Εργαστηριακή διερεύνηση αυτοάνοσων νοσημάτων Αρχές μεθόδων-Εφαρμογές

Παρουσίαση με θέμα: "Εργαστηριακή διερεύνηση αυτοάνοσων νοσημάτων Αρχές μεθόδων-Εφαρμογές"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Εργαστηριακή διερεύνηση αυτοάνοσων νοσημάτων Αρχές μεθόδων-Εφαρμογές
Κατερίνα Αναστασίου -Γιώργος Παπαδόπουλος Ειδικευόμενοι βιοπαθολoγίας Γ.Ν.Θ. «Άγιος Παύλος» Συντονίστρια: Αναστασία Βακαλούδη

2 Βασική αρχή ανοσολογικών αντιδράσεων
Σύνδεση αντιγόνου- αντισώματος Διάγνωση ευρέως φάσματος νοσημάτων: Λοιμωδών Αιμολυτικών Αυτοάνοσων Νεοπλασματικών Ανοσοανεπαρκειών Διαπίστωση ιστοσυμβατότητας κ.τ.λ. Ορατή Μη ορατή

3 Ανοσολογικές μέθοδοι Περιεχόμενα
Κύριες μέθοδοι στην εργαστηριακή διερεύνηση των αυτοάνοσων νοσημάτων Aνοσοδιάχυση Συγκόλληση Ηλεκτροφόρηση Θολωσιμετρία Νεφελομετρία Χρωματογραφία Δεσμευτικές ανοσομέθοδοι -Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι (RIA-ΙRMA) -Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (EIA-ELISA) -Χημειοφωταύγεια (CHIA) -Ανοσοφθορισμός (ΙFA) Μέθοδοι προσδιορισμού HLA Κυτταρομετρία ροής

4 Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης
Αρχή μεθόδου Σχέση συγκέντρωσης Ag και Ab με το σχηματισθέν ίζημα Ag+Ab Ημίρρευστο υλικό ↑ Ab ↑ Ag Γραμμή καθίζησης Χρωστική Σχηματισθέν ίζημα Πιο εμφανής γραμμή καθίζησης Ποσοτικές-Ποιοτικές Συγκέντρωση Ag

5 Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης
Ποιοτικές Ποσοτικές Διπλή ανοσοδιάχυση (πηκτή) Μονή ανοσοδιάχυση (υγρό μέσο ή πηκτή) Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση (πηκτή) Ηλετροανο-σομέτρηση (πηκτή)

6 Ποιοτικές Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης
Διπλή διάχυση προς δύο κατευθύνσεις (Ouchterlony) Γραμμή καθίζησης Άγαρ Διάλυμα αντισώματος Διάλυμα αντιγόνου

7 Ποσοτικές Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης
Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση (Mancini) Εξεταζόμενος ορός Άγαρ με ενσωματωμένο αντι-IgG,A,M αντίσωμα (αντιορό) (1,2,3,4) ορός γνωστής συγκέντρωσης IgG,A,M Διάμετρος δακτυλίου Συγκέντρωση αντιγόνου (IgG,A,M) Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση σε πλάκα

8 Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης Εφαρμογές
Προσδιορισμός : CRP Ανοσοσφαιρινών αντι-ΕΝΑ Παραγόντων του συμπληρώματος Διάφορων πρωτεϊνών πλάσματος διαγνωστικής σημασίας κ.α.

9 Μέθοδοι συγκόλλησης Άμεσες Έμμεσες ή παθητικές
Σωματιδιακό αντιγόνο + ομόλογο αντίσωμα → κροκίδες (συγκόλληση) Άμεσες Έμμεσες ή παθητικές Προσροφημένο αντιγόνο Φυσικό επιφανειακό αντιγόνο Κύτταρο ή Σωματίδιο Latex Κύτταρο Εφαρμογές: Ερυθρά αιμοσφαίρια → Παθητική αιμοσυγκόλληση Σωματίδια Latex → Συγκόλληση Latex

10 Ερμηνεία συγκολλητινοαντίδρασης
Σχηματισμός δικτυωτού πλέγματος Αντιγονικές καθοριστικές ομάδες Fc τμήμα Ab Fab τμήμα Ab Fc τμήμα Ab Fab τμήμα Ab Προϋποθέσεις: Ικανή ισχύ Ab, σωστή αναλογία Ag/Ab, παρουσία ηλεκτρολύτη, κατάλληλη θερμοκρασία.

11 Ερυθρά με προσροφημένο Ag
Μέθοδοι συγκόλλησης Έμμεση αιμοσυγκόλληση Ερυθρά με προσροφημένο Ag + Αb Συγκόλληση ερυθρών Rose-Waaler test

12 Μέθοδοι συγκόλλησης Συγκόλληση Latex
Μέθοδος έμμεσης (παθητικής) συγκόλλησης Σωματίδιο Latex: Σωματίδιο πολυστυρενίου πάνω στο οποίο έχουν προσροφηθεί μόρια αντιγόνου Σχηματική απεικόνιση συγκόλλησης Latex Σωματίδια Latex Ag Latex με αντιγόνο Latex με αντιγόνο Συγκόλληση Latex Αb

13 Μέθοδοι συγκόλλησης Άμεση Coombs
Ερυθρά με προσκολλημένα IgG αντισώματα Αντι-IgG (αντι- ανθρώπινη γ-σφαιρίνη) Συγκόλληση

14 Μέθοδοι συγκόλλησης Έμμεση Coombs 1ο Στάδιο 2ο Στάδιο + + Φυσιολογικά
ερυθρά Ορός αίματος με IgG Ab Προσκόλληση IgG στα ερυθρά Αντι-IgG (αντι-ανθρώπινη γ-σφαιρίνη) Συγκόλληση

15 Μέθοδοι συγκόλλησης Πλεονεκτήματα-Μειονεκτήματα-Εφαρμογές
Γίνονται σε πλάκα ή δοκιμαστικά σωληνάρια και είναι ποιοτικές ή ημιποσοτικές (τίτλος Ab). Απλότητα, ευκολία, ταχύτητα, μικρό κόστος, μεγάλη ευαισθησία και ποικιλία αντισωμάτων προς ανίχνευση. Εφαρμογές Ποιοτικό και ημιποσοτικό προσδιορισμό CRP, RF, anti-DNA , αντισώματα κατά φωσφολιπιδίων (αLP) κ.α. Μειονεκτήματα Μη ειδικές συγκολλήσεις, δυσκολίες στην ανεύρεση και συντήρηση ερυθρών αιμοσφαιρίων, φαινόμενο προζώνης. Διάγνωση της αυτοάνοσης αιμολυτικής αναιμίας.

16 Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης
Φυσικοχημική μέθοδος διαχωρισμού πρωτεϊνών Αρχή μεθόδου Διαχωρισμός πρωτεϊνών με βάση τη διαφορετική (λόγω ΜΒ και φορτίου) κινητικότητα των μορίων εντός κατάλληλου υλικού, κατά την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου Υπεργαμμασφαιριναιμία Οξείες, χρόνιες λοιμώξεις Χρόνιες φλεγμονώδης παθήσεις Νεοπλάσματα Αυτοάνοσα νοσήματα

17 Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης
Ηλεκτροφόρηση ζώνης Ηλεκτροφόρηση εντός αγαρόζης ή οξικής κυτταρίνης PAGE (polycrilamide gel electroforesis) Ηλεκτροφόρηση σε gel πολυακρυλαμιδίου (μοριακό διαχωριστικό μέσο) → αύξηση διαχωριστικής ικανότητας

18 Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης
SDS (sulfo dodegylic sodium) Δωδεκυλικό Na → εκδίπλωση πρωτεϊνών, σταθερή αναλογία φορτίου/μάζας→ κίνηση μορίων αντιστρόφως ανάλογη του ΜΒ SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση Συνδυασμός SDS και PAGE ηλεκτροφόρησης

19 Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης Ανοσοηλεκτροφόρηση
Αρχή μεθόδου Ορός Αγαρόζη Ηλεκτροφόρηση Διαχωρισμός πρωτεϊνών ορού Διαδρομή ορού Αυλάκι Αντίσωμα (Αντιορός) Επώαση Ηλεκτροφόρηση + Διπλή ανοσοδιάχυση Διάχυση αντοορού Διάχυση πρωτεΐνης Τόξο καθίζησης

20 Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης Ανοσοηλεκτροφόρηση
Ανοσοηλεκτροφορήματα Τόξο καθίζησης φυσιολογικής πρωτεΐνης Τόξο καθίζησης μονοκλωνικής πρωτεΐνης (ανώμαλη πάχυνση ή κύρτωση) Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης

21 Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης Ανοσοκαθήλωση
Αρχή μεθόδου Ηλεκτροφόρηση του προς μελέτη ορού Ανοσοκαθήλωση φυσιολογικού ορού Επίστρωση αντιορού σ’ όλη την επιφάνεια ηλεκτροφόρησης Επώαση Χρωστική Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης Δημιουργία ζώνης καθίζησης

22 Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης Ανοσοκαθήλωση
Εφαρμογές Κρυοσφαιρίνες ds DNA Μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες (ΡΑ, ΣΕΛ, σύνδρομο Sjögren) κ.α Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης

23 Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης
Μιας διάστασης διπλή ηλεκτροανοσοδιάχυση (counter ηλεκτροφόρηση) Μιας διάστασης μονή ηλεκτροανοσοδιάχυση (rocket ηλεκτροφόρηση, τεχνική Laurell) Ανοσοαποτύπωση (Western blotting)

24 Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης Ανοσοαποτύπωση (Western blot)
Αρχή μεθόδου Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός βάσει ΜΒ σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση) Μεταφορά σε ΝΚ με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου Επώαση με Αb Επώαση με αντι-Αb ιχνηθετημένο Ακολουθεί ανίχνευση Ενζυμοανοσολογικά Ραδιοϊσοτοπικά Με χημειοφωταύγεια

25 Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης Ανοσοαποτύπωση (Western blot)
Εφαρμογές ENA (Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl70, Jo1, CENP κ.α.), dsDNA, AMA, αντι- CCP, κ.α. Ιστόνες (Η1, Η2Α, Η2Β, Η3, Η4) κ.α. Προσδιορισμός κρυοσφαιρινών Πολυπεπτίδια σύνθετων Ag (Β΄,Β, D του Sm), (70kD, A, C του RNP) Πολλά ταυτόχρονα Aabs και πολυπεπτίδια κ.α

26 Θολωσιμετρία Μέτρηση της απορρόφησης της ακτινοβολίας, που προκύπτει όταν δέσμη φωτός προσπίπτει σε σωματίδια μεγάλης διαμέτρου (συμπλέγματα μορίων με σωματίδια Latex, ανοσοσυμπλέγματα)

27 Νεφελομετρία Μέτρηση της έντασης της σκέδασης, που προκύπτει όταν δέσμη φωτός προσπίπτει σε σωματίδια μεγάλης διαμέτρου (συμπλέγματα μορίων με σωματίδια Latex, ανοσοσυμπλέγματα)

28 Νεφελομετρία Πλεονεκτήματα-Μειονεκτήματα Εφαρμογές
Ακριβής,ταχεία, εύκολη Καλή ευαισθησία και ειδικότητα Δυνατότητα μέτρησης χαμηλών συγκεντρώσεων (10ˉ³ - 10ˉ⁶g/L) Αυτοματοποιημένη Σφάλματα μετρήσεων (λιπαιμικός ορός, σκόνη, συγκρίματα πρωτεΐνών). Εφαρμογές Ανοσοσφαιρίνες IgG, IgM, IgA, IgE Υποτάξεις ανοσοσφαιρινών κ και λ αλυσίδες C3, C4, CRP, RF β2 μικροσφαιρίνη Ένταση σκεδ/νου φωτός Συγκέντρωση πρωτεϊνών

29 Χρωματογραφία Ομάδα μεθόδων για το διαχωρισμό των συστατικών ενός μίγματος, που μοιάζουν μεταξύ τους ως προς τις φυσικές και χημικές ιδιότητες, π.χ. πρωτεΐνες, αμινοξέα, σάκχαρα, βιταμίνες, φάρμακα. Μίγματα όπως Βιολογικά υγρά Πλάσμα Ούρα Εκχύλισμα ιστών

30 Χρωματογραφία Αρχή μεθόδου
Ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος στηρίζεται στο διαφορετικό βαθμό αντίδρασής τους με καθεμιά από τις φάσεις. Είναι σύστημα ΔΥΟ ΦΑΣΕΩΝ: σταθερής και κινητής. Το δείγμα διοχετεύεται στην κινητή φάση ή εφαρμόζεται στη σταθερή Η κινητή φάση ρέει κατά μήκος της σταθερής και παρασύρει το δείγμα

31 Χρωματογραφία Χρωματογραφικές μέθοδοι Εφαρμογές HPLC Πηκτής
Ανταλλαγής ιόντων Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) Συγγενείας Εφαρμογές CRP ENA Ανοσοσυμπλέγματα κ.α. HPLC

32 Δεσμευτικές ανοσομέθοδοι
Αρχή μεθόδου Μέθοδοι ΙΑ RIA-IRMA ΕΙΑ (ELISA) (10ˉ⁹ - 10ˉ¹² g/L) CHIA-ΙCHIA IFA Ανταγωνιστικές Μη ανταγωνιστικές Ποιοτικές-Ποσοτικές

33 Ανταγωνιστικές ανοσομέθοδοι (Competitive immunoassay)
Αρχή μεθόδου Ανοσολογικές μέθοδοι όπου η ένταση του αποτελέσματος είναι αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας Σχηματική απεικόνιση ανταγωνιστικής μεθόδου

34 Μη ανταγωνιστικές ανοσομέθοδοι (Ιmmunometric assay)
Αρχή μεθόδου Ανοσολογικές μέθοδοι όπου η ένταση του αποτελέσματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας Σχηματική απεικόνιση μη ανταγωνιστικής μεθόδου

35 Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι Radio-Immuno-Assay (RIA)
Αρχή μεθόδου Ανταγωνιστική τεχνική στην οποία χρησιμοποιούμε ραδιενεργά σημασμένο Ag το οποίο ανταγωνίζεται με το προς μέτρηση Ag για την πρόσδεση σε περιορισμένη ποσότητα του αντίστοιχου Ab

36 Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι Immuno-Radio-Metric-Assay (IRMA)
Αρχή μεθόδου H προς μέτρηση ουσία δεσμεύεται από δύο Ab, ένα ραδιενεργό και ένα μη ραδιενεργό Περισσότερο ευαίσθητη Σχηματική απεικόνιση ΙRMA

37 Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι Εφαρμογές
Αντισώματα έναντι της θυρεοειδικής υπεροξειδάσης (anti-TPO). CRP, RF Συμπλήρωμα Αντιμικροσωμιακά θυροειδούς (anti-M). dsDNA, AMA, Αbs κατά φωσφολιπιδίων (aLP) κ.α. Αντιθυρεοσφαιρινικά αντισώματα (anti-TG).

38 Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (ΕΙΑ) Enzyme-Links-Immuno-Sorment-assay (ELISA)
Αρχή μεθόδου Ανίχνευση της προσδιοριζόμενης ουσίας με τη χρήση δεύτερης, ομοιοπολικά συνδεδεμένης με ένζυμο, που έχει σχέση Ag/Ab Χρωμογόνο υπόστρωμα (άχρωμο) Ένζυμο Προϊόν έγχρωμο Φωτόμετρο Οπτική πυκνότητα έγχρωμου προϊόντος Βαθμονομημένη καμπύλη Συγκέντρωση προσδιοριζόμενης ουσίας

39 Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (ΕΙΑ) ELISA
Η τελική χρωματική ένταση αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας Μέθοδος εκλογής για μικρού ΜΒ ουσίες Σχηματική απεικόνιση ανταγωνιστικής ELISA

40 Ανοσοενζυμικές μέθοδοι ELISA
Μη ανταγωνιστική (μέθοδος Sandwich) Η τελική χρωματική ένταση ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας Μέθοδος εκλογής για ειδικά Ab, αυτοαντισώματα, κυτταροκίνες, ελεύθερ0υς υποδοχείς κ.α. Πιο ευαίσθητη, λιγότερο ειδική από την ανταγωνιστική Σχηματική απεικόνιση μη ανταγωνιστικής ELISA

41 Εφαρμογές ΕLISA Αυτοαντισώματα
Κυτταροκίνες και διαλυτοί υποδοχείς κυτταροκινών ΑΝΑ anti-DNA Anti-ENA Παράγοντες συμπληρώματος AMA ASMA Ειδικά Ab, τάξης ΙgE, (μέθοδος RAST) p-ANCA, c-ANCA anti-GB anti-TG, anti-TPO Μόρια προσκόλλησης, αυξητικοί παράγοντες, προσταγλανδίνες, λευκοτριένια, κυτταροτοξικά αντισώματα κ.α. RF Αντι-CCP Καρδιολιπίνης, φωσφολιπιδίων κ.α.

42 Ραδιε-νεργά από-βλητα Σταθε-ρότητα αντι-δραστη-ρίων
ELISA vs RIA Ειδικό-τητα Ευαι-σθησία Επανα-ληψι-μότη-τα Κόστος Εύκο-λη χρήση Ραδιε-νεργά από-βλητα Σταθε-ρότητα αντι-δραστη-ρίων Φάσμα εφα-ρμογών ELISA ≤ CV<5% > — RIA ≥ < USERIA (x1000 ευαισθησία)

43 Χημειοφωταυγιομετρικές μέθοδοι Chemiluminescence-Immuno-Assay (CHIA)
Αρχή μεθόδου Αντί χρωμογόνων και, φθοριζόντων υποστρωμάτων χρησιμοποιούνται υποστρώματα τα οποία φωταυγάζουν, δηλαδή έχουν την ιδιότητα να μετατρέπουν μέρος της ενέργειας, από μία μεσολαβούσα χημική αντίδραση, σε φωτεινή ακτινοβολία Αλκαλική φωσφατάση Αποφοσφορυλίωση υποστρώματος → ασταθές προϊόν που φωταυγάζει

44 Εφαρμογές Χημειοφωταύγειας
Αντισώματα έναντι εκχυλίσματος πυρηνικών αντιγόνων (anti-ENA). Αντιγλοιαδινικά αντισώματα (DGP-IgG, IgA). Αντισώματα τρανσγλουταμινάσης (anti-tTG-IgA). Αντισώματα έναντι της διπλής έλικας DNA (anti-dsDNA). Αντιθυρεοσφαιρινικά αντισώματα (anti-TG). Αντικαρδιολιπινικά αντισώματα (αCL-IgG, IgM). Αντισώματα έναντι της θυρεοειδικής υπεροξειδάσης (anti-TPO) κ.α. Αντι-β2 γλυκοπρωτ/εϊνικά αντισ/τα (αβ2GPI-IgM, IgG).

45 CHIA VS ELISA - RIA Μεγάλη ευαισθησία
Μετράει φως και ευκολότερα δέχεται παρεμβολές από την ποιότητα του αίματος που αναλύεται (αιμολυμένος ή λιπαιμικός ορός). Μικρό όγκο δείγματος Μικρό χρόνο επώασης Σταθερά αντιδραστήρια Πλήρως αυτοματοποιημένη μέθοδος

46 Ανοσοφθορισμός Immuno-Fluorescence-Assay (IFA)
Αρχή μεθόδου Ανοσοϊστοχημική τεχνική κατά την οποία το ειδικό σύμπλεγμα Ag-Ab γίνεται ορατό με τη βοήθεια Ab σημασμένου με φθοριόχρωμα στο μικροσκόπιο φθορισμού

47 Ανοσοφθορισμός Immuno-Fluorescence-Assay (IFA)
Φθορίζον αντίσωμα Αντιορός έναντι της ανθρωπείου γ-σφαιρίνης ή μεμονωμένων τάξεων ανοσοσφαιρινών, σημασμένων με φθορίζουσα χρωστική

48 Ανοσοφθορισμός Immuno-Fluorescence-Assay (IFA)
Φθορισμός Εκπομπή φωτός μεγαλύτερου μήκους κύματος από μια ουσία όταν αυτή ακτινοβοληθεί με φως μικρότερου μήκους κύματος. Φθοριοχρώματα Ισοθειακυανική φλουορεσκίνη (FITC)-πράσινη Ισοθειοκυανική τετραμεθυλροδαμίνη (TMRITC)-κόκκινο Φυκοερυθρίνη (PE)-πορτοκαλί Αρχή παραγωγής φθοριοχρώματος

49 Ανοσοφθορισμός Immuno-Fluorescence-Assay (IFA)
Μικροσκόπιο με προσπίπτοντα φωτισμό Προσοφθάλμιος Ηθμός φραγμού Δίκοιλο κάτοπτρο αντικειμενικός Διεγερτικός ηθμός παρασκεύασμα

50 Ανοσοφθορισμός Immuno-Fluorescence-Assay (IFA)
Μικροσκόπιο με διερχόμενο φωτισμό Προσοφθάλμιος φακός αντικειμενικός Ηθμός φραγμού πυκνωτής παρασκεύασμα Διεγερτικός ηθμός

51 Μικροσκόπιο φθορισμού

52 Ανοσοφθορισμός Immuno-Fluorescence-Assay (IFA)
Άμεση μέθοδος Έμμεση μέθοδος Αρχή λειτουργίας ανοσοφθορισμού Αντι-Ig Ab σημασμένο Με φθοριό- χρωμα Άμεσος IFA Έμμεσος IFA

53 Ανοσοφθορισμός Immuno-Fluorescence-Assay (IFA)
Χρώση του συμπληρώματος Αρχή λειτουργίας χρώσης του συμπληρώματος Συμπλήρωμα Υπόστρωμα (Ag) Μη σεσημασμένο Ab + Συμπλήρωμα + Σεσημασμένο Ab έναντι του συμπληρώματος Αντι- C3 Ab Φθορίζον σύμπλεγμα

54 Ανοσοφθορισμός Immuno-Fluorescence-Assay (IFA)
Διπλή φθορίζουσα χρώση Δύο αντιοροί + Δύο φθοριοχρώματα Δύο ανοσοσυμπλέγματα Ag-Ab Δύο χρώματα στη μικροσκόπηση

55 Ανοσοφθορισμός Immuno-Fluorescence-Assay (IFA)
Τεχνική της μεθόδου

56 Ανοσοφθορισμός Immuno-Fluorescence-Assay (IFA)
Πλεονεκτήματα Καλή ειδικότητα, ευαισθησία Ευκολία στην εκτέλεση Χαμηλό κόστος Προσδιορισμός της τάξης του αντισώματος που αντιδρά Προσδιορίζεται το αντιγόνο στο σημείο που υπάρχει Μειονεκτήματα Εξειδικευμένο προσωπικό (μικροσκόπηση) Υποκειμενική εκτίμηση του αποτελέσματος Ημιποσοτικός προσδιορισμός Χρονοβόρα τεχνική διαδικασία Ανιχνεύει Ag σε κύτταρα ή μεγάλα μόρια και όχι διαλυτά Ag

57 IFA-Σωστή έκφραση του αποτελέσματος και προτυποποίηση της δοκιμασίας
Αποτέλεσμα -Διαφορετικοί αντιοροί -Διαφορετικά μικροσκόπια Ο τίτλος του ορού, δηλαδή η μεγαλύτερη αραίωση που δίνει θετικό αποτέλεσμα. -Διαφορετική απόδοση του μικροσκοπίου. Η λύση Το πρόβλημα…. Επαναληψιμότητα Πρότυπος ορός WHO (66/ IU/ml όριο θετικότητας 6 IU/ml) Σύγκριση αποτελεσμάτων από εργαστήριο σε εργαστήριο Οπτικές πρότυπες αντικειμενοφόρες πλάκες. -Ποικιλία υποστρωμάτων

58 Ανοσοφθορισμός Immuno-Fluorescence-Assay (IFA)
Εφαρμογές Ανίχνευση αυτοαντισωμάτων Αντιγόνα λεμφοκυττάρων, μακροφάγων,κοκκιοκυττά-ρων, ερυθρών αιμοσφαιρίων (ANA-screening, αντι-dsDNA, ANCA, AMA, ASMA, οργανοειδικά Ab) Συστατικά ομάδων αίματος κ.α. Ανίχνευση ανοσοσφαιρινών και συμπληρώματος (ιστούς)

59 Αυτοαντισώματα που ανιχνεύονται με τον έμμεσο ανοσοφθορισμό
Μη οργανοειδικά αυτοαντισώματα Έναντι του πυρήνα και της πυρηνικής μεμβράνης (ΑΝΑ) Έναντι του κυτταροπλάσματος (ΑΜΑ, RIBA, LKM, ARA, ASMA, MF, IMF) Ab που συνδέονται με κοιλιοκάκη (AGA, EMA) BCLA , G-cyt, έναντι των χολαγγείων (CBA), έναντι της συσκευής Golgi, λυσοσωματίων, κεντριολίων κ.α.

60 Αυτοαντισώματα που ανιχνεύονται με τον έμμεσο ανοσοφθορισμό
Οργανοειδικά αυτοαντισώματα Αντιθυρεοειδικά (TMA) Αντιεπινεφριδικά (CSA) Αντιπαγρεατικά (ICA) Αντιτοιχωματικά (APCA) Έναντι της διαφανούς ζώνης του ωαρίου, σπερματοζωαρίων, αιμοπεταλίων, ερυθροκυττάρων, υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, μελανοκυττάρων κ.α.

61 Μη οργανοειδικά αντισώματα Έναντι του πυρήνα (antinuclear Antibody-ANA)
Είδη υποστρωμάτων Αρχική αραίωση του ορού 1/80 για ΑΝΑ 1/20 για anti-DNA Α) Κύτταρα από καλλιέργειες ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων Σεσημασμένος αντιορός (Conjugate) Hep-2 Πολυδύναμος αντιανθρώπειος ορός κονίκλου συνδεδεμένος με FITC Hela KB Β) Yποστρώματα οργάνων αρουραίου (ήπαρ-νεφρός-στόμαχος) Αποτέλεσμα Γ) Μαστιγοφόρο Crithidia luciliae (αντι-ds DNA) Τίτλος αυτοαντισωμάτων

62 Μη οργανοειδικά αντισώματα Έναντι του πυρήνα (antinuclear Antibody-ANA)
Μορφή φθορισμού Διάχυτος ή ομοιογενείς (diffuse,homogenous) Στικτός ή κοκκιώδης (coarse,fine-speckled) Περιφερικός ή δακτυλιοειδής (rim,shaggy,peripheral) Μεμβρανώδης (membranous) Διακριτός (Λαμπερός) στικτός (discrete speckled) Πυρηνιδίου (nucleolar)

63 ΑΝΑ Αρνητικό για φθορισμό
Hep-2, ΑΝΑ negative

64 ΑΝΑ Διάχυτος ή ομοιογενής φθορισμός
Φθορισμός Αφορά όλο το πυρηνόπλασμα με επίταση σε ορισμένες περιοχές Αντισώματα Έναντι ιστονών και δευτερευόντως έναντι dsDNA, ssDNA και συμπλέγματος DNA με ιστόνες. Συσχέτιση με νόσο Όλα τα αυτοάνοσα νοσήματα Hep-2, homo. nuclear

65 ΑΝΑ- Αντισώματα έναντι της διπλής έλικας του DNA (ds-DNA)
Φθορισμός Κινητοπλάστη του Crithidia luciliae σαν δίσκος ή δακτύλιος εντονότερος του πυρήνα Αντιγόνο ds-DNA Συσχέτιση με νόσο ΣΕΛ Άλλες ρευματοπάθειες (χαμηλός τίτλος) Crithidia Luciliae negative Crithidia Luciliae ds-DNA positive

66 ΑΝΑ-Στικτός ή κοκκιώδης φθορισμός αδρός στικτός (coarse-speckled)
Φθορισμός Μεγάλα κοκκία σαφώς διακρινόμενα μεταξύ τους Αντισώματα Εκχυλιζόμενα πυρηνικά Ag ENA (SSA, SSB, nRNP, Sm, κ.α.) Συσχέτιση με νόσο ΣΕΛ MCTD Συστηματική σκλήρυνση Sjögren´s Syndrome κ.α. Hep-2 , coarse speckled

67 ΑΝΑ-Στικτός ή κοκκιώδης φθορισμός λεπτός στικτός (fine-speckled)
Φθορισμός Μικρά κοκκία με ασαφή όρια Αντισώματα Εκχυλιζόμενα πυρηνικά Ag ENA (Scl-70, Jo-1) Συσχέτιση με νόσο Σκληρόδερμα Πολυμυοσίτιδα/Δερματο-μυοσίτιδα Αρτηριΐτιδα κ.α. Hep-2, fine speckled

68 ANA-Περιφερικός ή δακτυλ/δής φθορισμός (rim,shaggy,peripheral)
Φθορισμός Η περιφέρεια του πυρήνα εμφανίζεται σαν παχύς δακτύλιος δίνοντας την εντύπωση RBC. Αντισώματα dsDNA , σύμπλεγμα dsDNA- ιστονών ή πρωτεΐνες πυρηνικής μεμβράνης Συσχέτιση με νόσο ΣΕΛ Άλλες ρευματοπάθειες (σε χαμηλό τίτλο) Ηep-2, perif. nuclear

69 ΑΝΑ-Μεμβρανώδης φθορισμός (membranous)
Φθορισμός Λεπτός φθορισμός της πυρηνικής μεμβράνης κυττάρων σε φάση ηρεμίας. Αντισώματα Πεπτίδια που βρίσκονται στις Α, Β, C, πρωτεΐνες της πυρηνικής μεμβράνης (lamins) Συσχέτιση με νόσο Νοσήματα ήπατος (πρωτοπαθή χολική κίρρωση) Σκληρόδερμα κ.α. Hep-2, mem. nuclear

70 ΑΝΑ-Διακριτός (Λαμπερός) φθορισμός (Discrete speckled)
Α) Αντικεντρομεριδιακός (centromere specificity) B) Άτυπος λαμπερός ή φθορισμός πολλαπλών κοκκίων / στιγμάτων του πυρήνα (atypical discrete speckled - multiple nuclear dots-MND)

71 ANA -Διακριτός φθορισμός Α) Φθορισμός κεντρομεριδίου
Αντισώματα Φάση ηρεμίας: μικρά κοκκία διάσπαρτα στον πυρήνα. Μη ιστονική πρωτεΐνη στενά συνδεδεμένη με το κεντρομεριδιακό τμήμα του DNA. Πρόφαση: νέφος κοκκίων πάνω στα χρωματοσώματα. Συσχέτιση με νόσο Σύνδρομο CREST (49-96%) Μετάφαση-Ανάφαση: κοκκία με μορφή ραβδίων (bars). Raynaud Σκληρόδερμα κ.α. Hep-2 , cent. nuclear

72 ANA -Διακριτός φθορισμός Α) Φθορισμός κεντρομεριδίου
Hep-2 , cent. nuclear

73 ANA-Διακριτός φθορισμός B) Φθορισμός πολλαπλών πυρ. κοκκίων (MND)
4-20 μικρά ανοσομεγέθη κοκκία. Δεν υπάρχουν σε κύτταρα μίτωσης (δ.δ. από αντικεντρομεριδιακό). Αντισώματα Πρωτεΐνες στα πυρηνικά σωμάτια (nuclear bodies). Συσχέτιση με νόσο Πρωτοπαθή χολική κίρρωση (κυρίως με Secca) Αδιαφοροποίητη κολλαγόνωση (με ή χωρίς πρωτοπαθή χολική κίρρωση). Hep-2, MND

74 ANA - Φθορισμός πυρηνιδίου (noucleolar)
1-4 μεγάλα, χοντρά και ανισομεγέθη κοκκία που δίνουν διάχυτο, στικτό ή περιφερικό φθορισμό σε κύτταρα ηρεμίας. Αντισώματα RNA ή RNA-πολυμεράση Ι των πυρηνίσκων Συσχέτιση με νόσο Σκληρόδερμα Sjogren´s Syndrome ΣΕΛ κ.α. Hep-2, nucl. nuclear Hep-2, nucl. nuclear

75 Ομειογενείς + φθορισμός πυρηνιδίου
Hep-2, homo. nuclear + nucl. nuclear

76 Αντισώματα έναντι του κυτταροπλάσματος
Αντιγονικός στόχος Σεσημασμένος αντιορός Οργανίδια Κυτταροσκελετός Πολυδύναμος αντιανθρώπειος ορός κονίκλου συνδεδεμένος με φθοριόχρωμα. Υπόστρωμα Ιστικές τομές οργάνων Hep-2 Αρχική αραίωση 1:40

77 Αντισώματα έναντι του κυτταροπλάσματος
Αντιμιτοχονδιακά (ΑΜΑ: anti-mitochodrial antibodies) Αντισώματα έναντι των λείων μυϊκών ινών (ASMA: antismooth muscle antibodies) Αντιριβοσωμιακά (RIBA: ribosomal antibodies) Αντισώματα έναντι των μικροϊνιδίων (MF: micro filaments) Αντιμικροσωμιακά (LKM: Liver kidney microsomal antibodies) Αντισώματα έναντι των ενδιάμεσων ινιδίων (IMF: intermedia filaments) Αντισώματα έναντι της ρετικουλίνης (ARA: anti-reticular antibodies)

78 A) Αντιμιτοχονδιακά αντισώματα (Anti-Mitochodrial Antibodies-ΑΜΑ)
Φθορισμός: Λεπτός κοκκιώδης, κυτταροπλασματικός, αποτελούμενος από γραμμοειδής σχηματισμούς (ακτίνες ποδηλάτου). Υπόστρωμα Ήπαρ Νεφρός Στόμαχος αρουραίου. Αντισώματα (Μ1-Μ9) Φθορισμός: Λεπτός, κοκκιώδης, κυτταροπλασματικός, όχι καλά οργανωμένος. Συσχέτιση με νόσο Μ2: ΠΧΚ (95%) Μ4: Μικτές χολοστατικές ηπατοπάθειες με ή χωρίς ΠΧΚ, χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα (25-30%) Hep-2 ΣΕΛ, ΡΑ.

79 A) Αντιμιτοχονδιακά αντισώματα (Anti-Mitochodrial Antibodies-ΑΜΑ)
MSK, Mitochondrial Hep-2, Mitochondrial

80 ΑΜΑ + Μεμβρανώδης φθορισμός του πυρήνα
Hep-2 + MSK, mem. Nuclear + mito.

81 AMA + Φθορισμός του κεντρομεριδίου
Hep-2, AMA + cent. nuclear

82 B) Αντιριβοσωμιακά αντισώματα (RIBosomal Antibodies-RIBA)
Υπόστρωμα Ήπαρ Αντισώματα Νεφρός Τρείς υποομάδες της ριβοσωματικής πρωτεΐνης P (P0,P1,P2) Στόμαχος αρουραίου Φθορισμός: Λεπτός, κοκκιώδης, πυκνός και αρκετά οργανωμένος. Συσχετισμός με νόσους ΣΕΛ (με προσβολή ΚΝΣ, ψύχωση) Hep-2 Φθορισμός: Λιγότερο σαφής, περισσότερο πυκνός από AMA,LKM, δίνει την εντύπωση διάχυτου φθορισμού. ΡΑ Χρόνια ενεργό αυτοάνοση ηπατίτιδα.

83 B) Αντιριβοσωμιακά αντισώματα (RIBosomal Antibodies-RIBA)
HEp-2, Ribosomal MSK, Ribosomal MSK, Ribosomal, 20x Hep-2, Mitochondrial

84 Γ) Αντιμικροσωμιακά αντισώματα (Liver Kidney Microsomal-LKM)
Υπόστρωμα Ήπαρ Αντισώματα Νεφρός Πρωτεΐνη της έσω επιφάνειας των σωληναρίων του λείου ενδοπλασματικού δικτύου. Στόμαχος αρσενικού αρουραίου και άλλων ζώων. Φθορισμός: νεφρικών σωληναρίων και αγκύλης του Henle στη φλοιώδη μοίρα του νεφρού. Συσχετισμός με νόσους LKM1: Χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα LKM2: Ηπατίτιδα από φάρμακα LKM3: Χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα.

85 Γ) Αντιμικροσωμιακά αντισώματα (Liver Kidney Microsomal-LKM)
MSK, LKM Microsomes

86 Δ) Αντισώματα ρετικουλίνης (Anti-Reticular Antibodies-ARA)
Υπόστρωμα Συσχετισμός με νόσους Ήπαρ Rs, R2: Νόσους του συνδετικού ιστού (Crohn, ερπητική δερματίτιδα, σύνδρομο δυσαπορρόφησης), φυσιολογικά άτομα. Νεφρός Στόμαχος αρουραίου Φθορισμός: Λεπτές, σπειροειδείς, διακεκομμένες ή συνεχείς φθορίζουσες ίνες. R1: Κοιλιοκάκη, ερπητική δερματίτιδα, Crohn. Αντισώματα Γλυκοπρωτεΐνη του συνδετικού ιστού

87 Δ) Αντισώματα ρετικουλίνης (Anti-Reticular Antibodies-ARA)
MSK, Reticuline

88 E) Αντισώματα έναντι λείων μυϊκών ινών (Anti-Smooth Muscle Antibodies-ASMA)
Υπόστρωμα Πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού: ακτίνη (SMAT, SMAG), μυοσίνη, τροπομυοσίνη, βιμεντίνη κ.α.(SMA-V). Ήπαρ Νεφρός Συσχετισμός με νόσους Στόμαχος αρουραίου Φθορισμός: Λείες μυϊκές ίνες αγγείων νεφρού, ήπατος, ενδιάμεσα ινίδια και βλεννογόνια μυϊκή στοιβάδα στομάχου. SMAT-G: Χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα, Πρωτοπαθή χολική κίρρωση SMA-V: Χρόνιες ηπατοπάθειες, ιογενείς λοιμώξεις, καρκινοπαθείς κ.α. Αντισώματα

89 E) Αντισώματα έναντι λείων μυϊκών ινών (Anti-Smooth Muscle Antibodies-ASMA)
MSK, smooth muscle MSK, smooth muscle

90 ΣΤ) Αντισώματα έναντι των μικροϊνιδίων (MF) και ενδιάμεσων ινιδίων (IMF)
Υπόστρωμα IMF: Πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού ( βιμεντίνη, δεσμίνη, κερατίνη κ.α Hep-2 Φθορισμός: Κυτταροπλασματικός με γραμμώσεις επιμήκεις και παράλληλες μεταξύ τους (γρατζουνιά γάτας)-MF. Συσχετισμός με νόσους MF: Χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα, πρωτοπαθή χολική κίρρωση. Κυτταροπλασματικός αραχνοειδής με κυματοειδής γραμμώσεις εν ίδει δικτύου-IMF. IMF: Οξεία και χρόνια ηπατίτιδα, πρωτοπαθή χολική κίρρωση, ΡΑ, ιώσεις κ.α. Αντισώματα MF: Ακτίνη

91 ΣΤ) Αντισώματα έναντι των μικροϊνιδίων (MF) και ενδιάμεσων ινιδίων (IMF)
Hep-2, microfilaments Hep-2, microfilament+intermedia filaments

92 Αντισώματα έναντι του κυτταροπλάσματος των ουδετερόφιλων (Antibodies against Neutrofil Cytoplasmic Antigens-ANCA) Υπόστρωμα Αντισώματα Ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα μονιμοποιημένα με αιθανόλη cANCA: Πρωτεϊνάση 3 (PR3) pANCA: Μυελοϋπεροξειδάση (MPO), ελαστάση, λυσοζύμη κ.α. Φθορισμός: cANCA (cytoplasmatic or classical): λεπτός στικτός φθορισμός του κυτταροπλάσματος Συσχετισμός με νόσους cANCA: Κοκκιωμάτωση Wegener (75-90%) pANCA (perinuclear): περιπυρηνικός ή και πυρηνικός φθορισμός. pANCA: Μικροσκοπική πολυαγγειΐτιδα (50-75%), σύνδρομο Churg-Strauss (40-60%), σπειραματονεφρίτιδα κ.α.

93 Αντισώματα έναντι του κυτταροπλάσματος των ουδετερόφιλων (Antibodies against Neutrofil Cytoplasmic Antigens-ANCA) cANCA pANCA

94 cANCA + ANA cANCA + ANA

95 Mη οργανοειδικά αυτοαντισώματα Έναντι των τοιχωματικών κυττάρων του στομάχου (Anti Parietal Cells Antibodies-APCA) Υπόστρωμα Συσχετισμός με νόσους Στόμαχος ανθρώπου, ποντικού ή αρουραίου. Κακοήθη αναιμία (90-95%), δ.δ. από άλλες μεγαλοβλαστικές αναιμίες Φθορισμός: Κυτταροπλασματικός, πυκνός, των τοιχωματικών κυττάρων των γαστρικών αδένων. Ατροφική γαστρίτιδα, γαστρικά έλκη Νόσος του θυρεοειδούς Νόσος του Addison Διαβήτη τύπου 1 Αντισώματα Σιδηροπενική αναιμία Λιποπρωτεΐνη των μικροσωμάτων. Λεύκη Υγιή πληθυσμό- Υπερήλικες (8%)

96 Μη οργανοειδικά αυτοαντισώματα Έναντι των τοιχωματικών κυττάρων του στομάχου (Anti Parietal Cells Antibodies-APCA) MSK, parietal cells MSK, parietal cells

97 Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά
CRP Μέθοδος συγκόλλησης Latex Απλή ακτινωτή ανοσοδιάχυση Ηλεκτροανοσοδιάχυση Ραδιοανοσολογική μέθοδος (RIA) Νεφελομετρία κ.α. RF Μέθοδος συγκόλλησης Latex Ανοσοενζυμική (ELISA) Ραδιοανοσολογική (RIA) Νεφελομετρία κ.α.

98 Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά
Συμπλήρωμα Ραδιοανοσολογική μέθοδος (RIA) Θολωσιμετρία Νεφελομετρία Ανοσοσυμπλέγματα (αδιάλυτα μεγαλομοριακά συμπλέγματα αντιγόνου-αντισώματος που καθιζάνουν στους ιστούς και προκαλούν βλάβες) Χρωματογραφία Ηλεκτροφόρηση Ανοσοενζυμική μέθοδος (ΕLISA) κ.α.

99 Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά
Κρυοσφαιρίνες Ανοσοσφαιρίνες που καθιζάνουν σε χαμηλή θερμοκρασία. Σύνδρομο Sjögren (τύπος ΙΙ) Αυτοάνοσα νοσήματα (τύπος ΙΙΙ) Προσδιορισμός Ποσοτικά: Με κρυοκρίτη α) V ιζήματ0ς/ V ολικό % β) Ολική πρωτείνη ορού προ και μετά την καθίζηση Ποιοτικά: Ανοσοηλεκτροφόρηση Ανοσοκαθήλωση Ανοσοαποτύπωση

100 Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά

101 Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά

102 Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά
dsDNA (ΣΕΛ) IFA (Crithidia lucilliae, ειδική αλλά όχι πολύ ευαίσθητη) RIA υγρής φάσης (μέθοδος αναφοράς) ELISA Ανοσοαποτύπωση Ανοσοκαθήλωση ENA Sm (ΣΕΛ) nRNB (ΜΝΣΙ) SS-A(RO), SS-B (LA) (Sgögren) Scl-70 (σκληρόδερμα) Jo-I (πολυμυοσίτιδα) IFA (ΑΝΑ θετικά + τύπος φθορισμού) ELISA Χρωματογραφία Ανοσοαποτύπωση

103 Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά
ANCA pANCA cANCA (κοκκιωμάτωση Wegener) IFA (περιπυρηνικός ή κυτταροπλασματικός) ΕLISA (anti-MPO ή anti-PR3) AMA (ΠΧΚ) IFA ELISA Ανοσοαποτύπωση RIA

104 Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-Συνοπτικά
Abs κατά φωσφολιπιδίων (aPL) (αντιφοσφωλιπιδικό σύνδρομο,ΣΕΛ) RIA ELISA Δοκιμασίες πήξεως (αντιπηκτικό του λύκου) Συγκολλητινοαντιδράσεις (VDRL)

105 HLA-Συσχέτιση με νοσήματα

106 Τυποποίηση HLA Μικρολεμφοκυτταροτοξική μέθοδος Kύτταρα +
Επώαση Σύμπλεγμα Ag-Ab ??? + Συμπλήρωμα Εωσίνη Θετική αντίδραση Λύση κυττάρων (Μεγάλα, σκοτεινά, μη ακτινοβόλα κύτταρα) Αρνητική αντίδραση Μη λύση κυττάρων (Μικρά, λαμπερά, ακτινοβόλα κύτταρα)

107 Έντυπο συμπλήρωσης αποτελέσματος HLA-ABC

108 Τυποποίηση HLA με μοριακές τεχνικές (Polymerase chain reaction-PCR)
Tεχνική κατά την οποία ένα γονίδιο ή τμήμα του DNA πολλαπλασιάζεται σε εκατομμύρια αντίγραφα. PCR-SSP (SSP=Sequence Specific Primers) PCR-SSOP (SSOP=Sequence Specific Oligonucleotides Probes ) PCR-SBT (Sequencing Based Typing)

109 PCR (polymerase Chain Reaction)
In vitro ενζυματική αντίδραση Ανήκει στις μεθόδους ανίχνευσης του DNA μέσω πολλαπλασιασμού του στόχου Τελικός σκοπός της αντίδρασης είναι ο εκθετικός πολλαπλασιασμός ενός τμήματος DNA που αποτελεί το στόχο της αντίδρασης Εκμεταλλεύεται την in vivo δράση του ενζύμου DNA πολυμεράση που διαβάζει το μονόκλωνο DNA και έχοντάς το ως πρότυπο συνθέτει συμπληρωματική άλυσο DNA παρουσία τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων.

110 PCR-SSP (Specific Sequence Primers)
Tα πολλαπλασιασμένα τμήματα του DNA, διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Tο προϊόν της ηλεκτροφόρησης γίνεται ορατό ύστερα από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία με την προσθήκη χρωστικής Ethidium Bromide και αποτυπώνεται σε φωτογραφικό χαρτί. Με βάση ειδικούς πίνακες ανάγνωσης ή προγράμματα Η/Υ (software) εξάγεται το τελικό αποτέλεσμα Εφαρμογές τυποποίηση HLA τάξης Ι και ΙΙ γονιδίων προσδιορισμός αλληλομόρφων διαφόρων γονιδίων

111 Υβριδισμός-αρχή μεθόδου
Μονές άλυσοι DNA με συμπληρωματική αλληλουχία νουκλεοτιδίων έχουν την τάση να συνδέονται (υβριδίζονται) και να σχηματίζουν δίκλωνο DNA. Στο φαινόμενο αυτό στηρίζεται η ανίχνευση τμημάτων DNA γνωστής αλληλουχίας. Ο υβριδισμός συνήθως συνδυάζεται με PCR για την ανίχνευση γνωστών γονιδίων.

112 PCR-SSOP (Sequence Specific Olygonucleotide Probes)
Ανίχνευση του προϊόντος με υβριδισμό με ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές σημασμένους (oligonucleotide probes)

113 PCR-SBT (Sequencing Based Typing)
Χρησιμοποιούνται: Λίγα dideoxynucleotide Τα dideoxy- μπορούν να συνδεθούν αλλά διακόπτουν την επιμήκυνση της αλύσου Εκκινητής (primer), μονή άλυσος ολιγονουκλεοτιδίων συμπληρωματική του αρχικού τμήματος Μίγμα νουκλεοτιδίων deoxynucleotide

114 PCR-SBT (Sequencing Based Typing)
Πραγματοποιούνται παράλληλα τέσσερις διαφορετικές αντιδράσεις αντιγραφής της αλληλουχίας Προκύπτει ένα μίγμα από σημασμένες αλυσίδες διαφόρων μεγεθών, που τελειώνουν με ένα ddNTP στο 3΄άκρο Κάθε μια περιέχει ένα διαφορετικό ddNTP (αλλά όλα τα dΝΤP), καθένα εκ των οποίων είναι σημασμένο

115 PCR-SBT (Sequencing Based Typing)
Γίνεται ηλεκτροφόρηση και λήψη αποτυπώματος σε φίλμ Ειδικά software, δίδουν σε σύντομο χρονικό διάστημα το αποτέλεσμα Σήμερα χρησιμοποιούνται συστήματα αυτόματης ανάλυσης της άγνωστης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας

116 Κυτταρομετρία ροής (flow cytometry)
Στόχος Ανίχνευση Μέτρηση Αναγνώριση Ταυτοποίηση Διαλογή κυττάρων και άλλων σωματιδίων Σκέδαση Πληροφορική Μονοκλωνικά Αb φθορισμός

117 Κυτταρομετρία ροής (flow cytometry)
Διαγραμματική απεικόνιση κυτταρομετρίας ροής

118 Κυτταρομετρία ροής Εφαρμογές
Τυποποίηση HLA. Η οξεία φάση των αυτοάνοσων νοσημάτων χαρακτηρίζεται κατά κανόνα απο αύξηση της αναλογίας των CD4+ / CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων. Η διαταραχή των Τ-λεμφοκυττάρων παρέρχεται μετά τη χορήγηση κατάλληλης ανοσοκατασταλτικής θεραπείας. Η μείωση των CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων σχετίζεται με την κλινική βαρύτητα της νόσου. Ο CD19+ και ο CD5+ υποπληθυσμός των Β-λεμφοκυττάρων θεωρείται υπεύθυνος για την παραγωγή των αυτοαντισωμάτων .

119 Κυτταρομετρία ροής Εφαρμογές
Κυτταρομετρία ροής Εφαρμογές Ποσοτική κυτταρομετρία Προσδιορισμός συγκέντρωσης διαλυτών ουσιών Απομόνωση και παραλαβή καθαρών κυτταρικών πληθυσμών κ.α.

120 Νέες μέθοδοι ανίχνευσης Aabs
Proteomics technologies Έλεγχος της έκφρασης, λειτουργίας και αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών και γονιδίων στους πάσχοντες ιστούς, στους οποίους άλλα γονίδια ενεργοποιούνται και άλλα αδρανοποιούνται σε σχέση με τους φυσιολογικούς ιστούς. Καταγραφή ενός στιγμιότυπου του κυττάρου σε δεδομένη χρονική στιγμή.

121 Νομίζουμε ότι τα ´χουμε δει όλα ???
Οι εργαστηριακές τεχνικές εξελίσσονται……..

122 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Μ. Μπούρα και συν.: Κλινική Ανοσολογία,2011.
Α. Γερμενής: Ιατρική Ανοσολογία. BIORAD: Image Atlas. Ε. Δίζα-Ματαυτσή: Αυτοαντισώματα και Νοσήματα του συνδετικού ιστού, 1997. Σ.Δ.Ι. Δρυγιαννάκης, Χρ. Ι. Καλλούδη-Αντωνοπούλου: Τα αυτοαντισώματα στην καθ’ημέρα κλινική πράξη, 1992. Γ. Κυριαζής: Ανοσοδιάγνωση. Γενικές αρχές. Σεμινάριο Ανοσολογίας, Ελληνική Εταιρεία Ανοσολογίας, 1997. Αbul K. Abbas, Andrew H. Lichtman: Βασική ανοσολογία, 2004 Μικροβιολογικά χρονικά, 2009. Μ. Παυλάτου: Ανοσολογία, 1997.

123 1. Ποιο από τα παρακάτω δεν ισχύει για τη μη ανταγωνιστική ELISA;
α) Η ένταση του αποτελέσματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας β) Αποτελεί μέθοδο εκλογής για τον προσδιορισμό αυτοαντισωμάτων γ) Το αποτέλεσμα επηρεάζεται από την ποιότητα του αίματος που αναλύεται (λιπαιμικός ή αιμολυμένος ορός) 2. Ποια από τα παρακάτω ισχύουν στη μέθοδο ανοσοαποτύπωσης Western blot; α) Γίνεται ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των πρωτεϊνών με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση β) Η ανίχνευση του αντισώματος μπορεί να γίνει ανοσοενζυμικά γ) Βρίσκει εφαρμογή στην ανίχνευση των SSA/Ro αντισωμάτων δ)Το α και το γ ε) Όλα τα παραπάνω 3. Για την κυτταρομετρία ροής δεν ισχύει: α) Βρίσκει εφαρμογή στην τυποποίηση των HLA β) Συνδυάζει τις αρχές σκέδασης και φθορισμού γ) Στηρίζεται μόνο στην αρχή της σκέδασης δ) Χρησιμεύει στη μελέτη της πορείας των αυτοάνοσων νοσημάτων

124 4) Τι από τα παρακάτω δεν ισχύει:
α) Φθορίζον αντίσωμα στον ανοσοφθορισμό είναι αντιορός έναντι της ανθρωπείου γ-σφαιρίνης σημασμένης με φθοριόχρωμα β) Φθορισμός είναι η εκπομπή φωτός μικρότερου μήκους κύματος από μία ουσία όταν αυτή ακτινοβοληθεί με φως μεγαλύτερου μήκους κύματος γ) Το φθοριόχρωμα που συνήθως χρησιμοποιείται στον ανοσοφθορισμό είναι η ισοκυανική φλουορεσκίνη (FITC) 5) Η παρακάτω εικόνα του ανοσοφθορισμού σχετίζεται με : α) ΑΜΑ β) dsDNA γ) ASMA δ) Κανένα από τα παραπάνω

125 6) Η παρακάτω εικόνα ανοσοφθορισμού σχετίζεται με :
α) APCA β) ΑΜΑ γ) Κεντρομεριδίου δ) Τα α και β ε) Τα β και γ 7) Η παρακάτω εικόνα ανοσοφθορισμού σχετίζεται με : α) Φθορισμό κεντρομεριδίου β) Σύνδρομο CREST γ) Φθορισμό πυρηνιδίου