ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ

Παρουσίαση με θέμα: "ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ
ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ Ι.Κ.ΑΓΓΕΛΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ

2 Αντιγόνο (Antigen): ουσία που συνδέεται ειδικά με ένα μόριο αντισώματος ή με τον επιφανειακό υποδοχέα των δραστικών Τ λεμφοκυττάρων και μπορεί να αποτελέσει στόχο της ανοσολογικής απάντησης Β-κύτταρο + αντιγόνο Τ-κύτταρο + αντιγόνο Εκτελεστικό Β-κύτταρο Β-κύτταρο μνήμης Εκτελεστικό Τ-κύτταρο Τ-κύτταρο μνήμης πλασματοκύτταρο CTL, TH, κλπ (εκκρίνουν κυτταροκίνες & κυτταροτοξικούς παράγοντες) (εκκρίνει αντισώματα)

3 Περιοχές των αντιγόνων που συνδέονται με διαλυτά
ΕΠΙΤΟΠΟΙ Διακριτές περιοχές μακρομορίου = επίτοποι ή αντιγονικοί καθοριστές Π.χ. επίτοπος πρωτεϊνικού αντιγόνου μπορεί να εμπλέκει στοιχεία της α’- β’- γ’- ή και δ’-ταγούς δομής του Β-κύτταρα αναγνωρίζουν διαλυτό αντιγόνο ΕΝΩ Τ κυτταρικοί επίτοποι προέρχονται από ενζυμική πέψη πεπτιδίων και αναγνωρίζονται όταν συνδέονται με μόρια MHC Περιοχές των αντιγόνων που συνδέονται με διαλυτά αντισώματα ή υποδοχείς Β ή Τ λεμφοκυττάρων

4 ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΒΑΣΕΙ ΜΗ ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΩΝ ΔΥΝΑΜΕΩΝ
ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΠΑΙΤΕΙΤΑΙ ΜΕΓΑΛΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ ΚΑΙ ΥΨΗΛΗ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑ ΩΣΤΕ ΝΑ ΕΧΟΥΜΕ ΙΣΧΥΡΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ

5 ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ
Δυναμική των αλληλεπιδράσεων σταθερά σύνδεσης κ σταθερά διάστασης k1 Ag + Ab Ag-Ab k2 k1/k2= σταθερά αλληλεπίδρασης ή συγγένειας Συγγένεια (affinity): ένταση αλληλεπιδράσεων μεταξύ μορίου Ab με έναν επίτοπο του Ag Δυναμικότητα / συνάφεια (avidity): πολλαπλές θέσεις δέσμευσης Ab-Ag =το γινόμενο των τιμών συγγένειας μεμονωμένων θέσεων δέσμευσης Ab-Ag π.χ. IgG (2 δεσμευτικές θέσεις συνάφεια = σταθερά συγγένειας2) <<< λόγω γεωμετρικών φραγμών Η υψηλή συνάφεια μπορεί να αντισταθμίσει τη χαμηλή συγγένεια (αριθμητική παράμετρος) «σύνδεση» προσεγγίζει το επίπεδο σταθερότητας ενός ομοιοπολικού δεσμού λόγω του αριθμού των δεσμών [IgM-πενταμερής μικρή συγγένεια ΑΛΛΑ υψηλή συνάφεια λόγω μεγαλύτερου σθένους]

6 Αλληλεπίδραση αντισώματος-αντιγόνου
(μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις) υπερμτβλ περιοχές αντισώματος ή συμπληρωματικές καθοριστικές περιοχές (complementarity-determining regions, CDRs) ΚΑΙ επίτοπος αντιγόνου μτβλ περιοχή ελαφριάς αλυσίδας μτβλ περιοχή βαριάς αλυσίδας 15-22 αμινοξέα του ag συνδέονται με το ab σύνδεση με δεσμούς Η+, ιοντικές και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, van der Walls (για ισχυρή αλληλεπίδραση απαιτείται μεγάλος αριθμός) Είδη επιτόπων: πολλαπλοί επίτοποι στο ίδιο αντιγόνο ανοσοεπικρατούντες ή κυρίαρχοι μη αλληλοεπικαλυπτόμενοι αλληλοεπικαλυπτόμενοι γραμμικοί ή συνεχείς διαμορφωτικοί κρυπτικοί

7 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ μονοκλωνικά, πολυκλωνικά αντισώματα
ανασυνδυασμένα πεπτίδια Ευχρηστία Αυτοματισμός αυξημένη ευαισθησία αυξημένη ειδικότητα αυξημένη αξιοπιστία σε όλα τα επίπεδα Η ανάπτυξη και η αναβάθμιση του υλικο-τεχνικού εξοπλισμού: - Μηχανικές, ηλεκτρονικές, μεγάλης ακρίβειας αναλώσιμου ρύγχους, (πολυκάναλες ή μη) πιπέτες - Ανοικτά ανοσολογικά συστήματα (robotic pippeting, washer, reader) - Αυτόματα ανοσολογικά συστήματα (combining incubation, washing and reading) Πλήρως αυτοματοποιημένα συστήματα Μεγάλος αριθμός δειγμάτων Ασφάλεια και Ακρίβεια Επαναληψιμότητα και αξιοπιστία Εκτυπώσιμα αποτελέσματα Επεξεργασία αποτελεσμάτων Ηλεκτρονική μεταφορά δεδομένων ΑΝΟΣΟΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ,ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΑΝΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ, ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΟΡΙΩΝ ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΝΤΟΣ

8 ΤΥΠΟΙ ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ
ΤΥΠΟΙ ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ Αντιδράσεις καθίζησης (κατακρήμνισης,precipitation) (ab δισθενές+ag δι-/πολυ-σθενέςπλέγμαίζημα) σε υγρό μέσο σε πήκτωμα αγαρόζης Αντιδράσεις συγκόλλησης (σχηματισμός κροκίδων,agglutination) άμεση έμμεση ή παθητική ανασταλτική Αντιδράσεις με τη χρησιμοποίηση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος RIA ELISA-ELISPOT Western blotting,Ανοσοκατακρήμνιση Ανοσοφθορισμός-Κυτταρομετρία ροής Αντιδράσεις του συμπληρώματος Μέθοδοι προσδιορισμού των HLA αντιγόνων

9 ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ
Δοκιμασία Ευαισθησία (μg Ab/ml) Κατακρήμνιση σε διάλυμα 20-200 Κατακρήμνιση σε πήκτωμα Μancini Ouchterlony 10-50 Ανοσοηλεκτροφόρηση Rocket ηλεκτροφόρηση 2 Αντιδράσεις συγκόλλησης Άμεση Παθητική Ανασταλτική 0.3 RIA ELISA ELISA με χημειοφωταύγεια ~ ~ Ανοσοφθορισμός 1 Κυτταρομετρία ροής

10 ΤΥΠΟΙ ΑΝTIΔΡΑΣΕΩΝ ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗΣ
σε υγρό μέσο σε πήκτωμα απλή ανοσοδιάχυση (προς μία κατεύθυνση) διπλή ανοσοδιάχυση (προς μία κατεύθυνση) διπλή ανοσοδιάχυση (προς δύο κατευθύνσεις-Ouchterlony) κυκλοτερής ή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (Mancini) ανοσοηλεκτροφόρηση-ηλεκτροφόρηση rocket

11 ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΙΖΗΜΑΤΟΣ-ΖΩΝΗ ΙΣΟΔΥΝΑΜΙΑΣ
ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ Mancini Ouchterlony

12 ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ
Mancini Ouchterlony σχμ δακτυλίου σχμ τόξων κατακρήμνισης

13 ΑΝΟΣΟΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ (ηλεκτροφόρηση κ διπλή ανοσοδιάχυση)
Δείγμα ορού ή ούρων τοποθετείται σε μια γέλη αγαρόζης και εφαρμόζεται ηλεκτρικό ρεύμα που διέρχεται μέσω της γέλης, προκαλώντας το διαχωρισμό, σύμφωνα με τα διαφορετικά ηλεκτρικά τους φορτία, όλων των ανοσοσφαιρινών: IgG, IgA, IgM, IgD, και IgE. Κάθε ανοσοσφαιρίνη δημιουργεί μια λωρίδα που έχει μια ορισμένη καμπυλότητα, θέση και ένταση χρώματος. Ανωμαλία σε οποιαδήποτε ανοσοσφαιρίνη μπορεί να προκαλέσει διαταραχές στην αντίστοιχη λωρίδα, όπως π.χ. μπορεί να την παρεκτοπίσει, να την κυρτώσει, να προκαλέσει ελαφρύτερο χρωματισμό, να την κάνει παχύτερη ή και να απουσιάζει εντελώς. Μετά την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών, αντιοροί έναντι των ανοσοσφαιρινών G, Α και Μ και έναντι των κάπα και λάμδα ελαφριών αλυσίδων εφαρμόζονται στο δείγμα των ούρων ή του ορού που ηλεκτροφορήθηκε, για να επιβεβαιωθεί και να προσδιοριστεί μια ύποπτη μονοκλωνική πρωτεΐνη ή η παρουσία των Bence Jones πρωτεϊνών (ελεύθερες κάπα ή λάμδα ελαφριές αλυσίδες).

14 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ πρωτεϊνών
Η ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει την παρουσία μη φυσιολογικών πρωτεϊνών, την απουσία φυσιολογικών πρωτεϊνών καθώς και την παρουσία πρωτεϊνών σε ασυνήθιστα υψηλές ή χαμηλές ποσότητες.Οι μεταβολές στη συνήθη εμφάνιση αυτών των προτύπων μπορεί να βοηθήσουν στη διάγνωση μιας νόσου. Η παρουσία μιας ανωμαλίας σε ένα πρότυπο ηλεκτροφορητικής πρωτεΐνης είναι σπάνια διαγνωστική από μόνη της. Συνήθως αποτελεί απλή ένδειξη. Διενεργούνται περαιτέρω εξετάσεις με βάση την ένδειξη αυτή, στην προσπάθεια να προσδιοριστεί η φύση της υποκείμενης νόσου. Ειδικότερα, μπορεί να βοηθήσει στη διάγνωση μιας ασθένειας ή την παρακολούθηση μιας θεραπείας. Όταν χρησιμοποιείται για διαγνωστικούς σκοπούς, μπορεί η εξέταση να χρησιμοποιηθεί ως αρχική εξέταση για την αξιολόγηση των συμπτωμάτων του ασθενή. Μόλις μια ασθένεια ή πάθηση έχει διαγνωσθεί, η ηλεκτροφόρηση μπορεί να ζητηθεί ανά τακτά χρονικά διαστήματα για την παρακολούθηση της πορείας της νόσου και την αποτελεσματικότητα της θεραπείας. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα όπου μπορεί να ζητηθεί μία δοκιμασία ηλεκτροφόρησης:  Ως συνέχεια σε μη φυσιολογικά ευρήματα άλλων εργαστηριακών εξετάσεων όπως ολικής πρωτεΐνης και/ή επίπεδα αλβουμίνης, αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης στα ούρα, αυξημένα επίπεδα ασβεστίου ή χαμηλά επίπεδα λευκών ή ερυθρών αιμοσφαιρίων. Όταν τα συμπτώματα υποδηλώνουν φλεγμονή, μια αυτοάνοση ασθένεια, μια οξεία ή χρόνια λοίμωξη, μία διαταραχή νεφρού ή  ήπατος, ή μια κατάσταση απώλειας πρωτεϊνών. Όταν ο γιατρός ερευνά συμπτώματα που υποδηλώνουν πολλαπλό μυέλωμα, όπως πόνος στα οστά, αναιμία, κόπωση, ανεξήγητα κατάγματα ή υποτροπιάζουσες λοιμώξεις, θα ελέγξει για την παρουσία μίας χαρακτηριστικής ζώνης (μονοκλωνική ανοσοσφαιρίνη) στην περιοχή βήτα ή γάμμα: Αν φαίνεται μια απότομη οξεία ζώνη, η ταυτότητά της ως μια μονοκλωνική ανοσοσφαιρίνη τυπικά επιβεβαιώνεται με την ηλεκτροφόρηση ανοσοκαθήλωσης. Για να αξιολογείται η αποτελεσματικότητα μιας εφαρμοζόμενης θεραπείας πολλαπλού μυελώματος, εξετάζεται πιθανή μείωση ή και εξάλειψη της μονοκλωνικής ζώνης.

15 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ πρωτεϊνών
Η ηλεκτροφόρηση διαχωρίζει τις πρωτεΐνες με βάση τις φυσικές τους ιδιότητες. Ο ορός τοποθετείται σε ένα ειδικό μέσο και εφαρμόζεται ένα ηλεκτρικό ρεύμα, προκαλώντας τις διάφορες πρωτεΐνες να διαχωριστούν ανάλογα με το ηλεκτρικό τους φορτίο, το μοριακό τους μέγεθος και το σχήμα τους. Η λευκωματίνη (αλβουμίνη) κινείται μακρύτερα, ακολουθούμενη από τις α-σφαιρίνες, τις β- σφαιρίνες και τέλος, τις γ-σφαιρίνες. Οι ομάδες αυτές στη συνέχεια, συγκρίνονται με διάφορα πρότυπα χαρακτηριστικά συγκεκριμένων νόσων. Μια ομοιογενής κορυφή στην περιοχή των γ-σφαιρινών υποδεικνύει μονοκλωνική γαμμαπάθεια. Οι μονοκλωνικές γαμμαπάθειες σχετίζονται με κακοήθεις ή δυνητικά κακοήθεις καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλού μυελώματος, της μακροσφαιριναιμίας του Waldenstrom, λευχαιμιών, νόσων βαριάς αλυσίδας και της αμυλοείδωσης. Όταν βρεθεί κάποια μονοκλωνική γαμμαπάθεια με ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών του ορού, πρέπει να αποκλειστεί το πολλαπλό μυέλωμα από άλλες αιτίες. Αυτό μπορεί να γίνει μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται ανοσοηλεκτροφόρηση ή ανοσοκαθήλωση. Στην ανοσοηλεκτροφόρηση, οι ειδικές πρωτεΐνες που ενδιαφέρουν μπορεί να προσδιοριστούν αφού πρώτα, στερεωθούν μέσα στο πήκτωμα με αντισώματα, και απομακρύνοντας όλες τις άλλες πρωτεΐνες με το πλύσιμο, πριν τη χρώση. Έτσι, ενισχύεται το αποτέλεσμα της Ηλεκτροφόρησης των Πρωτεϊνών του ορού. Τιμές Αναφοράς Αλβουμίνη: 52.0 – 66.5% α1 Σφαιρίνες: 1.2 – 3.8% , α2 Σφαιρίνες: 6.9 – 12.9% β Σφαιρίνες: 9.8 – 14.9% γ Σφαιρίνες: 10.2 – 18.9% ΑΛΒΟΥΜΙΝΗ

16 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ πρωτεϊνών (μη φυσιολογικό πρότυπο)
Πιθανές Ερμηνείες Παθολογικών Τιμών Αυξημένη ολική πρωτεΐνη: Μακροσφαιριναιμία, πολλαπλό μυέλωμα, σαρκοείδωση Αύξηση έντασης ζώνης λευκωματίνης: Οξεία παγκρεατίτιδα. Φάρμακα: Ασπιρίνη, πενικιλίνες. Αύξηση έντασης λευκωματίνης και α1-Σφαιρινών: Αλκοολισμός (χρόνιος) Μείωση έντασης της ζώνης των β-Σφαιρινών: Αυτοάνοσο νόσημα, μεταστατικός καρκίνος, ηπατική νόσος (β1), νόσος των άνοσων συμπλεγμάτων (β2), λευχαιμία (λεμφογενής, μονοκυτταρική, μυελογενής), λέμφωμα, δυσαπορρόφηση, υποσιτισμός (β1), νέφρωση, σκληροδερμία, πείνα, στεατόρροια, συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, ελκώδης κολίτιδα Μείωση έντασης της ζώνης των γ-Σφαιρινών: Οξεία ιογενής ηπατίτιδα (μερικές φορές), αγαμμασφαιριναιμία, σπειραματική απώλεια πρωτεϊνών, υπογαμμασφαιριναιμία, λεμφογενής λευχαιμία, λέμφωμα, νέφρωση, νεφρωσικό σύνδρομο, δυσαπορρόφηση, εντεροπάθεια με απώλεια πρωτεϊνών, σκληροδερμία (μερικές φορές), ελκώδης κολίτιδα. μονοκλωνική γαμμαπάθεια (52%) φυσιολογικό πρότυπο

17 ΑΝΟΣΟΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ (ηλεκτροφόρηση κ διπλή ανοσοδιάχυση)
Μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες αποτελούνται από βαριές και/ ή ελαφρές αλυσίδες ( 5 κατηγορίες βαριών: γ στην IgG, α στην IgA, μ στη IgM, δ στη IgD και ε στην IgΕ). Ελαφριές αλυσίδες κ & λ. Ανοσοηλεκτροφόρηση = ποιοτική μέθοδος [συνδυασμός ηλεκτροφόρησης και ανοσοδιάχυσης] = αντιγονικές πρωτεΐνες διαχωρίζονται ~ φορτίο σε γέλη αγαρόζης, ακολουθεί ταυτοποίηση μέσω ανοσοκατακρήμνισης με αντιορούς (ταυτοποίηση μονοκλωνικής πρωτεΐνης και καθορισμός του τύπου των ελαφριών και βαριών αλυσίδων) ΑΝΟΣΟΑΝΕΠΑΡΚΕΙΕΣ-ΑΝΟΣΟΫΠΕΡΠΛΑΣΤΙΚΕΣ ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ >>ελαφριές αλυσίδες - νεφρική ανεπάρκεια, εναπόθεση ινιδίων αμυλοειδούς κ καταστροφή στα εγγύς σωληνάρια ή στο σπείραμα  ιζηματική νόσος ελαφριών αλυσίδων. Το 90% των ασθενών με πολλαπλούν μυέλωμα εμφανίζουν >> πρωτεΐνη στον ορό ή στα ούρα κατά τη διάγνωση. Τμήματα βαριών αλυσίδων καθώς και ελεύθερες ελαφριές αλυσίδες παρατηρούνται στα ούρα ασθενών με πολλαπλούν μυέλωμα ή αμυλοείδωση. Οι ανοσοσφαιρίνες IgD και IgΕ δε μπορούν να ανιχνευθούν γιατί βρίσκονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις και δε σχηματίζουν ίζημα. ΑΥΣΤΗΡΑ ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΤΕΧΝΙΚΗ διαχωρισμός αντιγόνων, αντιορός στην αύλακα, διάχυση κ’ κατακρήμνιση Είναι απαραίτητος τόσο ο έλεγχος του αίματος όσο και των ούρων, γιατί ορισμένες πρωτεΐνες, όπως οι Bence Jones (ελεύθερες ελαφριές αλυσίδες), μπορεί να μην εμφανίζονται σε σημαντικές ποσότητες στα δείγματα αίματος. Αντιθέτως, οι ακέραιες ανοσοσφαιρίνες μπορεί να μην εμφανίζουν τη μη φυσιολογική πρωτεΐνη στα ούρα. Η ανοσοηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται για τον εντοπισμό του συγκεκριμένου είδους της πρωτεΐνης η οποία παράγεται από τα κακοήθη πλασματοκύτταρα. Η ποσότητα της παραγόμενης πρωτεΐνης μπορεί να διαφέρει κατά την πορεία της νόσου, αλλά ο τύπος της πρωτεΐνης θα παραμείνει ο ίδιος.

18 ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ Ανοσοκαθήλωση = ποιοτική μέθοδος (50 φορές πιο ευαίσθητη vs ανοσοηλεκτροφόρηση). Διαχωρισμός πρωτεϊνών ~ φορτίο σε γέλη αγαρόζης & ταυτοποίησή τους χρησιμοποιώντας ειδικούς μονοδύναμους αντιορούς  επιτυγχάνεται η ταυτοποίηση της μονοκλωνικής πρωτεΐνης και ο καθορισμός του τύπου των ελαφριών και βαριών αλυσίδων. Η μέθοδος αυτή ενδείκνυται ιδιαίτερα σε περιπτώσεις που πρέπει να ανιχνευθούν εξαιρετικά χαμηλές συγκεντρώσεις ανοσοσφαιρινών όπως για παράδειγμα σε μυέλωμα Bence Jones τύπου IgD και IgE, σε αμυλοείδωση, μονήρες πλασμοκύττωμα καθώς και στη διάγνωση υποτροπών μετά από μεταμόσχευση μυελού των οστών. Η ανοσοκαθήλωση είναι ταχύτερη, πιο ευαίσθητη και ευκολότερη στην ερμηνεία από την ανοσοηλεκτροφόρηση. Αντιθέτως, η ανοσοηλεκτροφόρηση είναι ευκολότερη από τεχνικής άποψης και λιγότερο δαπανηρή από την ανοσοκαθήλωση. Η υψηλή αναλυτική ευαισθησία της ανοσοκαθήλωσης έχει ως αποτέλεσμα να ανιχνεύεται υψηλότερο ποσοστό κλινικά ασχέτων ευρημάτων τα οποία μπορεί να οδηγήσουν σε επιπλέον διαγνωστική διερεύνηση. Ανοσοκαθήλωση ορού ασθενούς με μυέλωμα τύπου IgM λ

19 Κλινική Χρησιμότητα Μεταβολές Μακροσφαιριναιμία Waldenstrom
• Επιτρέπει την ανίχνευση ανοσοσφαιρινών που βρίσκονται σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις στον ορό Μεταβολές • Πολλαπλούν μυέλωμα • Μακροσφαιριναιμία του Waldenström • Αμυλοείδωση • Λεμφοϋπερπλαστικές νόσοι

20 ROCKET ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ κωνοειδής ανοσοηλεκτροφόρηση: ποσοτικός προσδιορισμός αντιγόνου (κώνοι κατακρήμνισης) pH  ab ακίνητο + ag φορτίζεται (-) Κωνοειδείς κατακρημνίσεις με ύψος ~ [ag] {ab >>>> ισοηλ. σημείο /// αλκαλικό pH ab-ουδέτερο vs. αg (-) }

21 ΑΝΟΣΟΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΥΡΑΥΛΟΣ
ποσοτικός προσδιορισμός αντιγόνου βάσει πρότυπης καμπύλης

22 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ (σχμ κροκίδων)
ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ (σχμ κροκίδων) ΑΝΤΙΣΩΜΑ ΜΕ ΜΕΓΑΛΥΤΕΡΗ ΙΣΧΥ ΣΥΝΔΕΣΗΣ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΙΣ ΑΠΩΘΗΤΙΚΕΣ ΔΥΝΑΜΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΚΑΤΑΛΛΗΛΗ ΑΝΑΛΟΓΙΑ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΛΥΤΗ Τύποι αντιδράσεων (ευαίσθητες, απλές, οικονομικές) άμεση συγκόλληση (πχ. τυποποίηση ομάδων αίματος, διάγνωση βακτηριακών λοιμώξεων) έμμεση ή παθητική συγκόλληση (για διαλυτά Αg, ερυθροκύτταρα ευαισθητοποιημένα με Αg ή σωματίδια latex, πχ. μέθοδος Coombs) ανασταλτική συγκόλληση (πχ. test εγκυμοσύνης, ένδειξη/ανίχνευση χρήσης απαγορευμένων ουσιών [κοκαΐνης, ηρωίνης] ??? νόμιμα φάρμακα με παρόμοιες χημικές δομέςδιασταυρωτή αντίδραση, αναγκαία επιβεβαίωση με μη ανσ μέθοδο

23 Τυποποίηση ομάδων αίματος ΑΒΟ και RhD

24 ΑΡΧΗ της μεθόδου: η παρουσία ή μη συγκόλλησης
ΑΡΧΗ της μεθόδου: η παρουσία ή μη συγκόλλησης ΘΕΤΙΚΗ αντίδραση: συγκολλημένα κύτταρα σχηματίζουν κόκκινη γραμμή στην επιφάνεια του gel ΑΡΝΗΤΙΚΗ αντίδραση: συμπαγές ίζημα ερυθροκυττάρων στον πυθμένα του μικροσωληναρίου είδος αντισωμάτων ΟΜΑΔΑ ΑΙΜΑΤΟΣ 0 και RhD θετικό ΟΜΑΔΑ ΑΙΜΑΤΟΣ Β και RhD αρνητικό

25 COOMBS Π.χ. αιμολυτική αναιμία Π.χ. μεταγγίσεις

26 ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ ανίχνευση ερυθροποιητίνης [ολυμπιάδα 2004]

27 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΕΠΙΣΗΜΑΣΜΕΝΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ Η΄ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ
Η επισήμανση γίνεται με μόρια που επιτρέπουν την εύκολη ανίχνευση και μέτρησή τους [RIA, ELISA – ELISPOT, ανοσοστύπωμα Western, ανoσοφθορισμός – κυτταρομετρία ροής ] ΜΕΘΟΔΟΣ RIA (radioimmunoassay) Π.χ. ανίχνευση ιού ηπατίτιδας Β ΑΞΙΟΣΗΜΕΙΩΤΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΥΨΗΛΗ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΜΟΣ ΜΕ ΤΟ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΑ ΣΗΜΑΣΜΕΝΟ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΗ ΤΟΥ ΓΙΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΕΝΟ ΠΟΣΟ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ 1960: Rosalyn Yalow, Solomon Aaron Berson (Bronx Veterans Administration Hospital / Mount Sinai School of Medicine) Rosalyn ! Nobel Prize Ιατρικής (RIA ινσουλίνης σε διαβητικούς) Γνωστή ποσότητα αντιγόνου καθίσταται ραδιενεργή (ιώδιο σε κατάλοιπα τυροσίνης) Ακολουθεί ανάμιξη με αντίσωμα ώστε να καλύπτονται ΟΛΕΣ οι θέσεις δέσμευσης του αντιγόνου σύμπλοκο Προστίθεται δείγμα ορού (κρύο αντιγόνο) σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις  ανταγωνισμόςαντικαθιστά το ραδιενεργό Μέτρηση ελεύθερου αντιγόνου στο υπερκείμενο

28 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)-ασφαλέστερη και οικονομικότερη από RIA , ένζυμο αντί ραδιοσήμανση και χρωμογόνο υπόστρωμα με αντίσωμα υψηλότερη αρχική συγκέντρωση αντιγόνου χαμηλότερη απορρόφηση Χημειοφωταύγεια >>>> ευαισθησία

29 ELISPOT ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ WESTERN
Πήκτωμα επιστοίβαξης (ακρυλαμίδη) pH 6.8 συγκέντρωση των πρωτεϊνών σε μια γραμμή εκκίνησης Πήκτωμα διαχωρισμού pH 8.8 διαχωρισμός πρωτεϊνών ανάλογα με το ΜΒ τους και τη δομή τους SDS-PAGE ανίχνευση ενεργοποιημένων κυττάρων και αναγωγή στο σύνολο των κυττάρων που εξετάστηκαν

30 ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN

31 ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και
Φίλτρο νιτροκυτταρίνης όπου έχουν μεταφερθεί οι πρωτεΐνες Ανίχνευση της πρωτεΐνης Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και δέσμευσή του με το αντιγόνο Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και δέσμευσή του με το αντιγόνο Επώαση με το δεύτερο αντίσωμα (συζευγμένο) HRP H2O2 + DAB/luminol +

32 ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ Επιτρέπει την απομόνωση του αντιγόνου
Ευαίσθητη δοκιμασία για ανίχνευση παρουσίας αντιγόνου σε κύτταρα ή ιστό Εκχύλισμα κυττάρων αναμιγνύεται με αντίσωμα--προσθήκη συνθετικών σφαιριδίων-- συλλογή με φυγοκέντρηση ή προσθήκη δευτερογενούς αντισώματος συζευγμένου με μαγνητικά σφαιρίδια Κύτταρο με μγν σφρδ προσκολλημένα στην επιφάνειά του μέσω ab

33 ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ Φθορίζοντα μόρια απορροφούν φως (διέγερση) και εκπέμπουν σε διαφορετικά μήκη κύματος Σύζευξη αντισώματος με φθοριοχρώματα, το εκπεμπόμενο φως γίνεται ορατό με μικροσκόπια φθορισμού (πηγή υπεριώδους)… Φλουορεσκεϊνη, ροδαμίνη, φυκοερυθρίνη κ.α. συνδέονται με το Fc τμήμα του αντισώματος

34 ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ (fluorescence-activated cell sorting)
εναιώρημα ζωντανών κυττάρων + φθορισμο-ενεργοποιούμενος διαλογέας κυττάρων  μέτρηση έντασης φθορισμού & διαχωρισμός κυτταρικών πληθυσμών ~ επιφανειακά αντιγόνα (τυποποίηση λευχαιμιών)

35 ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 1. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ~ ΦΟΡΤΙΟ [ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΗ ΕΣΤΙΑΣΗ] ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ~ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΑΖΑ ΠΕΔΙΟ ΥΨΗΛΗΣ ΤΑΣΗΣ  ΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΣΤΑΘΕΡΗΣ ΚΛΙΣΗΣ pH ΚΑΙ ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΣΤΟ ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΤΟΥΣ ΣΗΜΕΙΟ

36 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ
Κύριος δραστικός συντελεστής του χυμικού κλάδου του ΑΣ

37

38 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ
Προϋποθέσεις: ανιχνεύει Ab στον ορό το σύμπλεγμα Ag-Ab που «καταναλώνει» το συμπλήρωμα δεν είναι ορατό χρειάζεται δείκτης = αιμολυτικό σύστημα Αιμολυτικό σύστημα = ερυθρά αιμοσφαίρια προβάτου (Ag) και ορός ζώου που περιέχει Ab έναντι των ερυθρών αιμοσφαιρίων του προβάτου ΠΡΟΣΟΧΗ: θετική είναι η αντίδραση που δε δίνει αιμόλυση

39 ΑΙΜΟΛΥΤΙΚΟ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ

40 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ HLA ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ
Προϋποθέσεις: Τ λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης Ι) και Β λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης ΙΙ) πολυκλωνικοί ή μονοκλωνικοί αντι-HLA αντιοροί Μέθοδοι που χρησιμοποιούνται: μικρολεμφοκυτταρική δοκιμασία (ορολογική τυποποίηση) μοριακές μέθοδοι (PCR) μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση (MLR) - [In vitro μέθοδος με την οποία εξετάζουμε τη λειτουργική κατάσταση του ανοσοποιητικού συστήματος ελέγχοντας τη δυνατότητά του να απαντά σε αυτόλογα ή ετερόλογα αντιγόνα]

41 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΑ ΜΟΝΤΕΛΑ ΣΕ ΖΩΑ ΜΟΝΤΕΛΑ πρωτοπαθούς ανοσοανεπάρκειας
γυμνό ή αθυμικό ποντίκι (nu/nu)  άτριχα με υποτυπώδη θύμο - ευαίσθητα (αποστειρωμένο φαγητό, νερό, κλωβό, και χρήση φίλτρων αέρα) και δε ζουν πολύ [ανάπτυξη όγκων] – ανεπάρκεια κυτταρομεσολαβητικής ανοσίας ποντίκια SCID (severe combined immunodeficiency disease) διαθέτουν ανώριμα κύτταρα Τ και Β σειρών  αδυναμία προσαρμοστικών ανοσολογικών αποκρίσεων, μηχανισμοί απόρριψης μη λειτουργικοί μεταμοσχεύσεις κυττάρων, οργάνων ανθρώπινης προέλευσης ………………………………………………………………………………………………………………………………….. ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΑΚΑ ΖΩΑ  εισαγωγή επιπλέον γονιδίου vs knock out ζώα  εξάλειψη γονιδίου