ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ 5 / 17-10-2011 Ι.Κ.ΑΓΓΕΛΗ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΤΙΓΟΝΑ: αναγνώριση από υποδοχέα Β ή από υποδοχέα Τ + ΜΗC μόρια Β-κύτταρο + αντιγόνο Τ-κύτταρο + αντιγόνο Εκτελεστικό Β-κύτταρο Β-κύτταρο μνήμης Εκτελεστικό Τ-κύτταρο Τ-κύτταρο μνήμης πλασματοκύτταρο CTL, Th, κλπ (εκκρίνουν κυτταροκίνες & κυτταροτοξικούς παράγοντες) (εκκρίνει αντισώματα)

Αλληλεπίδραση αντισώματος-αντιγόνου Είδη επιτόπων: πολλαπλοί επίτοποι στο ίδιο αντιγόνο ανοσοεπικρατούντες ή κυρίαρχοι μη αλληλοεπικαλυπτόμενοι αλληλοεπικαλυπτόμενοι γραμμικοί ή συνεχείς διαμορφωτικοί κρυπτικοί Αλληλεπίδραση αντισώματος-αντιγόνου μτβλ περιοχή ελαφριάς αλυσίδας μτβλ περιοχή βαριάς αλυσίδας αντιγόνο 15-22 αμινοξέα του ag συνδέονται με το ab σύνδεση με δεσμούς Η+, ιοντικές και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, van der Walls

ΤΥΠΟΙ ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ ΤΥΠΟΙ ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ Αντιδράσεις καθίζησης (κατακρήμνισης) σε υγρό μέσο σε πήκτωμα Αντιδράσεις συγκόλλησης (σχηματισμός κροκίδων) άμεση έμμεση ή παθητική ανασταλτική Αντιδράσεις με τη χρησιμοποίηση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος RIA ELISA-ELISPOT Western blotting Ανοσοφθορισμός-Κυτταρομετρία ροής Αντιδράσεις του συμπληρώματος Μέθοδοι προσδιορισμού των HLA αντιγόνων

ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ μονοκλωνικά, πολυκλωνικά αντισώματα ανασυνδυασμένα πεπτίδια Ag, Ab, συνδυασμένα Ag/Ab Ευχρηστία Αυτοματισμό αυξημένη ευαισθησία αυξημένη ειδικότητα αυξημένη αξιοπιστία σε όλα τα επίπεδα Η ανάπτυξη και η αναβάθμιση του υλικο-τεχνικού εξοπλισμού: - Μηχανικές, ηλεκτρονικές, μεγάλης ακρίβειας αναλώσιμου ρύγχους, (πολυκάναλες ή μη) πιπέτες - Ανοικτά ανοσολογικά συστήματα (robotic pippeting, washer, reader) - Αυτόματα ανοσολογικά συστήματα (combining incubation, washing and reading) Πλήρως αυτοματοποιημένα συστήματα Μεγάλος αριθμός δειγμάτων Ασφάλεια και Ακρίβεια Επαναληψιμότητα και αξιοπιστία Εκτυπώσιμα αποτελέσματα Επεξεργασία αποτελεσμάτων Ηλεκτρονική μεταφορά δεδομένων

ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ Δοκιμασία Ευαισθησία (μg Ab/ml) Κατακρήμνιση σε διάλυμα 20-200 Κατακρήμνιση σε πήκτωμα Μancini Ouchterlony   10-50 Ανοσοηλεκτροφόρηση Rocket ηλεκτροφόρηση 2 Αντιδράσεις συγκόλλησης Άμεση Παθητική Ανασταλτική 0.3 0.006-0.06 RIA 0.0006-0.006 ELISA ELISA με χημειοφωταύγεια ~0.0001-0.01 ~0.00001-0.01 Ανοσοφθορισμός 1 Κυτταρομετρία ροής

ΤΥΠΟΙ ΑΝTIΔΡΑΣΕΩΝ ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗΣ σε υγρό μέσο σε πήκτωμα απλή ανοσοδιάχυση (προς μία κατεύθυνση) διπλή ανοσοδιάχυση (προς μία κατεύθυνση) διπλή ανοσοδιάχυση (προς δύο κατευθύνσεις-Ouchterlony) κυκλοτερής ή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (Mancini) ανοσοηλεκτροφόρηση-ηλεκτροφόρηση rocket

ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΙΖΗΜΑΤΟΣ-ΖΩΝΗ ΙΣΟΔΥΝΑΜΙΑΣ ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ Mancini Ouchterlony

ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ Mancini Ouchterlony σχμ δακτυλίου σχμ τόξων κατακρήμνισης

διαχωρισμός αντιγόνων, αντιορός στην αύλακα, διάχυση κ’ κατακρήμνιση ΑΝΟΣΟΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες αποτελούνται από βαριές και/ ή ελαφρές αλυσίδες ( 5 κατηγορίες βαριών: γ στην IgG, α στην IgA, μ στη IgM, δ στη IgD και ε στην IgΕ). Ελαφριές αλυσίδες κ & λ. Ανοσοηλεκτροφόρηση = ποιοτική μέθοδος [συνδυασμός ηλεκτροφόρησης και ανοσοδιάχυσης] = πρωτεΐνες διαχωρίζονται ~ φορτίο σε γέλη αγαρόζης, ακολουθεί ταυτοποίηση μέσω ανοσοκατακρήμνισης με αντιορούς (ταυτοποίηση μονοκλωνικής πρωτεΐνης και καθορισμός του τύπου των ελαφριών και βαριών αλυσίδων) Μονοκλωνικές ελαφριές αλυσίδες - νεφρική ανεπάρκεια, εναπόθεση ινιδίων αμυλοειδούς κ καταστροφή στα εγγύς σωληνάρια ή στο σπείραμα  ιζηματική νόσο ελαφρών αλυσίδων. Το 90% των ασθενών με πολλαπλούν μυέλωμα εμφανίζουν μονοκλωνική πρωτεΐνη στον ορό ή στα ούρα κατά τη διάγνωση. Τμήματα βαριών αλυσίδων καθώς και ελεύθερες ελαφριές αλυσίδες παρατηρούνται στα ούρα ασθενών με πολλαπλούν μυέλωμα ή αμυλοείδωση. Οι ανοσοσφαιρίνες IgD και IgΕ δε μπορούν να ανιχνευθούν γιατί βρίσκονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις και δε σχηματίζουν ίζημα. διαχωρισμός αντιγόνων, αντιορός στην αύλακα, διάχυση κ’ κατακρήμνιση

ROCKET ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ κωνοειδής ηλεκτροφόρηση: ποσοτικός προσδιορισμός αντιγόνων (κώνοι κατακρήμνισης) pH  ab ακίνητο + ag φορτίζεται (-) Κωνοειδείς κατακρημνίσεις με ύψος ~ [ag] {ab >>>> ισοηλ. σημείο /// αλκαλικό pH ab-ουδέτερο vs. αg (-) }

ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ Ανοσοκαθήλωση = ποιοτική μέθοδος (50 φορές πιο ευαίσθητη vs ανοσοηλεκτροφόρηση). Διαχωρισμός πρωτεϊνών ~ φορτίο σε γέλη αγαρόζης & ταυτοποίηση ανοσοκαθήλωσης χρησιμοποιώντας ειδικούς μονοδύναμους αντιορούς  επιτυγχάνεται η ταυτοποίηση της μονοκλωνικής πρωτεΐνης και ο καθορισμός του τύπου των ελαφριών και βαριών αλυσίδων. Η μέθοδος αυτή ενδείκνυται ιδιαίτερα σε περιπτώσεις που πρέπει να ανιχνευθούν εξαιρετικά χαμηλές συγκεντρώσεις ανοσοσφαιρινών όπως για παράδειγμα σε μυέλωμα Bence Jones τύπου IgD και IgE, σε αμυλοείδωση, μονήρες πλασμοκύττωμα καθώς και στη διάγνωση υποτροπών μετά από μεταμόσχευση μυελού των οστών. Η ανοσοκαθήλωση είναι ταχύτερη, πιο ευαίσθητη και ευκολότερη στην ερμηνεία από την ανοσοηλεκτροφόρηση. Αντιθέτως, η ανοσοηλεκτροφόρηση είναι ευκολότερη από τεχνικής άποψης και λιγότερο δαπανηρή από την ανοσοκαθήλωση. Η υψηλή αναλυτική ευαισθησία της ανοσοκαθήλωσης έχει ως αποτέλεσμα να ανιχνεύεται υψηλότερο ποσοστό κλινικά ασχέτων ευρημάτων τα οποία μπορεί να οδηγήσουν σε επιπλέον διαγνωστική διερεύνηση. Ανοσοκαθήλωση ορού ασθενούς με μυέλωμα τύπου IgM λ

Κλινική Χρησιμότητα Μεταβολές Μακροσφαιριναιμία Waldenstrom • Ανίχνευση δικλωνικής γαμμοπάθειας • Επιτρέπει τη διαφορική διάγνωση μεταξύ μονοκλωνικής, δικλωνικής και ολιγοκλωνικής γαμμοπάθειας • Επιτρέπει την ανίχνευση ανοσοσφαιρινών που βρίσκονται σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις στον ορό Μεταβολές • Πολλαπλούν μυέλωμα • Μακροσφαιριναιμία του Waldenström • Αμυλοείδωση • Λεμφοϋπερπλαστικές νόσοι

ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ ΠΡΩΤΕϊΝΩΝ ΟΡΟΥ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΠΟΛΛΑΠΛΟΥΝ ΜΥΕΛΩΜΑ (ΜΟΝΟΚΛΩΝΙΚΕΣ ΓΑΜΜΑΠΑΘΕΙΕΣ) δικλωνικές

ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ (σχμ κροκίδων) ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ (σχμ κροκίδων) ΑΝΤΙΣΩΜΑ ΜΕ ΜΕΓΑΛΥΤΕΡΗ ΙΣΧΥ ΣΥΝΔΕΣΗΣ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΙΣ ΑΠΩΘΗΤΙΚΕΣ ΔΥΝΑΜΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΚΑΤΑΛΛΗΛΗ ΑΝΑΛΟΓΙΑ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΛΥΤΗ Τύποι αντιδράσεων άμεση συγκόλληση (πχ. ομάδες αίματος) έμμεση ή παθητική συγκόλληση (για διαλυτά Αg, με σωματίδια latex, πχ. μέθοδος Coombs) ανασταλτική συγκόλληση (πχ. test εγκυμοσύνης, ένδειξη/ανίχνευση χρήσης απαγορευμένων ουσιών [κοκαΐνης, ηρωίνης])

COOMBS Π.χ. αιμολυτική αναιμία Π.χ. μεταγγίσεις

ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ ανίχνευση ερυθροποιητίνης [ολυμπιάδα 2004]

ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΕΠΙΣΗΜΑΣΜΕΝΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ Η΄ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΕΠΙΣΗΜΑΣΜΕΝΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ Η΄ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ Η επισήμανση γίνεται με μόρια που επιτρέπουν την εύκολη ανίχνευση και μέτρησή τους [RIA, ELISA – ELISPOT, ανοσοστύπωμα Western, ανoσοφθορισμός – κυτταρομετρία ροής ] ΜΕΘΟΔΟΣ RIA (radioimmunoassay) 1950: Rosalyn Yalow, Solomon Aaron Berson (Bronx Veterans Administration Hospital / Mount Sinai School of Medicine) 1977 Rosalyn ! Nobel Prize Ιατρικής (RIA ινσουλίνης) Γνωστή ποσότητα αντιγόνου καθίσταται ραδιενεργή (ιώδιο σε κατάλοιπα τυροσίνης) Ακολουθεί ανάμιξη με κατάλληλο αντίσωμα  σύμπλοκο Προστίθεται δείγμα ορού (κρύο αντιγόνο) και αντικαθιστά το ραδιενεργό Μέτρηση ελεύθερου αντιγόνου στο υπερκείμενο

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) με αντίσωμα

ELISPOT ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ WESTERN Πήκτωμα επιστοίβαξης (ακρυλαμίδη) pH 6.8 συγκέντρωση των πρωτεϊνών σε μια γραμμή εκκίνησης Πήκτωμα διαχωρισμού pH 8.8 διαχωρισμός πρωτεϊνών ανάλογα με το ΜΒ τους και τη δομή τους SDS-PAGE ανίχνευση ενεργοποιημένων κυττάρων (ανσ-θεραπείας π.χ. αντικαρκινικό εμβόλιο προσδιορισμός βελτιωμένης αντιγονοπαρουσίασης-έκκρισης ιντφν-γ) αναγωγή στο σύνολο των κυττάρων που εξετάστηκαν

ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ WESTERN Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και Φίλτρο νιτροκυτταρίνης όπου έχουν μεταφερθεί οι πρωτεΐνες Ανίχνευση της πρωτεΐνης Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και δέσμευσή του με το αντιγόνο Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και δέσμευσή του με το αντιγόνο Επώαση με το δεύτερο αντίσωμα (συζευγμένο) HRP H2O2 + DAB/luminol +

ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ

ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ εναιώρημα ζωντανών κυττάρων + φθορισμο-ενεργοποιούμενος διαλογέας κυττάρων (FACS)  μέτρηση έντασης φθορισμού & διαχωρισμός κυτταρικών πληθυσμών ~ επιφανειακά αντιγόνα

ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 1. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ~ ΦΟΡΤΙΟ [ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΗ ΕΣΤΙΑΣΗ] ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ~ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΑΖΑ ΠΕΔΙΟ ΥΨΗΛΗΣ ΤΑΣΗΣ  ΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΣΤΑΘΕΡΗΣ ΚΛΙΣΗΣ pH ΚΑΙ ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΣΤΟ ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΤΟΥΣ ΣΗΜΕΙΟ

ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ Προϋποθέσεις: ανιχνεύει Ab στον ορό το σύμπλεγμα Ag-Ab που καταναλώνει το συμπλήρωμα δεν είναι ορατό χρειάζεται δείκτης = αιμολυτικό σύστημα Αιμολυτικό σύστημα = ερυθρά αιμοσφαίρια προβάτου (Ag) και ορός ζώου που περιέχει Ab έναντι των ερυθρών αιμοσφαιρίων του προβάτου ΠΡΟΣΟΧΗ: θετική είναι η αντίδραση που δε δίνει αιμόλυση

ΑΙΜΟΛΥΤΙΚΟ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ HLA ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ Προϋποθέσεις: Τ λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης Ι) και Β λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης ΙΙ) πολυκλωνικοί ή μονοκλωνικοί αντι-HLA αντιοροί Μέθοδοι που χρησιμοποιούνται: μικρολεμφοκυτταρική δοκιμασία (ορολογική τυποποίηση) μοριακές μέθοδοι (PCR) μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση (MLR)