαν έμβρυα από εγκυμονούντα θηλυκά αρουραίων Wistar, από τις εμβρυϊκές ημέρες 13,5 έως και 18,5 μετά τη γονιμοποίηση (post conception, p.c.). Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τόσο ολόκληρα έμβρυα όσο και συγκεκριμένοι ιστοί, (εγκέφαλος, άκρα, ήπαρ). Reverse Transcription PCR: Για τη σύνθεση cDNA χρησιμοποιήθηκαν 3μg ολικού RNA από κάθε ιστό και η M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε αντίδραση PCR με τους εκκινητές για τα γονίδια NUCKS, GAPDH, Bcl-2 και Bax. Μονιμοποίηση και έγκλειση σε παραφίνη: Τα έμβρυα 13,5 εως 18,5 ημερών p.c. μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη και πραγματοποιήθηκε λήψη τομών πάχους 5μm για ανοσοεντοπισμό και 7μm για in situ υβριδισμό. Ανοσοϊστοχημεία για την πρωτεΐνη NUCKS: Οι τομές παραφίνης επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα εναντίον της NUCKS, με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση και ως χρωμογόνο χρησιμοποιήθηκε το αντιδραστήριο DAB. In situ υβριδισμός: Τo προϊόν της PCR από τους εκκινητές για το γονίδιο της NUCKS (350bp) κλωνοποιήθηκε σε κατάλληλο πλασμίδιο και παράχθηκαν DIG-σημασμένοι RNA ιχνηθέτες. Οι τομές παραφίνης επωάστηκαν με τους DIG-σημασμένους ιχνηθέτες (probes). Τα υβρίδια NUCKS mRNA-RNA ιχνηθέτες, εντοπίστηκαν τόσο με anti-DIG αντίσωμα συνδεδεμένο με αλκαλική φωσφατάση και ΝΒΤ ως χρωμογόνο (Chromogenic In Situ Hybridizatio, CISH), όσο και με αντίσωμα συνδεδεμένο με το φθοριόχρωμα FITC (Fluorescent In Situ Hybridization, FISH).

Νευροεπιθήλιο μεσεγκεφάλου (Ε 14,5 p.c.) IHC, X200 FISH, X200 FISH, X400 Νευροεπιθήλιο μεσεγκεφάλου (Ε 14,5 p.c.) IHC, X200 IHC, X400 FISH, X200 Νευροεπιθήλιο νευρικού σωλήνα (E 14,5 p.c.) CISH, X100 CISH, X200 IHC, X200 Χοριοειδές πλέγμα που διαφοροποιείται από την 4η κοιλία (E 15,5 p.c.)

Συζήτηση-Συμπεράσματα Από τα πειράματα ανοσοεντοπισμού και in situ υβριδισμού φαίνεται ότι τόσο το mRNA της NUCKS όσο και η πρωτεΐνη, βρίσκονται σε υψηλά επίπεδα σε νευρικά και νευροεπιθηλιακά κύτταρα. Ακόμα, φαίνεται ότι η έκφραση της NUCKS είναι υψηλή σε αδιαφοροποίητα μεσεγχυματικά κύτταρα. Από τα πειράματα RT PCR προκύπτει ότι η έκφραση του γονιδίου της NUCKS είναι αυξημένη στα αρχικά στάδια οργανογένεσης, στους ιστούς που μελετήθηκαν, και σταδιακά μειώνεται καθώς ολοκληρώνεται η εμβρυϊκή ανάπτυξη. Η έκφραση της NUCKS φαίνεται να σχετίζεται με τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο που συμβαίνει στον εγκέφαλο, τα άκρα και το ήπαρ, όπως προκύπτει από τον λόγο Bax mRNA/Bcl mRNA στους αντίστοιχους ιστούς. Από τα πειραματικά αποτελέσματα προκύπτει ότι πιθανόν η NUCKS εμπλέκεται με κάποιο τρόπο στην διαφοροποίηση κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και ειδικότερα στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος. Δεδομένου ότι οι φυσικοχημικές ιδιότητες της πρωτεΐνης NUCKS προσομοιάζουν αυτές των HMG πρωτεϊνών, οι οποίες είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην διαφοροποίηση κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, τα πειραματικά μας αποτελέσματα ενισχύουν τη σχέση της NUCKS με τις HMG πρωτεΐνες.